电化学发光猝灭法快速检测莱克多巴胺的方法
【专利摘要】本发明公开了电化学发光猝灭法快速检测莱克多巴胺的方法，该方法为将待测样品加入到[Ru(bpy)3]2+/BDEA光化学发光体系中，再用电化学发光分析系统检测[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系的发光强度，若[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系的发光强度发生了猝灭现象，且猝灭效率在5%以上，则待检测样品中含有莱克多巴胺。该方法灵敏度高、分析速度快、试剂用量少、检测结果准确可靠，且能对样品中的莱克多巴胺含量进行定量，有望为畜牧和食品中莱克多巴胺残留检测提供一种经济适用、可现场快速检测的分析方法。
【专利说明】
电化学发光猝灭法快速检测莱克多巴胺的方法
技术领域
[0001] 本发明属于药物检测领域，具体涉及一种电化学发光猝灭法快速检测莱克多巴胺 的方法。
【背景技术】
[0002] 莱克多巴胺(Ract〇pamine，RAC)是一类结构和功能类似于肾上腺素和去甲肾上腺 素的苯乙醇胺类衍生物，具有营养再分配作用，可降低畜禽胴体脂肪含量，提高瘦肉率。同 时，莱克多巴胺的价格要远低于克伦特罗，因而近年来在饲料或饲养过程中违法使用莱克 多巴胺的现象屡禁不止。莱克多巴胺容易残留在动物体内，通过食物链在人体中富集，并引 起肌肉震颤、心律失常、恶心、眩晕等。包括欧盟、日本、中国等许多组织和国家都明文规定 禁止在畜禽中使用莱克多巴胺，但莱克多巴胺检测标准和检测方法比克仑特罗滞后，控制 非法使用的难度相对较大。
[0003] 电化学发光(Electrochemiluminescence，ECL)，也称电致化学发光，是指通过对 工作电极施加一定的电压产生电生物质，电生物质之间或电生物质与体系中某组分通过电 子传递形成激发态，激发态在返回基态的过程中释放出光子的现象。由于其集成了电化学 电势的可控性以及化学发光的高灵敏度，目前该技术已广泛应用于临床诊断、药物分析、环 境监测、食品安全检测等领域。在已报道的电化学发光体系中，大部分是基于[Ru(bpy) 3]2+ 来进行的，尤其是[Ru(bpy)3]2+/三丙胺（Tripropylamine，TPA)体系。自从1999年Richer研 究小组报道了苯酚及其衍生物可抑制[Ru(bpy) 3]2+/TPA体系的发光以来，发现其它物质，如 肾上腺素、四环素、尿酸、结晶紫等也可以有效地抑制该体系的发光。最近研究表明，含有两 个轻乙基的N-丁基二乙醇胺（Butyldiethanolamine，BDEA)是[Ru(bpy)3] 2+的一种更为有 效的共反应物。相对于传统的共反应物TPA而言，该共反应物具有一系列的优点，如无毒、不 易挥发、易溶于水、在工作电极表面可快速氧化等。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种电化学发光猝灭法快速检测莱克多巴胺的方法。
[0005] 本发明所采取的技术方案是： 一种快速检测莱克多巴胺的方法，该方法为:将待测样品加入到[Ru(bpy)3]2+/BDEA光 化学发光体系中，再用电化学发光分析系统检测[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系的发光强度，与阴 性和阳性对照组相比较，若[Ru(bpy) 3]2+/BDEA体系的发光强度发生了猝灭现象，且猝灭效 率在5%以上，则待检测样品中含有莱克多巴胺;其中BDEA为N-丁基二乙醇胺的简称。
[0006] 进一步的，计算出加入待测样品后[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系的发光强度It除以加待 测样品前的发光强度1〇的比值It / 1〇,将该比值作为y值代入公式y = -0.6836 X + 0.1816中，求得的X值，即可得[Ru (bpy) 3 ]2+/BDEA体系中莱克多巴胺的浓度，浓度单位为g/ mL，再根据待测样品的稀释倍数，即可定量计算出待测样品中莱克多巴胺的浓度。
[0007] 进一步的，上述待测样品与[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系的体积比为（1~2) : (8~10)。
[0008] 进一步的，上述[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系中含有 10-8~10-6 mol/L [Ru(bpy)3]2+、 10-9~10-5mol/L BDEA、pH为7.5~9.0的0.05~0.15 mol/L PBS缓冲溶液。
[0009] 进一步的，上述[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系中含有 10-7 M [Ru(bpy)3]2+、10-8M的 BDEA、pH为8.5的0.1M PBS缓冲溶液。
