一种利用甘草次酸发酵废液制备葡萄糖醛酸内酯的方法
【专利摘要】本发明提供了一种利用甘草次酸发酵废液制备葡萄糖醛酸内酯的方法：将含高活性β-葡萄糖醛酸苷酶的菌种培养物，接种到含有甘草酸盐的发酵培养基中进行发酵，获得甘草次酸沉淀的同时，发酵液中的葡萄糖醛酸用离子交换树脂回收，再内酯化制备得到葡萄糖醛酸内酯。本发明的有益效果主要体现在：(1)实现了发酵甘草酸的综合利用，在得到甘草次酸的同时，得到副产物葡萄糖醛酸内酯；(2)该制备葡萄糖醛酸内酯的工艺，能耗低，不适用污染环境的强氧化剂；(3)工艺步骤简单，没有副产物，省去脱色的工艺，产品质量好。
【专利说明】一种利用甘草次酸发酵废液制备葡萄糖醛酸内酯的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用甘草次酸发酵废液制备葡萄糖醛酸内酯的方法，属于医药化工领域范畴。
【背景技术】
[0002]葡萄糖醛酸内酯，简称葡醛内酯，制剂名为肝泰乐(俗称肝通)，其化学成分为:D_(+)_呋喃葡萄糖醛酸Y-内酯[3]，分子式为C6H806。其作用机理是在体内酶的作用下变为葡萄糖醛酸，以葡萄糖醛酸盐或配合物的形式存在的葡萄糖醛酸能与含有羟基、羧基、巯基等有毒物质结合，形成无毒或低毒的葡糖醛酸结合物而由尿排出，起到保护肝脏及解毒作用，因此可作为一种肝脏解毒剂和免疫功能调节剂，是常规的保肝护肝良药。除在医药领域的应用外，葡醛内酯及其后续产品还是功能性饮料和食品、减肥药、化妆品等的主要添加齐U，具有补充体能、改善缺氧、滋养肌肤、延缓衰老的功效，其市场需求量已经远远超过在医药领域的需求。
[0003]现行工业生产方法主要是以淀粉、海藻糖或者葡萄糖为原料，化学氧化法氧化为葡萄糖醛酸，再经过内酯化获得葡萄糖醛酸内酯。以目前普遍采用的硝酸氧化淀粉制备葡醛酸及其内酯的生产工艺为例，其生产流程为淀粉经硝酸氧化、加压水解，在酸性条件下将葡醛酸水溶液内酯化。酯化液经结晶脱水即得粗品，然后再经溶解、脱色、过滤、结晶，烘干后得到葡醛内酯成品。该工艺反应体系比较复杂，氧化选择性差，副反应多、氧化程度无法有效控制，产物分离困难，产品收率10%左右，但试剂和能耗成本高，生产一吨葡萄糖醛酸，就需要20吨浓硝酸，环境污染严重。
[0004]近几年来，人们研究在糖类化合物的催化氧化技术中，通过负载贵金属钼催化剂对其伯羟基进行催化氧化具有较高的活性和选择性，但使用钼成本昂贵，又需要添加钯等重金属助剂，这些改进都无法从根本上解决葡萄糖醛酸内酯制备中存在的不足，也无法真正解决生产过程中由于无机氧化剂的使用和重金属作为催化剂所造成的对环境的严重污染。随着对葡萄糖醛酸内酯市场需求的不断扩大，必然进一步加剧环境污染。我们提供一种清洁环保的获得葡萄糖醛酸内酯的方法，该方法是利用甘草次酸发酵废液制备葡萄糖醛酸内酯，其原理是甘草酸含有两个葡萄糖醛酸基，占分子量的48%。利用微生物β-葡萄糖醛酸苷酶水解，去掉甘草酸的两个葡萄糖醛酸基，沉淀生成甘草次酸，剩余发酵液中含有大量葡萄糖醛酸，通过回收发酵废液中的葡萄糖醛酸，再内酯化获得葡萄糖醛酸内酯。制备过程无需强酸强碱，酶催化反应调节温和，纯化工艺简单，成本低，而且没有环境污染。此制备方法制备得到的葡萄糖醛酸内酯，不会产生环境污染，而且实现了发酵制备甘草次酸的综合利用。总之，利用甘草次酸发酵废液制备葡萄糖醛酸内酯的方法具有非常现实的意义，该制备方法目前国内未见相关报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了提供一种制备葡萄糖醛酸内酯的新方法，该方法可以在一定程度上替代传统制备葡萄糖醛酸内酯的工艺，减轻资源消耗和环境污染，同时与传统方法相比，工艺简单，成本更低，而且实现了甘草酸发酵的综合利用。
