一种基于趋化因子富集效应的微流控芯片装置及制备方法
【专利摘要】本发明提出一种基于趋化因子富集效应的微流控芯片装置及制备方法，由PDMS基底层、两对应的微流控芯片模块A和模块B、置于两微流控芯片模块之间的半透膜、顶层盖片和相应进、出样管道组成。微流控芯片模块A用于待处理细胞样本注入及富集分选，模块A中的样品池连接2进样口和2出样口，实现待处理细胞样本的注入和富集于半透膜上的组织干细胞的分选；模块B用于注入趋化因子，借助半透膜在模块A样品池靠近半透膜区域形成趋化效应。注入模块A内部的细胞样本中的多种组织干细胞将在趋化效应下向半透膜运动，并实现与其它细胞的分离，分离后的干细胞和其它细胞样本经不同的出样口收集。
【专利说明】一种基于趋化因子富集效应的微流控芯片装置及制备方法【技术领域】
[0001]本发明涉及干细胞生物学、细胞移植及药物筛选【技术领域】，具体涉及用于干细胞富集分选的微流控装置。【背景技术】
[0002]干细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞；近十余年的研究已经证实多种组织器官内存在成体组织干细胞，它们具有自我更新和定向分化潜能，是组织更新及损伤后再生修复的种子细胞。干细胞的研究对再生医学和一些组织器官退行性疾病的防治具有极为重要的意义，是当前生命科学及医学的热点之一。对不同组织干细胞进行分离纯化培养也成为该领域的基本技术。
[0003]基质细胞衍生趋化因子SDF_1(stromalcell-derived factor-1)与其受体CXCR4(CXC chemokine receptor4)分别属于CXC类趋化因子和CXCR类G蛋白偶联受体超家族，它们在进化过程中高度保守。近十余年来的研究表明，SDF-1除了由骨髓基质细胞、内皮细胞等持续产生外，在多种组织的干细胞微环境特别是一些低氧区域内高表达；其趋化作用由受体CXCR4介导，两者结合后共同启动靶细胞下游信号通路。
[0004]CXCR4最早是作为爱滋病病毒(HIV)感染攻击靶细胞的共受体为人类所认识，其后研究发现它在多种组织干细胞如间充质干细胞(MSC)、造血干细胞(HSC)、表皮干细胞及骨骼肌干细胞等也呈现高表达，趋化因子SDF-1与靶细胞CXCR4受体间快速的相互作用正是多种组织干细胞迁移趋化的重要驱动轴。如研究发现在皮肤组织更新、创伤后创面修复中SDF-1对于表皮干细胞具有很强的趋化作用，CXCR4受体在靠近基底层的细胞表达水平最高，通过诱导信号蛋白PKC-ζ的磷酸化，SDF-1影响表皮干细胞肌动蛋白的极化及其定向迁移。使用SDF-1能促进骨髓间充质干细胞向损伤脊髓等组织的迁徙；在离在体缺氧环境下促进血管内皮细胞增殖和血管形成。
[0005]此外近年研究证实，应用CXCR4拮抗剂AMD3100等能显著增加HSCs自骨髓向外周血的动员(HSC因高表达CXCR4被大量黏附于骨髓微环境)，从而有助于由外周血采集HSC，也进一步支持SDF-1/CXCR4轴在HSCs等迁移趋化中的关键作用。
[0006]离体培养条件下的多种组织干细胞常需要进行纯化分离，同时一类干细胞自身也存在不同功能表型的异质性群体；已有的一些动物移植实验如造血干细胞移植等显示迁移能力越强的干细胞群体，其功能活性及植入后存活越好。因此分选纯化特定的组织干细胞成分、特别是具有良好功能状态的干细胞群体对功能和相关移植实验等具有重要意义。
