净化苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种净化苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱的制备与应用，更确 切的说是苯巴比妥和莱克多巴胺免疫亲和柱的制备方法，免疫亲和柱净化-液相色谱法检 测苯巴比妥和莱克多巴胺检测方法的建立。
【背景技术】
[0002] 苯巴比妥，为白色有光泽的结晶性粉末；无臭，味微苦。具有镇静、催眠、抗惊厥作 用。并可抗癫痫，对癫痫大发作与局限性发作及癫痫持续状态有良效；对癫痫小发作疗效 差；而对精神运动性发作则往往无效，且单用本药治疗时还可能使发作加重。本品还有增 强解热镇痛药之作用，并能诱导肝脏微粒体葡萄糖醛酸转移酶活性，促进胆红素与葡萄糖 醛酸结合，降低血浆胆红素浓度，治疗新生儿髙胆红素血症（脑核性黄疸）。不良反应（1) 用药后可出现头晕、困倦等后遗效应，久用可产生耐受性及依赖性。多次连用应警惕蓄积中 毒。（2)少数患者可出现皮瘆、药热、剥脱性皮炎等过敏反应。
[0003] 莱克多巴胺是一种人工合成的克仑巴安β -肾上腺受体激动剂，可用于治疗充血 性心力衰竭症、肌肉萎缩症，增长肌肉，减少脂肪蓄积，并对胎儿和新生儿生长有益。莱克多 巴胺正被作为一种新型瘦肉精被一些养猪场使用。对此药物在养殖业的适用范围和安全性 世界各国的规定不尽相同。自2011年12月5日起在中国境内禁止生产和销售莱克多巴胺。
[0004] 目前，苯巴比妥和莱克多巴胺的检测方法主要有薄层层析法，酶联免疫法 (ELISA)，免疫亲和层析-液相色谱法，免疫亲和层析-荧光光度法等。薄层层析法，要接触 大量的标准品，不利于实验者的健康，而且灵敏度很低。酶联免疫法，只适用于定性检测，很 容易出现假阳性和假阴性的现象。免疫亲和层析-液相色谱法可以定量地检测许多商品中 的苯巴比妥和莱克多巴胺的含量。由于采用了先进的生物技术，该方法可以检测出苯巴比 妥和莱克多巴胺，而不使用有毒的溶剂如氯仿和二氯甲烷等。因此，当务之急，要制备出性 能稳定的免疫亲和柱，并建立一种经济，快捷，精确，安全的试验方法。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中检测苯巴比妥和莱克多巴胺亟需性能稳定的免疫亲和柱的 问题，本发明提供了一种苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱及其制备方法与在HPLC 检测中的应用。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种净化苯巴比妥和莱克多巴 胺复合免疫亲和柱的制备方法如下：
[0007] a)基质制备
[0008] 称取Ig琼脂糖凝胶基质粉末，溶于lmmol/L HCl中，然后置于烧结玻璃过滤器中 使用 lmm〇l/L HCl 洗绦 15min ;
[0009] b)配体偶联
[0010] 使用偶联缓冲液〇. 2mol/L NaHC03pH8. 3溶解待偶联的抗苯巴比妥单克隆抗体和 抗莱克多巴胺单克隆抗体，获得抗体溶液，迅速将步骤a)活化的琼脂糖凝胶基质转移到所 述抗体溶液中，充分混匀上述的混和物2-4h ;
[0011] C)配体封闭
[0012] 封闭所有残留的活性基团，转移经步骤b)处理的琼脂糖凝胶基质至0. lmol/L Tris-HCl缓冲液中，室温条件下静置2-4h ;
[0013] d)除去偶联后未偶联上的多余的配体
[0014] 依次用0· lmol/L醋酸/醋酸钠缓冲液和0· lmol/L Tris-HCl缓冲液对经步骤c) 处理后的琼脂糖凝胶基质进行洗涤，至少洗涤3个循环；
[0015] e)装柱
[0016] 用5倍所述琼脂糖凝胶体积的0. 01 % NaN3-PBS洗涤，并使用0. 01 % NaN3-PBS保 存，然后装柱。
[0017] 在以上获得复合免疫亲和柱（IAC)的基础上，本发明建立了利用液相色谱法检测 苯巴比妥和莱克多巴胺检测的方法：当含有苯巴比妥和莱克多巴胺的样品通过IAC时，免 疫吸附剂就会特异性的吸附苯巴比妥和莱克多巴胺，其他的杂质则流出IAC柱，然后用甲 醇将苯巴比妥和莱克多巴胺从柱子中洗脱下来，样品得到了很好的净化。
[0018] 用所述复合免疫亲和柱净化待测样液，然后用色谱级甲醇洗脱亲和柱，流速为 lmL/min~2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供HPLC分析；
