一种发酵生产单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法和应用与流程

本发明涉及一种发酵生产单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法和应用，属于生物工程技术领域。

背景技术：

甘草为豆科甘草属植物，是传统的中草药，其药用部位为干燥的根及根茎。三萜类化合物甘草酸是甘草中的主要药效成分，是目前甘草方向的研究重点，国内外学者对其的深入研究表明，甘草酸(Glycyrrhizin,GL)具有一定的抗炎、保肝、抗病毒、抗过敏、降脂、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、解毒等方面的作用。

单葡萄糖醛酸基甘草次酸(Glycyrrhetinic acid monoglucuronide,GAMG)，由一分子葡萄糖醛酸和一分子的甘草次酸通过糖苷键连接而成。其化学式为C₃₆H₅₄O₁₀，分子量为648.8g mol^-1，根据其H的平面的不同，包括18β-GAMG和18α-GAMG两种同分异构体。GAMG只含有一个葡萄糖醛酸基，其极性介于甘草酸和甘草次酸之间，能顺利进入细胞，并且亲脂性不太强，在机体内的溶解度和跨膜转运能力比甘草酸和甘草次酸强。因而有更好的生物利用度，也能比甘草酸和甘草次酸更好的发挥药效。单葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG)作为甘草酸的衍生物，两者具有相似的生物活性，其在抗肝炎、抗过敏、抗癌症、抗病毒方面的疗效显著高于GL。因此，开发GAMG作为抗肝炎类、抗过敏、抗癌症方面的高效新药具有广阔的开发应用前景。GAMG的LD₅₀＝5000mg/kg，GL的LD₅₀＝805mg/kg，因此其比甘草酸更安全，GAMG作为一种新型的天然甜味剂，甜度约是甘草酸的5倍，在食品添加剂方面的应用前景广阔。在化妆品方面，GAMG的性质较为稳定，不仅耐高温、耐酸和耐压，而且有较好的乳化性和起泡性。

在现有的技术中，制备GAMG包括化学法和微生物法。甘草酸为苷元甘草次酸分别通过β-1,2糖苷键和β-1,3糖苷键和两个分子葡萄糖醛酸连接而成的，这两个糖苷键的键能是相似的，化学水解法对这两个糖苷键的选择性很低，采用高能耗和高污染的化学法制备该产物GAMG时，也会生成大量的副产物甘草次酸。因此，化学法制备生产GAMG的研究较为困难和少见。微生物制备单葡萄糖醛酸甘草次酸，其实质是微生物通过产生的β-葡萄糖醛酸苷酶将甘草酸为底物，选择性断裂两个糖基之间的β-1,2糖苷键，从而制得单葡萄糖醛酸甘草次酸。微生物发酵法存在目的产物产量低，副产物多的缺陷，使发酵不能满足国内的工业化生产需求。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种单葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，是将篮状真菌(Talaromyces sp)按体积以5～10％的接种量接种至以甘草酸作为碳源和诱导剂、硝酸钠为氮源的发酵培养基中，控制初始pH 4.5～6.5，于25～37℃发酵120-144h。

在本发明的一种实施方式中，所述硝酸钠浓度为2-4g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述硝酸钠浓度为3g/L。

在本发明的一种实施方式中，控制发酵过程中甘草酸浓度为1-8g/L进行诱导。

在本发明的一种实施方式中，所述甘草酸浓度为5g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述接种是接种种子液，所述种子液是将篮状真菌接种至种子培养基中，于25～40℃培养36-48h。

在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基每L含有：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.4g。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基每L含有：甘草酸1-8g，硝酸钠2-4g，磷酸二氢钾1-3g，硫酸镁0.5-2g，硫酸亚铁0.01-0.05g。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基每L含有：甘草酸5g，硝酸钠3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，硫酸亚铁0.01g。

有益效果：本发明提供了以甘草酸为碳源，诱导篮状真菌(Talaromyces sp)生产单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，可以在对环境友好的前提下，大量制备具有广泛研究价值的产物GAMG，同时，该微生物发酵方法为制备这一三萜类化合物的规模化生产奠定了新的基础。本发明的方法工艺简单，成本低，GAMG产量达到4.05g/L,产率为88.00％，经大孔树脂纯化后，其纯度达到80％以上，产物纯度高，不发生结构异化，并具有生产周期短、易于操作、能耗低等优点，适合于后期的工业化生产的特点。

附图说明

图1为按照本发明的方法进行发酵后发酵液的液相色谱图；

图2为按照对照例的方法进行发酵后的发酵液液相色谱图。

具体实施方式

GAMG测定方法：测定方法参见《单葡萄糖醛酸甘草次酸分离纯化的研究》，作者戴燕，公开于2006年。

实施例1

种子培养基每L含有：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.4g。

发酵培养基每L含有：甘草酸5g，硝酸钠3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，硫酸亚铁0.01g。

将篮状真菌(Talaromyces sp)接种至种子培养基中，于25～40℃培养36-48h。按体积以5～10％的接种量转接至以硝酸钠为氮源的发酵培养基中，控制初始pH 4.5～6.5，于25～37℃发酵120-144h，发酵过程中控制终浓度5g/L甘草酸作为碳源和诱导剂。

检测发酵结束后发酵液中目的产物的产量、纯度、转化率，结果如图1所示，保留时间为16.91的产物GAMG产量达到4.05g/L,产率为88.00％，且无保留时间为24.40的甘草次酸的这一副产物生成，经大孔树脂纯化后，其纯度达到80％以上。

对照例1

实施方式同实施例1，区别在于，发酵过程中不添加甘草酸诱导。对发酵结果进行测定，结果显示，GAMG产量接近于0。

对照例2

实施方式同实施例1，区别在于，发酵培养基中只含有5g/L的甘草酸，不加入其他营养物质。对发酵结果进行测定，结果显示，未检测到GAMG，该菌株几乎没有利用甘草酸。

对照例3

实施方式同实施例1，区别在于,发酵培养基中分别含有5g/L的葡萄糖和甘草酸、或分别含有5g/L的蔗糖和甘草酸，其产率基本上接近于0。

对照例4

实施方式同实施例1，区别在于，甘草酸浓度为1g/L，其GAMG的产率为42.55％(图2所示)。

对照例5

实施方式同实施例1，区别在于，分别将氮源替换为3g/L的牛肉膏、尿素、酵母粉，对发酵结果进行测定，结果显示，GAMG产率分别为25.87％、24.60％、40.28％。

对照例6

实施方式同实施例1，区别在于，初始pH分别3.5和4.0，对发酵结果进行测定，结果显示，GAMG产率分别为23.20％、34.70％。

对照例7

实施方式同实施例1，区别在于，温度分别为20℃、24℃时，对发酵结果进行测定，结果显示，GAMG产率分别为11.50％、14.86％。

对照例8

实施方式同实施例1，区别在于，将篮状真菌替换为黑曲霉，对发酵结果进行测定，结果显示，GAMG产率为51％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。