[0010] 进一步的，上述电化学发光分析系统选用流动注射电化学发光分析系统。
[0011]进一步的，上述流动注射电化学发光分析系统检测[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系发光强 度时的相关条件为：电极电势为1.16~1.50￥，样品溶液喷射速率为2.4~4.8 111171^11，[1?11 (bpy) 3 ] 2+/BDEA 体系中 BDEA的浓度为 10-9~10-5mo 1/L。
[0012]进一步的，上述流动注射电化学发光分析系统检测[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系发光强 度时的相关条件为：电极电势为1.35V，样品溶液喷射速率为4 mL/min，[Ru(bpy)3]2+/BDEA 体系中BDEA的浓度为10- 8M。
[0013] 本发明的有益效果是： 本发明基于莱克多巴胺对[Ru(bpy)3]2+/BDEA发光体系的强烈猝灭效应建立了一种检 测实际样品中莱克多巴胺的新方法。该方法灵敏度高、分析速度快、试剂用量少、检测结果 准确可靠，且能对样品中的莱克多巴胺含量进行定量，有望为畜牧和食品中莱克多巴胺残 留检测提供一种经济适用、可现场快速检测的分析方法。
【附图说明】
[0014] 图1为莱克多巴胺(RAC)对[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系发光强度的猝灭效应，（a)表示 RAC的浓度为0 g/mL; (b)表示RAC的浓度为1.0 X ΚΓ7 g/mL; (c)表示RAC的浓度为 1.0 X 10-6 g/mL; (d)表示RAC 的浓度为 1.0 X 10-5 g/mL; 图2为影响RAC猝灭[Ru(bpy)3]27m)EA发光强度的相关因素； 图3为[Ru(bpy) 3 ] 2+/BDEA发光体系对不同RAC浓度的响应曲线;A为[Ru (bpy)3 ] 2+/BDEA 体系的发光强度随着RAC浓度的递增而逐渐降低，曲线中a、b、c、d、e、f所对应的RAC浓度分 别为〇g/mL、10- 9g/mL、10-8g/mL、10-7g/mL、10-6g/mL、10- 5g/mL;B为对应的标准曲线； 图4为[Ru (bpy) 3 ] 2+/m)EA/RAC发光体系的稳定性。
【具体实施方式】
[0015] -种快速检测莱克多巴胺的方法，该方法为：将待测样品加入到[Ru(bpy) 3]2+/ BDEA光化学发光体系中，再用电化学发光分析系统检测[Ru(bpy)3] 2+/BDEA体系的发光强 度，与阴性和阳性对照组相比较，若[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系的发光强度发生了猝灭现象，且 猝灭效率在5%以上，则待检测样品中含有莱克多巴胺；其中BDEA为N-丁基二乙醇胺的简 称。
[0016] 优选的，计算出加入待测样品后[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系的发光强度It除以加待测 样品前的发光强度Ιο的比值It / 1〇,将该比值作为y值代入公式y = -0.6836 X + 0.1816 中，求得的X值，即可得[Ru (bpy)3 ] 2+/BDEA体系中莱克多巴胺的浓度，浓度单位为g/mL，再根 据待测样品的稀释倍数，即可定量计算出待测样品中莱克多巴胺的浓度。
[0017] 优选的，上述待测样品与[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系的体积比为（1~2) : (8~10)。 [0018]最优选的，上述待测样品与[RU(bpy)3]2+/BDEA体系的体积比为1:9。
[0019] 优选的，上述[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系中含有 10-8~10-6 mol/L [Ru(bpy)3]2+、10-9 ~10-5mol/L BDEA、pH为7.5~9.0的0.05~0.15 mol/L PBS缓冲溶液。
[0020] 更优选的，上述[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系中含有 10-7 M [Ru(bpy)3]2+、10-8M的BDEA、 pH为8·5的0· 1M PBS缓冲溶液。
[0021] 优选的，上述电化学发光分析系统选用流动注射电化学发光分析系统。
[0022]优选的，上述流动注射电化学发光分析系统检测[RU(bpy)3]2+/BDEA体系发光强度 时的相关条件为：电极电势为1.16~1.50V，样品溶液喷射速率为2.4~4.8 mL/min，[Ru (bpy) 3 ] 2+/BDEA 体系中 BDEA的浓度为 10-9~10-5mo 1/L。