[0006]为实现以上目的，本发明以微生物酶催化甘草酸，沉淀甘草次酸后，回收发酵液中的葡萄糖醛酸，再内酯化获得葡萄糖醛酸内酯，包括以下步骤下:
[0007](I)制备含高活性β -葡萄糖醛酸苷酶的菌种培养物:可以是液体种子培养物，也可以是固体斜面培养物:以固体斜面培为例，将含有高活性β葡萄糖醛酸苷酶的菌种接种到PDA斜面培养基，于30°C恒温培养5天；
[0008](2)发酵转化:将新鲜菌种培养物接种到含甘草酸底物的发酵培养基中，控制温度25°C?37°C，溶氧量为15% -20%，搅拌转速200?220rpm/min条件下，发酵4?6天至甘草酸底物转化完全；
[0009](3)过滤去除菌体和甘草次酸沉淀的发酵液流过预先处理过的OH型弱碱性阴离子交换树脂，流速为2?3BV/h交换吸附葡萄糖醛酸；用浓度为0.5?I %的氨水洗脱获得葡萄糖醛酸。
[0010](4)向洗脱液加入无水乙醇在50°C?60°C减压浓缩至无可见水蒸馏出，获得浓缩物；
[0011](5)向浓缩物中加入质量分数为40%的冰醋酸和3%的醋酸酐。温度保持在55°C?60°C进行内酯化反应2h ;加入无水乙醇，析出葡萄糖醛酸内酯粗品；
[0012](6)葡萄糖醛酸内酯粗品加入重量比为1: 4的80% (V/V)的乙醇水溶液重结晶。无水乙醇洗涤结晶，获得葡萄糖醛酸内酯精品，按中国药典(05版)方法检测，含量为99%?102%。
[0013](7)本发明步骤(I)中微生物菌株可以是野生型的，或者是遗传性状改变了的，例如一种重组微生物或微生物的一种突变体。该菌株能表达高活性的高活性β葡萄糖醛酸苷酶，能水解甘草酸产生一分子甘草次酸和两分子葡萄糖醛酸，所述微生物选自曲霉属、糖酵母属、接合糖酵母属、毕赤氏酵母属、克鲁维氏酵母属、假丝酵母属、汉逊氏酵母属、德巴利氏酵母属、毛霉属、球拟酵母属、甲基细菌属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属和假单胞菌属的成员；斜面培养基优选PDA培养基；
[0014](8)本发明步骤(I)中发酵培养基中的甘草酸底物可以是甘草酸铵盐，甘草酸钾盐和甘草酸钠盐几种的一种或多种的混合物，发酵培养基成分还包括一定浓度的无机盐和一定浓度的氮源，其他碳源为非必须成分，发酵培养基优选为:
[0015]2 ?4%甘草酸单铵盐，0.1 ?0.5%尿素 3，0.01 ?0.05% KH2PO4,0.01 ?0.025%MgSO4,121°C灭菌15min后冷却到室温。
[0016](9)本发明步骤(3)中过滤后含有菌体和甘草次酸沉淀的滤饼用乙醇提取甘草次酸，稀醇反复结晶获得符合药典要求的HPLC含量为97%甘草次酸成品。滤液中的葡萄醛酸为综合利用的副产物。
[0017](10)本发明步骤(3)弱碱性阴离子交换树脂包括D301型、D318型、D311型、D941型、D345型，优选D301型；