[0007]目前对不同组织干细胞的检测分选主要是使用以流式细胞仪为代表的手段进行，原理是基于干细胞表达的一些特异蛋白标记分子(抗原)，应用对应的荧光标记抗体进行抗原抗体结合，最终检测分选出表达特异蛋白的特定干细胞成分；此类方法的不足是材料设备相对昂贵且耗时，一种或多种蛋白标记分子反映的仅仅是细胞的表型而非功能状态，同时由于经过抗原抗体结合，对后续的应用包括培养、移植等造成不确定的影响。
[0008]国内外相关专利如下:[0009]CN200480004361.8,2005年，艾菲克特细胞研究所股份有限公司(日本)，金崎士朗
[0010]CN200580025365.9，2005年，克里夫兰诊所基金会(美国)，马克.S.佩恩等
[0011]CN200680007351.9，2008年，埃莫里大学(美国)，H.施;DC.利奥塔等
[0012]CN200810229391.9,2008年，中国科学院大连化学物理研究所，秦建华等
[0013]CN201010252513.3,2010年，清华大学博奥生物有限公司，谢兰等。
【发明内容】
[0014]本发明提供一种基于趋化因子富集效应的离体肝细胞微流控芯片装置，是一种基于干细胞功能特性(特异性趋化)的组织干细胞富集分选平台。其通过在芯片上集成合适尺寸的微流控装置，样品(细胞)池及相连通道中的干细胞成分能对半透膜分隔的液体池中的特定趋化因子发生趋化迁移作用，从而在一定空间距离实现对混合样本中特定组织干细胞的有效富集和分离。与经典流式细胞仪抗原抗体结合的分选原理不同，本微流控体系可实现基于干细胞功能即迁移趋化能力的分选。
[0015]本发明的具体技术方案如下:
[0016]一种基于趋化因子富集效应的微流控芯片装置，它包括:
[0017]—基底层。
[0018]—微流控芯片模块A,位于基底层之上,微流控芯片模块A上微加工形成有样品池、混合细胞样本进样通道和进样口、压力流控制进样通道和进样口、混合细胞样本出样通道和出样口以及造血干细胞出样通道和出样口，上述各进样口和出样口分别通过各自的进样或出样通道与样品池连通，所述样品池设计在微流控芯片模块A的中部靠一边位置，其靠边的一侧面开敞，通至模块A边缘`。
[0019]一微流控芯片模块B，位于基底层之上，与微流控芯片模块A并排相对，微流控芯片模块B微加工形成有趋化因子储样池、趋化因子缓冲液进样通道和进样口、趋化因子缓冲液出样通道和出样口 ；上述各进样口和出样口分别通过各自的进样或出样通道与趋化因子储样池连通，所述趋化因子储样池设计在微流控芯片模块B的中部靠一边位置，其靠边的一侧面开敞，通至模块B边缘；所述微流控芯片模块A的样品池与微流控芯片模块B的趋化因子储样池位置正对并相邻，趋化因子储样池的长度小于对应的样品池的长度。
[0020]一半透膜，被夹于微流控芯片模块A和B之间，隔开样品池和趋化因子储样池，形成两池之间的隔膜，半透膜下端与基底层连接并密封。
[0021 ] 一顶层盖片，盖于微流控芯片模块A和B之上，其上开有与模块A和模块B上进样和出样口对应的进样和出样孔，并装有进样和出样管，所述半透膜上端与顶层盖片连接并密封。
[0022]所述基底层、微流控芯片模块A和B、顶层盖片之间的组装采用对位与键合工艺。
[0023]操作中首先在微流控芯片模块B的趋化因子储样池内注入趋化因子SDF-1，然后向细胞样品池加入填充用无细胞缓冲液，其后再注入待分选混合细胞样本，为保证干细胞群体在半透膜样品池一侧充分富集，除合适的SDF-1浓度(根据文献报道为10~50ng/ml)外，采用合适压力以使单个细胞流经Icm长度储样池的时间不短于I分钟，最终使绝大部分HSC成分紧邻半透膜趋化富集，并经最下游的出样通道收集。