[0023] 更优选的，上述流动注射电化学发光分析系统检测[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系发光强 度时的相关条件为：电极电势为1.35V，样品溶液喷射速率为4 mL/min，[Ru(bpy)3]2+/BDEA 体系中BDEA的浓度为10- 8M。
[0024] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0025]实施例1 一种电化学发光猝灭法快速检测莱克多巴胺的方法 (1)仪器与试剂： 本实施例电化学发光检测采用流动注射电化学发光分析系统，该分析系统的具体信息 可参见文献"陈然，王捷，刘仲明，陈钰.基于新型共反应物的流动注射电化学发光分析方法 研究.分析科学学报.2013年4月第29卷第2期"；也可以采用其他现有电化学发光分析系统 进行电化学发光检测。
[0026]三联吡啶氯化钌六水合物、N-丁基二乙醇胺(BDEA)、莱克多巴胺盐酸盐均购置于 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO); Na2HP〇4.12H2〇、NaH2P〇4 ·2Η20、尿酸购于上海阿拉丁试 剂有限公司；猪尿来源于广州某生猪养殖场;其它试剂均为分析纯。所有试剂用双蒸水配置 并稀释到所需浓度后保存于4 °C冰箱中。
[0027] (2)实验方法： 在检测前，工作电极需依次在含有粒径分别为1.〇、〇.3、0.05 μπι的Al2〇3粉末的麋皮上 进行抛光处理。待电极表面呈镜面后于双蒸水中超声5 min，双蒸水清洗动干净后，自然晾 干并组装在透明检测池中。
[0028]实验检测过程中采用恒电位法，初始电位设置为1.35V，灵敏度为Ie - 004(1 X 10-4)。光电倍增管高压为900V，放大级数为3级。注射栗进出样初始参数设置如下:样品溶液 进样端口（进样量：150仙，进样速度:50 uL/s;出样量：150仙，出样速度:50 uL/s);缓冲 液端口（进样量:500仙，进样速度：100 uL/s;出样量:500仙;推动及清洗速度:50 uL/s)。 每次检测前或更换样品时，均需用0.1 Μ pH8.5的PBS作为清洗液清洗检测池，直至无电化 学发光信号，样品的注射速度为3 mL/min。
[0029]具体检测方法为： 1) 配制[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系：[Ru(bpy)3] 2+/BDEA体系中含有 10-7 M [Ru(bpy)3]2+、 10-8 M BDEA、pH为8.5 的0.1M PBS缓冲溶液； 2) 采用流动注射电化学发光分析系统对配制好的[RU(bpy)3]2+/BDEA体系进行发光强 度检测（相关条件参数的设置如上所述），记为1〇;另外，往[Ru(bpy) 3]2+/BDEA体系中加入莱 克多巴胺，使其终浓度分别为1.0 X 10-7 g/mL、1.0 X 10-6 g/mL、1.0 X 10-5g/mL，用同 样的方法测定加入莱克多巴胺后[Ru(bpy)3] 2+/BDEA体系的发光强度It; 3)结果：检测结果如图1所示，从中可以看出，在中性略偏碱性的roS缓冲溶液中，[Ru (bpy)3]2+/BDEA体系的电化学发光强度约为108 · 6 a ·u ·(见图1曲线的a峰，不含RAC)。在保 持其它条件不变时，随着RAC浓度的增加，ECL强度值逐渐降低，图1曲线中的b(请发光强度 为90.9)、c(发光强度为48.7)、d(发光强度为26.9)峰值所对应的RAC浓度分别为1.0 X 10-7 g/mL、1.0 X 10-6 g/mL、1.0 X 10-5g/mL〇
[0030]上述实验结果说明，[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系发光强度的抑制效应是由于RAC的加 入所造成的，并且这种抑制程度与RAC浓度的大小有关。
[0031 ]实施例2本发明检测方法条件的优化 为了实现低浓度的RAC检测，本实施例对影响体系发光的一些主要因素，包括工作电极 电势、缓冲液pH、共反应物BDEA浓度以及样品喷射速率等条件进行优化，具体的检测方法如 实施例1所述。RAC的抑制效应可能是通过其氧化产物和强还原型的BDEA自由基共同竞争 [Ru(bpy) 3]3+来实现的。所以一切影响这三者产物生成的因素都会对RAC的抑制效率产生影 响。
[0032]经过实验研究发现，工作电极电势和缓冲液pH的大小对RAC的抑制效率有一定的 影响。从图2-A和2-B中可以看出，当工作电极电势为1.35V，PBS缓冲液pH为8.5时，RAC抑制 效率达到最大值。