[0018]与现有技术比，本发明利用甘草次酸发酵废液制备葡萄糖醛酸内酯方法的优点如下:
[0019]1.葡萄糖醛酸是发酵制备甘草次酸的副产物，内酯化制备葡萄糖醛酸内酯实现了发酵甘草酸的的综合利用，能耗低，不适用污染环境的强氧化剂。
[0020]2.该方法的工艺步骤简单，没有副产物，省去脱色的工艺，产品质量好。
【具体实施方式】
[0021]下面结合具体实施例对本发明进一步描述，但本发明要求保护保护的范围绝不局限于下列实施方式。
[0022]实施例一:
[0023]配发酵培养基:3 %甘草酸单铵盐，0.2 %尿素，0.025 % KH2PO4,0.01 % MgSO4,121°C灭菌15min后冷却到室温；取含有高活性β葡萄糖醛酸苷酶转化菌株的新鲜PDA斜面，用接种勺接种发酵培养基；制温度28°C，搅拌5天至底物转化完全；发酵液过滤去除菌体和甘草次酸沉淀；过滤后的发酵液流过预先处理过的OH型D311弱碱性阴离子交换树脂，流速为2BV/h交换吸附葡萄糖醛酸；用0.5%的氨水洗脱获得葡萄糖醛酸；向洗脱液加入无水乙醇在50°C?60°C减压浓缩至无可见水蒸馏出；向浓缩物中加入质量分数为40%的冰醋酸和3%的醋酸酐。温度保持在55°C?60°C进行内酯化反应2h ;加入无水乙醇，析出葡萄糖醛酸内酯，过滤后获得粗品。葡萄糖醛酸内酯粗品加入重量比为1: 4的80% (V/V)的乙醇水溶液重结晶。无水乙醇洗涤结晶，获得葡萄糖醛酸内酯精品，含量为99.5%。
[0024]实施例二:
[0025]配发酵培养基:2%甘草酸单铵盐，0.2%淀粉，0.4%尿素3，0.05% KH2PO4,0.02%MgS04，121°C灭菌15min后冷却到室温；取含有高活性β葡萄糖醛酸苷酶转化菌株的新鲜PDA斜面，用接种勺接种发酵培养基；制温度30°C，搅拌4天至底物转化完全；发酵液过滤去除菌体和甘草次酸沉淀；过滤后的发酵液流过预先处理过的OH型D301弱碱性阴离子交换树脂，流速为2BV/h交换吸附葡萄糖醛酸；用0.8%的氨水洗脱获得葡萄糖醛酸；向洗脱液加入无水乙醇在50°C?60°C减压浓缩至无可见水蒸馏出；向浓缩物中加入质量分数为40%的冰醋酸和3%的醋酸酐。温度保持在55°C?60°C进行内酯化反应2h ;加入无水乙醇，析出葡萄糖醛酸内酯，过滤后获得粗品。葡萄糖醛酸内酯粗品加入重量比为1: 4的80% (V/V)的乙醇水溶液重结晶。无水乙醇洗涤结晶，获得葡萄糖醛酸内酯精品，含量为101.0%。
[0026]实施例三:
[0027]配发酵培养基:4%甘草酸单铵盐，0.4% NaN03，0.05% KH2PO4,0.02% MgSO4,121°C灭菌15min后冷却到室温；取含有高活性β葡萄糖醛酸苷酶转化菌株的新鲜PDA斜面，用接种勺接种发酵培养基；制温度28°C，搅拌6天至底物转化完全；发酵液过滤去除菌体和甘草次酸沉淀；过滤后的发酵液流过预先处理过的OH型D301弱碱性阴离子交换树脂，流速为3BV/h交换吸附葡萄糖醛酸；用0.8%的氨水洗脱获得葡萄糖醛酸；向洗脱液加入无水乙醇在50°C?60°C减压浓缩至无可见水蒸馏出；向浓缩物中加入质量分数为40%的冰醋酸和3%的醋酸酐。温度保持在55°C?60°C进行内酯化反应2h ;加入无水乙醇，析出葡萄糖醛酸内酯，过滤后获得粗品。葡萄糖醛酸内酯粗品加入重量比为1: 4的80% (V/V)的乙醇水溶液重结晶。无水乙醇洗涤结晶，获得葡萄糖醛酸内酯精品，含量为100.5%。