[0024]本发明提出的干细胞分选用微流控系统在原理上是基于干细胞的运动趋化特性，不同于传统流式细胞仪抗原抗体结合的分选原理。设计上，细胞池及流动管道和液体池之间使用合适半透膜分隔，通过应用特定趋化因子可实现对混合细胞样本中多种组织干细胞成分的趋化吸引及分选，含趋化因子液体可多次重复使用，细胞收集池收集的活性干细胞群体可进一步用于免疫染色验证、培养及在体移植等研究。因此，本装置不仅简易高效，能用于多种混合细胞群体中干细胞的分选，获取高功能活性的干细胞成分；同时芯片本身可重复使用，结合适当的清洁消毒手段，能满足培养条件下的无菌要求，可广泛用于干细胞生物学、细胞移植及药物筛选等研究领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1是本装置的外形示意图；
[0026]图2是本装置的结构组装示意图；
[0027]图3是微流控芯片模块A的结构示意图；
[0028]图4是微流控芯片模块B的结构示意图。
【具体实施方式】
[0029]以下结合附图详细说明本发明的结构:
[0030]参见图1和图2，本装置在构成上，为了便于半透膜4的放置，微流控芯片以PDMS(聚二甲基硅氧烷polydimethylsiloxane)为基底层1，分别由微流控芯片模块A2和B3两个模块构成，模块A2具有样品池14、混合细胞样本进样通道11和进样口 10、压力流控制进样通道16和进样口 15、混合细胞样本出样通道13和出样口 12以及造血干细胞出样通道17和出样口 18。模块B3具有趋化因子储样池21、趋化因子缓冲液进样通道20和进样口 19、趋化因子缓冲液出样通道22和出样口 23，主要用于注入趋化因子，在A、B两模块微加工完成后进行组装，在样品池和趋化因子储样池之间置入半透膜4，使用PDMS使其封固键合并加顶层盖片5，基底层和顶层盖片上均设置有与半透膜长度匹配，宽度为0.2mm的矩形孔，半透膜的下端和上端分别置入其中，并密封固定。以上微流控芯片模块A和微流控芯片模块B都采用厚度为2~5mm的PDMS材料，基底层和顶层盖片为厚度为3~5mm的PDMS材料。
[0031]为了实现混合细胞样本中造血干细胞的分选，依据HSC在趋化因子作用下的趋化迁移速度(每分钟数十微米)，与半透膜4相对的趋化因子储样池21长度设计在0.5~lcm，样品池14对应长度更长以保证样品液体流稳定及干细胞分离，细胞样本进出通道宽200 μ m,深50 μ m,能满足机体各种混合细胞群体的注入和流动，并在一定流动时间内(分钟)实现HSC向半透膜的趋化靠近。
[0032]具体如图3和图4所示，微流控芯片模块A的样品池14的水平面方向上形状近似为梯形，长边长度为I~3cm,短边长度为0.5~2cm,宽度(长边至短边的距离)为2~5mm,该长边即为通至模块A边缘的开敞侧面。其进样口 10、15和出样口 12、18的直径为1_，出样通道13、17和进样通道11、16的宽度为200 μ m，深度为50 μ m。
[0033]微流控芯片模块B的趋化因子储样池21的水平面方向上形状也为梯形，长边长度为0.5~Icm,短边长度为0.2~0.6cm,宽度(长边至短边的距离)为100~300 μ m,所述长边即为所述通至模块B边缘的开敞侧面。其进样口 19和出样口 23的直径为400 μ m，出样通道22和进样通道20的宽度为100 μ m,深度为50 μ m。
[0034]用于构建形成趋化因子浓度梯度的半透膜4选用截留分子量大于8KD的纤维素透析膜，如采用商品化的再生纤维素膜，这是一种不带电荷的均质膜，膜孔径小于I μ m，根据SDF-1的分子量大小(8KD)，选用分子截留量为大于8KD的半透膜(MWC08000，上海源叶生物科技有限公司等)，这样既能在靠近半透膜的样品池一侧形成趋化因子SDF-1浓度梯度，又能防止其过快流失。