[0019] 高效液相色谱条件
[0020] 苯巴比妥
[0021] 色谱柱！Cloversil-C18, 4. 6 X 250mm
[0022] 流动相：甲醇：水=50:50 (v/v)
[0023] 流速：0. 8mL/min
[0024] 检测器：紫外检测器，波长254nm
[0025] 进样体积：50~IOOuL ;
[0026] 莱克多巴胺：
[0027] 色谱柱！Cloversil-C18, 4. 6 X 250mm
[0028] 流动相：乙腈：0· 05%三氟乙酸=20 :80 (v/v)
[0029] 流速：0· 8mL/min
[0030] 检测器：紫外检测器，波长224nm
[0031] 进样体积：50~IOOuL ;
[0032] 定量
[0033] 用进样器吸取50 μ L标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定标 准溶液的响应值，分别得到标准溶液高效液相色谱图。
[0034] 本发明制备的复合免疫亲和柱可以有效地利用到苯巴比妥和莱克多巴胺的液相 色谱检测中，使检测快捷，精确，安全。
【附图说明】
[0035] 图1为样品中苯巴比妥的色谱图；
[0036] 图2为样品中莱克多巴胺的色谱图。
【具体实施方式】
[0037] 实例一：
[0038] 制备抗苯巴比妥单克隆抗体；莱克多巴胺抗体为市售产品。
[0039] 动物免疫：免疫动物为6-8周龄左右，雌性BALB/c小鼠。免疫原：ZER-BSA免疫5 只小鼠。取适量免疫原（IOOyg/只）加等量弗氏完全佐剂，制成乳化剂进行免疫，之后佐 剂改为不完全佐剂，共免疫6次，每次间隔2周。除第一次为颈背部皮下多点注射外，其余 均为腹腔注射。
[0040] 细胞融合：脾细胞和杂交瘤细胞按照10:1的比例进行细胞融合试验。
[0041] 杂交瘤细胞克隆化：采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，直到得到对苯巴比妥有很 好的特异性反应的细胞。最后筛选出分泌苯巴比妥抗体的杂交瘤细胞9203,制备出单克隆 抗体。抗苯巴比妥单克隆抗体细胞已于2014年5月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心（CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No. 9203〇
[0042] 实例二：
[0043] 本实例为苯巴比妥和莱克多巴胺复合免疫亲和柱的制备
[0044] 1.基质制备
[0045] 称取所需Ig的琼脂糖凝胶（Sepharose)基质粉末（每克冻干基质粉末可形成 3.5ml终体积的溶胀基质），溶于lmmol/L HCl中。基质将会立即溶胀，然后置于烧结玻璃 过滤器中使用lmm〇l/L HCl洗绦15min。
[0046] 2.配体（抗体）偶联
[0047] a使用偶联缓冲液0. 2mol/L NaHC03pH8. 3溶解待偶联的抗苯巴比妥单克隆抗体 细胞9203分泌的抗苯巴比妥单克隆抗体和市购的莱克多巴胺抗体，抗体浓度为7. 8mg/ml， 溶解的抗体置于冰浴中暂存。在一个带盖的可完全密封的容器中加入上述含有抗体的偶联 缓冲液。迅速将CNBr活化的Sepharose转移到抗体溶液中。室温条件（20-25°C)下采用 end-over-end的方式充分混勾上述的混和物2_4h，
[0048] b偶联率的计算：离心，2, 000RMPX lmin，将s印harose离心至管底，将上清液转移 至新的离心管中，测定上清液的蛋白质含量值。计算偶联率为99.3% (说明偶联很成功）。 取离心至管底的sepharose，使用偶联缓冲液进行洗涤，除去多余的配体。
[0049] c封闭：封闭所有残留的活性基团。转移基质至0. lmol/L Tris-HCl缓冲液中。室 温条件下静置2-4h。
[0050] d为除去偶联后未偶联上的多余的配体，依次用低、高两种pH的缓冲液对基质进 行洗涤，至少洗涤3个循环，每种缓冲液的使用量至少5倍基质体积。
[0051] 每个洗涤循环步骤：先用0. lmol/L醋酸/醋酸钠缓冲液洗涤，接着再用0. lmol/L Tris-HCl缓冲液进行洗涤。
[0052] e用5倍基质体积的0. 01 % NaN3-PBS