一种大尺寸亲水有机聚合物液相整体色谱柱及制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于色谱分离材料技术领域，具体涉及一种大尺寸亲水有机聚合物液相整 体色谱柱及制备与应用。
【背景技术】
[0002] 众所周知，液相色谱及其联用技术已经是分离分析科学极其重要的组成部分，在 环境、食品安全、药学、医学和生命科学等各个不同领域都有着非常广泛的应用。色谱柱 为液相色谱实现其分离分析功能的核心介质，因此色谱柱的发展直接影响着整个液相色 谱技术乃至各个分离分析科学领域的发展。近年来，具有高通透性、低柱压、传质速度快、 制备简单等优点的新型色谱固定相整体材料已经越来越受到分离分析科学工作者的重 视。而新型整体色谱固定相材料的开发也成为分离科学领域的研宄热点之一。直至目前， 整体色谱固定相材料已经成功应用于反相色谱、离子交换色谱、亲和色谱等分离模式并且 有效地分离了氨基酸、多肽、蛋白质、多肽和类固醇等多种不同性质的化合物体系。根据 制备整体材料的功能单体的不同，整体色谱柱主要分为三大类：有机聚合物整体柱、硅胶 整体柱和杂化整体柱[Zou H, Huang X，Ye M, Luo Q. Monolithic stationary phases for liquid chromatography and capillary electrochromatography. J Chromatogr. A. 2002 ； 954(1-2) :5-32.]。其中，由于有机聚合物整体柱的制备简单、成本低廉、仪器设备门槛低以 及可以根据不同的分离分析需求选择不同类型的功能性单体等优点，使得有机聚合物整体 色谱柱具有另外两种整体色谱柱所不能比拟的优势。
[0003] 其中，亲水性有机聚合物整体色谱柱是有机聚合物整体柱的重要分支， 亲水性整体色谱柱的制备是有机聚合物整体色谱柱的重要发展热点。自1990年 亲水性液相色谱（Hydrophilic interaction chromatography, HILIC)被首次提出 后[Alpert AJ.Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides,nucleic acids and other polar compounds. J Chromatogr. 1990 ； 499:177-96.]，亲水性液相色谱越来越受到分离分析科学工作者的关注。关于这部分的研 宄，Boguslaw 等人做了全面且优秀的综述[Boguslaw et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography(HILIC)-a powerful separation technique.Anal Bioanal Chem(2012)402 :231-247]。
[0004] 然而，关于HILIC整体柱的制备研宄主要集中在小尺寸毛细管柱（内径小于或 等于200)的制备，而关于更大尺寸的HILIC整体柱制备的文章鲜见报道。然而，基于整 体柱高通透性、低柱压的特点，若能够制备大尺寸并且具有高柱效的整体柱，则能够大大 降低对仪器的要求（小于等于200微米的整体柱需要微升/纳升液相，这类仪器存在价 格高、市场选择少以及流路易堵塞等缺点）。然而，关于大尺寸毛细管整体柱的研宄中目 前只有：Ales等人制备大体积整体柱的研宄[Ales P, Milos B et al. Construction of large-volume monolithic columns. Anal. Chem. 2000, 72, 5693-5699] ;Pavel 等人制备 320微米内径的甲基丙稀酸醋类毛细管整体柱[Pavel C, Martin C et al. Methacrylate monolithic columns of 320 μm I.D.for capillary liquid chromatography. Journal of Chromatography A. 946(2002)99-106] ;A. Podgornik 等人制备大柱体积（8000ml)的 整体柱并应用于大分子样品（蛋白质、DNA等）的纯化[A. Podgornik et al. large-scale methacrylate monolithic columns: design and properties.J.Biochem. Biophys. Methods 60 (2004) 179-189] ;Huang 等人做了 530 微米内径整体柱的研宄[Xiao jia H. et al. Octyl-type monolithic columns of 530 μ m i. d. for capillary liquid chromatography. J. chromatogr. A 1062 (2005) 183-188]。但是，上述的这些研宄中都存在 一个主要问题：整体柱的柱效低，机械强度差，分离效果不理想。显然，这些缺点大大影响了 大尺寸整体色谱柱的进一步研宄和应用。因此，如何制备具有高柱效、强机械强度的大尺 寸（>200微米）的亲水性整体色谱柱仍然是分离科学迫切需要解决的科学问题。