[0035]实施例1:
[0036]参见图1、图2，一种基于趋化因子富集效应的微流控芯片装置由PDMS基底层1、两左右对应布置的微流控芯片模块A2和模块B3、置于两微流控芯片模块之间的半透膜4、顶层盖片5和相应进、出样管道6组成。
[0037]各功能部件和模块及组装过程如下:
[0038]1、将半透膜4下端置入PDMS基底层I的矩形孔7中，并使用PDMS从底部固定半透膜4和封堵半透膜和矩形孔7间的缝隙，避免储样池14中的细胞流到另一侧储样池21，或储样池21中趋化因子的快速扩散。
[0039]2、将固定好半透膜4的PDMS基底层I和模块A2、模块B3、PDMS顶层盖片5采用等离子处理待用。
[0040]3、将模块A2和模块B3紧临半透膜4置于PDMS基底层I上，模块B3的储样池正对模块A2的样品池的中间，并从两端挤压模块A2和模块B3，使两模块紧密接触，使半透膜
4、模块A2、模块B3以及PDMS基底层 I相互间紧密键合，并利用PDMS固定。
[0041]4、将PDMS顶层盖片5置入模块A2和模块B3上，半透膜4上端需通过盖片5的矩形孔8穿过，并用PDMS固封，避免储样池14中的细胞流到另一侧储样池21，或储样池21中趋化因子的快速扩散。同时，PDMS顶层盖片5上进样/出样孔9与模块A2和模块B3上进样/出样孔15、10、19/12、18、23 —一对应，使各模块之间紧密键合。
[0042]5、将进样、出样管道6置入PDMS盖片5上进样和出样孔9中，使用PDMS固封进样、出样管道6与进样和出样孔9之间缝隙。
[0043]样品筛选过程如下:
[0044]从进样口 19中注入趋化因子缓冲液，经进样通道20进入趋化因子缓冲液储样池21，并流动力作用下经出样通道22和出样口 23流出，可借助外围管道形成连续回路。由于半透膜4两侧趋化因子浓度的差异，趋化因子会由高浓度(储样池21)—侧向低浓度一侧(储样池14)扩散，进而形成浓度梯度。同时，从进样口 10中，使用微量泵注入混合细胞悬浮液，从进样口 15注入缓冲液，；当细胞悬浮液经混合细胞进样通道11进入混合细胞储样池14与经进样通道15进入的缓冲液混合，由于层流作用的影响，细胞将主要在靠近进样口10 一侧(远离半透膜4)流动；在趋化因子所形成的浓度梯度的影响下，特定组织干细胞将在趋化效应作用下向半透膜4方向(高趋化因子浓度区域)运动，进而在靠近半透膜4区域形成组织干细胞富集区；富集的细胞在从进样口 15注入的缓冲液的带动下，从干细胞出样通道17流出，并在干细胞出样口 18收集；混合细胞储样池14内其余细胞从出样通道13流出，在出样口 12收集，从而达到利用趋化效应分离富集组织干细胞的目的。
【权利要求】
1.一种基于趋化因子富集效应的微流控芯片装置，其特征在于它包括: 一基底层； 一微流控芯片模块A，位于基底层之上，微流控芯片模块A上微加工形成样品池、混合细胞样本进样通道和进样口、压力流控制进样通道和进样口、混合细胞样本出样通道和出样口以及造血干细胞出样通道和出样口，上述各进样口和出样口分别通过各自的进样或出样通道与样品池连通，所述样品池设计在微流控芯片模块A的中部靠一边位置，其靠边的一侧面开敞，通至模块A边缘； 一微流控芯片模块B，位于基底层之上，与微流控芯片模块A并排相对，微流控芯片模块B微加工形成有趋化因子储样池、趋化因子缓冲液进样通道和进样口、趋化因子缓冲液出样通道和出样口；上述各进样口和出样口分别通过各自的进样或出样通道与趋化因子储样池连通，所述趋化因子储样池设计在微流控芯片模块B的中部靠一边位置，其靠边的一侧面开敞，通至模块B边缘；所述微流控芯片模块A的样品池与微流控芯片模块B的趋化因子储样池位置正对并相邻，趋化因子储样池的长度小于对应的样品池的长度； 