【权利要求】
1.一种利用甘草次酸发酵废液制备葡萄糖醛酸内酯的方法，其特征在于所述方法是将含高活性β-葡萄糖醛酸苷酶的菌种培养物，接种到含有甘草酸盐的发酵培养基中，进行发酵获得葡萄糖醛酸，再内酯化制备得到葡萄糖醛酸内酯。
2.如权利要求1所述的一种利用甘草次酸发酵废液制备葡萄糖醛酸内酯的方法，其特征在于所述的微生物菌株是野生型的，或者是遗传性状改变了的，例如一种重组微生物或微生物的一种突变体。该菌株能表达高活性的葡萄糖醛酸苷酶，在含有甘草酸的发酵培养基中可以将甘草酸盐，水解产生甘草次酸沉淀和两分子葡萄糖醛酸，所述微生物选自曲霉属、糖酵母属、接合糖酵母属、毕赤氏酵母属、克鲁维氏酵母属、假丝酵母属、汉逊氏酵母属、德巴利氏酵母属、毛霉属、球拟酵母属、甲基细菌属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属和假单胞菌属的成员。
3.如权利要求1所述的一种利用甘草次酸发酵废液制备葡萄糖醛酸内酯的方法，其特征在于所述的菌种培养物可以是液体种子培养物，也可以是固体斜面培养物。
4.如权利要求1所述的一种利用甘草次酸发酵废液制备葡萄糖醛酸内酯的方法，其特征在于以甘草酸盐为碳源，其他碳源为非必须营养成分。发酵培养基中的甘草酸盐可以是甘草酸铵盐、甘草酸钾盐和甘草酸钠盐几种的一种或多种的混合物，发酵培养基成分还包括一定浓度的无机盐和一定浓度的氮源。发酵培养基优选为:2?4%甘草酸单铵盐，0.1?0.5%尿素 3,0.01 ?0.05% KH2PO4,0.01 ?0.025% MgSO4,121°C灭菌 15min 后冷却到室温。
5.如权利要求1所述的一种利用甘草次酸发酵废液制备葡萄糖醛酸内酯的方法，其特征在于所述的发酵过程需要控制以下参数:温度25V?37°C，搅拌转速200?220rpm/min，溶氧量为15% -20%，发酵时间4?6天。
6.如权利要求1所述的一种利用甘草次酸发酵废液制备葡萄糖醛酸内酯的方法，其特征在于发酵结束后，按照以下步骤进行内酯化制备葡萄糖醛酸内酯: (1)发酵液过滤去除菌体和甘草次酸沉淀，流过预先处理过的OH型弱碱性阴离子交换树脂，流速为2?3BV/h交换吸附葡萄糖醛酸，所述的弱碱性阴离子交换树脂包括D301型、D318 型、D311 型、D941 型、D345 型，优选 D301 型。 (2)用浓度为0.5?I %的氨水洗脱获得葡萄糖醛酸洗脱液，向洗脱液加入无水乙醇在50°C?60°C减压浓缩至无可见水蒸馏出。 (3)向浓缩物中加入质量分数为40%的冰醋酸和3%的醋酸酐。温度保持在55°C?60°C进行内酯化反应2h ;加入无水乙醇，析出葡萄糖醛酸内酯粗品； (4)葡萄糖醛酸内酯粗品加入重量比为1: 4的80% (v/v)的乙醇水溶液重结晶。无水乙醇洗涤结晶，获得葡萄糖醛酸内酯精品，按中国药典(05版)方法检测，含量为99%?102%。
【文档编号】C12P19/00GK104250271SQ201310274330
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年6月28日 优先权日:2013年6月28日
【发明者】魏元刚, 杨永安, 汤文建, 朱海亮, 季浩 申请人:江苏天晟药业有限公司