[0033]图2-C反映了共反应物BDEA浓度对RAC抑制效率的影响，从中可以看出10-5~10-9 Μ的BDEA浓度，均能反应出RAC对[Ru (bpy) 3 ] 2+/BDEA发光强度的猝灭效果，但当BDEA浓度较 高时，RAC抑制效率较低；随着Κ)ΕΑ浓度的降低，RAC对[Ru (bpy) 3 ] 2+/BDEA体系发光强度的猝 灭能力就越强。但过低浓度的BDEA也会造成体系发光强度变弱。综合考虑，拟选取10- 8Μ的 BDEA浓度进行后续实验。
[0034]在图2-D中，样品喷射速率对RAC的抑制效率也具有的影响。样品溶液喷射到工作 电极表面的速率决定着电化学产物在工作电极表面更新速率的快慢，也在一定程度上影响 着RAC的抑制效率。从图中可以看出1~6 mL/min的喷射速率都能反应出RAC对[Ru(bpy)3 ]2+/m)EA发光强度的猝灭效果，当样品喷射速率为4 mL/min时，RAC的抑制效率达到最大。 [0035]实施例3检测限及检测范围 在最优的检测条件下，[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系的发光强度随着RAC浓度的递增而逐渐 降低（图3-A)，曲线中&、13、(：、(1、6汀所对应的1^(：浓度分别为(^/1^、10_!^/1^、10、/1^、10 一 7g/mL、10-6g/mL、10-5g/mL。与之相对应的标准曲线中（图 3-B)，[ Ru (bpy) 3 ] 2+/BDEA体系的 相对发光强度（It / Iq，Iq和It分别表示加入RAC前后所测得的发光强度值)与10-9~10-5 g/mL浓度范围内的RAC成良好的线性关系（y = -0.6836 X + 0.1816，相关系数r = 0.9989);当信噪比为3时，RAC的最低检测限为5X10-1Q g/mL。并对含有10-8 g/mLRAC的[Ru (bpy)3]2+/BDEA发光体系进行连续测定11次（如图4所示），所得相对标准差为1.23 % (n= 11 )，表明该检测体系具有良好的重复性。
[0036]实施例4本发明方法的选择性评估 为了评估本发明检测方法对RAC测定的选择性，在最佳检测条件下，对实际样品中可能 出现的一些共存物质进行了干扰性评估。配制含ΚΓ7 g/mL RAC的[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系 中，向该体系中分别加入100倍RAC浓度的尿酸、N〇3-、Cl-、I-、S〇4 2-、K+、Na+、Ca2+后，结果表明， 除尿酸对检测体系具有少许干扰外(猝灭效率〈5%)，其它物质均无明显的干扰，表明本发明 方法对莱克多巴胺检测具有良好的选择性。
[0037]实施例5实际样品检测 分别向两份经HPLC法确认不含有莱克多巴胺的猪尿样品（体积为1 mL)中加入1 yg莱 克多巴胺标准品，再将每份样品用PBS缓冲液分别稀释至5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL，利 用本发明方法对样品进行检测，并结合标准曲线（图3B)测得样品中莱克多巴胺的含量如表 1所示，从中可以看出，检测结果与样品实际添加的RAC的量很接近(相对标准差在0.84 %~ 1.46 %);所测得的回收率在93.60 %~107.40 %之间，表明本发明检测方法具有较好的准 确度和精密度。
[0038]表1加标回收率实验
实施例6-种电化学发光猝灭法快速检测莱克多巴胺的方法 1) 配制[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系：[Ru(bpy)3] 2+/BDEA体系中含有 10-8~10-6 mol/L Μ [Ru(bpy)3]2+、l〇-9~10-5mol/L BDEA、pH为7.5~9.0的0.05~0.15 mol/L PBS缓冲溶液； 2) 采用电化学发光分析系统对配制好的[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系进行发光强度检测，记 为Ιο;往[Ru(bpy) 3]2+/BDEA体系中加入待测样品，二者的体积比为(8~10):(1~2)，用同样 的方法测定加入待测样品后[Ru(bpy) 3]2+/BDEA体系的发光强度It; 其中，所述电化学发光分析系统为流动注射电化学发光分析系统时，其工作时的电极 电势为1.16~1.50V，加样溶液喷射速率为2.4~4.8 mL/min; 3) 结果分析:与阴性和阳性对照组相比较，若猝灭效率（Io-ItVlo在5%以上，则待检测 样品中含有莱克多巴胺;若需对样品中的莱克多巴胺进行定量，可将比值It / Ιο作为y值代 入公式y = -0.6836 X + 0.1816中，求得的X值，即为[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系中含莱克多巴 胺的浓度，单位为g/mL;再根据待测样品的稀释倍数，即可定量计算出待测样品中莱克多巴 胺的浓度。