一半透膜，被夹于微流控芯片模块A和B之间，隔开样品池和趋化因子储样池，形成两池之间的隔膜，半透膜下端与基底层连接并密封； 一顶层盖片，盖于微流控芯片模块A和B之上，其上开有与模块A和模块B上进样和出样口对应的进样和出样孔，并装有进样和出样管，所述半透膜上端与顶层盖片连接并密封； 所述基底层、微流控芯片模块A和B、顶层盖片之间的组装采用对位与键合工艺。
2.根据权利要求1所述的基于趋化因子富集效应的微流控芯片装置，其特征在于:所述半透膜选用截留分子量大于8KD的纤维素透析膜。
3.根据权利要求1或2所述的基于趋化因子富集效应的微流控芯片装置，其特征在于:所述微流控芯片模块A和微流控芯片模块B都采用厚度为2~5_的PDMS材料。
4.根据权利要求1或2所述的基于趋化因子富集效应的微流控芯片装置，其特征在于:基底层和顶层盖片为厚度为3~5mm的PDMS材料。
5.根据权利要求3所述的基于趋化因子富集效应的微流控芯片装置，其特征在于:所述微流控芯片模块A的进样口和出样口的直径为1_，出样和进样通道的宽度为200 μ m，深度为50 μ m ;微流控芯片模块B的进样口和出样口的直径为400 μ m,出样和进样通道的宽度为100 μ m,深度为50 μ m。
6.根据权利要求3所述的基于趋化因子富集效应的微流控芯片装置，其特征在于:所述微流控芯片模块A的样品池的水平面方向上形状近似为梯形，长边长度为I~3cm，短边长度为0.5~2cm，宽度(长边至短边的距离)为2~5mm，所述长边即为所述通至模块A边缘的开敞侧面；所述微流控芯片模块B的趋化因子储样池的水平面方向上形状也为梯形，长边长度为0.5~Icm,短边长度为0.2~0.6cm,宽度(长边至短边的距离)为100~300 μ m,所述长边即为所述通至模块B边缘的开敞侧面。
7.根据权利要求4所述的基于趋化因子富集效应的微流控芯片装置，其特征在于:所述基底层和顶层盖片上设置有与半透膜长度匹配，宽度为0.2mm的矩形孔，半透膜的下端和上端分别置入其中，并密封固定。
8.权利要求1-7之任一项所述的微流控芯片装置的制备方法，其特征在于:装置的组装采用对位与键合工艺，制备过程如下: A.将半透膜下端置入PDMS基底层的矩形孔中，并使用PDMS从底部固定半透膜和封堵半透膜和矩形孔间的缝隙，避免两池的缓冲液漏液以及相互间的缓冲液交换； B.将固定好半透膜的PDMS基底层和模块A、模块B、PDMS顶层盖片采用等离子处理待用； C. 将模块A和模块B紧临半透膜放置到PDMS基底上，模块B的储样池正对模块A的样品池的中间，从两端挤压模块A和模块B，使两模块紧密接触，使模块A、模块B以及PDMS基层相互间紧密键合，并利用PDMS固定； D.将TOMS顶层盖片放置到模块A和模块B上，半透膜上端穿过顶层盖片的矩形孔，并用PDMS固封，避免两池的缓冲液漏液以及相互间的缓冲液交换，使PDMS顶层盖片上进样和出样孔与模块A和模块B上进样和出样孔一一对应，使各模块之间紧密键合； E.将进样和出样管道置入PDMS顶层盖片上进样和出样孔中，使用PDMS固封进样和出样管道。
【文档编号】C12M1/00GK103571738SQ201310274879
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年7月2日 优先权日:2013年7月2日
【发明者】杨忠, 刘涛, 张晓丽, 司维柯, 胡宁, 杨军 申请人:中国人民解放军第三军医大学