【发明内容】
[0005] 为了解决以上现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种高柱 效的大尺寸亲水有机聚合物液相整体色谱柱。
[0006] 本发明的另一目的在于提供上述大尺寸亲水有机聚合物液相整体色谱柱的制备 方法。
[0007] 本发明的再一目的在于提供上述大尺寸亲水有机聚合物液相整体色谱柱的应用。
[0008] 本发明目的通过以下技术方案实现：
[0009] -种大尺寸亲水有机聚合物液相整体色谱柱，所述大尺寸亲水有机聚合物液相整 体色谱柱是以3-[N，N-二甲基-[2_(2_甲基丙_2_稀酰氧基）胺基丙基]按]丙烷-1-横 酸内盐(N, N-dimethyl-N- (3-methacrylamidopropyl) -N- (3-sulfopropyl) ammonium betaine, SPP)为功能单体，N，N-亚甲基双丙稀酰胺（N, N-Methylenebis (acrylamide), MBA ，CAS号：110-26-9)为交联剂，甲醇（Methanol, CAS号：67-56-1)为生孔剂，偶氮二异丁腈 (Azobisisobutyronitrile, AIBN, CAS号：78-67-1)为引发剂，通过热催化反应在内径大于 200微米经预处理的石英毛细管内原位聚合而成。
[0010] 所述经预处理的石英毛细管的内径优选400微米。
[0011] 所述经预处理的石英毛细管是指经过以下步骤预处理的石英毛细管：首先，用浓 度为lmol/L的NaOH溶液冲洗石英毛细管15分钟；然后，将石英毛细管两端封口放在100°C 水浴锅反应2小时；然后用去离子水冲洗石英毛细管直至洗出液的酸碱性pH = 7 ;然后，用 甲醇冲洗石英毛细管并用氮气干燥4小时；干燥完毕后，把体积比为1:1的甲醇和3-(异 丁稀酰氧）丙基三甲氧基硅烷（3 -(Methylacryloxy)propyl-trimethoxysilane, γ-MAPs ，CAS号：2530-85-0)混合液灌进石英毛细管中并确保管中无气泡产生，两端封口且放在 60°C水浴锅内反应12小时；最后分别用甲醇和水各冲洗30分钟，氮气干燥12小时，即得经 过预处理的石英毛细管；通过上述操作，使得石英毛细管内表面的硅醇基与γ-MAPs反应， 从而γ -MAPs键合在硅醇基上。
[0012] 所述大尺寸亲水有机聚合物液相整体色谱柱具有连续的多孔结构（SPP-co-MBA); 其由末端带亲水性磺酸基团的单体3-[N，N-二甲基-[2-(2-甲基丙-2-烯酰氧基）胺基丙 基]铵]丙烷-1-磺酸内盐（SPP)依次序连接交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺（MBA)、3-(异 丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（γ-MAPs)和石英毛细管内壁的硅醇基构成。
[0013] 上述大尺寸亲水有机聚合物液相整体色谱柱的制备方法，包括以下操作步骤：将 单体3-[N，N-二甲基-[2-(2-甲基丙-2-烯酰氧基）胺基丙基]铵]丙烷-1-磺酸内盐、 交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺、生孔剂甲醇和引发剂偶氮二异丁腈混合，超声脱气后，灌 入内径大于200微米经过预处理的石英毛细管柱内，然后将石英毛细管两端封口，放入水 浴中反应12小时；反应完毕后，除去石英毛细管内的杂质和未反应物，得到大尺寸内径亲 水性有机聚合物液相整体色谱柱。
[0014] 所述的反应是指在温度为50~65°C范围内反应6~24小时；优选在温度为60°C 条件下反应12小时。
[0015] 所述单体3-[N，N-二甲基-[2-(2-甲基丙-2-烯酰氧基）胺基丙基]铵]丙 烷-1-磺酸内盐与交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺的质量比为80:20至90:10范围内；单体 与交联剂的质量比优选87:13。
[0016] 所述引发剂偶氮二异丁腈的质量为单体3-[N，N-二甲基-[2-(2-甲基丙-2-烯 酰氧基）胺基丙基]铵]丙烷-1-磺酸内盐与交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺总质量的 0. 5%~1% ;优选引发剂的质量为单体和交联剂总质量的1%。
[0017] 所述单体3_[N，N-二甲基-[2-(2-甲基丙-2-烯酰氧基）胺基丙基]铵]丙 烷-1-磺酸内盐与交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺的质量之和与生孔剂甲醇的质量比在 25:75至45:55范围内；优选单体与交联剂的质量之和与生孔剂的质量之比为32. 5:67. 5。
[0018] 所述除去石英毛细管中的杂质和未反应物是按照以下步骤进行操