[0039]实施例7-种电化学发光猝灭法快速检测莱克多巴胺的方法 1) 配制[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系：[Ru(bpy)3] 2+/BDEA体系中含有 10-7 M [Ru(bpy)3]2+、 10-8M的BDEA、pH为8.5 的0· 1M PBS缓冲溶液； 2) 采用流动注射电化学发光分析系统对配制好的[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系进行发光强 度检测，记为Ιο;另外，往[Ru(bpy) 3]2+/BDEA体系中加入待测样品，二者的体积比为9:1，用 同样的方法测定加入待测样品后[Ru(bpy) 3]2+/BDEA体系的发光强度It; 其中电化学发光分析系统工作时的电极电势为1.35V，加样溶液喷射速率为4mL/min; 3)结果分析:与阴性和阳性对照组相比较，若猝灭效率（Io-ItVlo在5%以上，则待检测 样品中含有莱克多巴胺;若需对样品中的莱克多巴胺进行定量，可将比值It / 1〇作为y值代 入公式y = -0.6836 X + 0.1816中，求得的X值，即为[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系中含莱克多巴 胺的浓度，单位为g/mL;再根据待测样品的稀释倍数，即可定量计算出待测样品中莱克多巴 胺的浓度。
[0040]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种快速检测莱克多巴胺的方法，其特征在于：该方法为：将待测样品加入到[Ru (bpy)3]2+/BDEA光化学发光体系中，再用电化学发光分析系统检测[Ru(bpy) 3]2+/BDEA体系 的发光强度，与阴性和阳性对照组相比较，若[Ru(bpy)3] 2+/BDEA体系的发光强度发生了猝 灭现象，且猝灭效率在5%以上，则待检测样品中含有莱克多巴胺;其中BDEA为N-丁基二乙 醇胺的简称。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:计算出加入待测样品后[Ru(bpy)3]2+/BDEA 体系的发光强度It除以加待测样品前的发光强度Ιο的比值It / 1〇,将该比值作为y值代入公 式y = -0.6836 X + 0.1816中，求得的X值，即可得[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系中莱克多巴胺的 浓度，浓度单位为g/mL，再根据待测样品的稀释倍数，即可定量计算出待测样品中莱克多巴 胺的浓度。3. 根据权利要求1所述的的方法，其特征在于:所述待测样品与[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系 的体积比为（1~2): (8~10)。4. 根据权利要求1~3任一所述的的方法，其特征在于:所述的[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系 中含有 10-8~10-6 mol/L [Ru(bpy)3]2+、10-9~10-5mol/L BDEA、pH为7.5~9.0的0.05~0.15 mol/L PBS缓冲溶液。5. 根据权利要求4所述的的方法，其特征在于:所述的[RU(bpy)3]2+/BDEA体系中含有10 - 7 M [Ru(bpy)3]2+、10-8M的BDEA、pH为8.5的0.1M PBS缓冲溶液。6. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述的电化学发光分析系统选用流动 注射电化学发光分析系统。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述流动注射电化学发光分析系统检测 [Ru(bpy)3] 2+/BDEA体系发光强度时的相关条件为：电极电势为1.16~1.50V，样品溶液喷射 速率为2·4~4·8mL/min，[Ru(bpy)3] 27BDEA体系中BDEA的浓度为10-9~10-5mol/L。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述流动注射电化学发光分析系统检测 [Ru (bpy) 3 ] 2+/BDEA体系发光强度时的相关条件为：电极电势为1.35V，样品溶液喷射速率为 4 mL/min，[Ru(bpy)3]2+/BDEA体系中BDEA的浓度为 10-8M。
【文档编号】G01N27/26GK105866201SQ201610176632
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年3月25日
【发明人】刘仲明, 王捷, 陈钰, 赵瑞琴, 余鹏博
【申请人】广州军区广州总医院