利用秀丽线虫检测莱克多巴胺的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及莱克多巴胺毒性检测技术领域，尤其是一种利用秀丽线虫检测莱克多巴胺的方法。
【背景技术】
[0002]一些不法商贩为了更高的利益将莱克多巴胺(俗称瘦肉精)添加于饲料中，可以增加动物的莱克多巴胺、减少饲料使用、使肉品提早上市、降低成本，莱克多巴胺让猪的瘦肉率提高，带来更多经济价值，但它对人体有很危险的副作用，因此国家是禁止含有莱克多巴胺的猪肉进行销售的，并且莱克多巴胺的毒性也无法确定，也无法查出猪肉中是否含有莱克多巴胺。
【发明内容】
[0003]为了克服现有的莱克多巴胺无法快速检测出的不足，本发明提供了一种利用秀丽线虫检测莱克多巴胺的方法。
[0004]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种利用秀丽线虫检测莱克多巴胺的方法，将秀丽线虫放置在含有表面涂布有大肠杆菌0P50的NGM琼脂培养基的3cm培养皿上,加入莱克多巴胺暴露溶液使其均勻分布于培养基表面，置于20°C培养箱中培养直至秀丽线虫成长到young adult时期:
a、观察安置在莱克多巴胺中的秀丽线虫的存活率，利用跳针刺激培养基上的秀丽线虫观察秀丽线虫的死亡和麻痹的数目；
b、观察秀丽线虫的头部摆动频率、身体弯曲频率和向前运动频率3个方面；
C、秀丽线虫在进入成虫时期后将其转移到含有食物的新板上进行统计，每2天转新板一次，直到没有后代产生为止，计算所有板上所得后代数量的总和；
d、对秀丽线虫体长来进行评测；
e、利用显微镜照相观察秀丽线虫体内的肠道自发荧光量；
f、对秀丽线虫体内ROS水平进行了检测。
[0005]本发明的有益效果是，这种利用秀丽线虫检测莱克多巴胺的方法，观察安置在含有莱克多巴胺的培养基上的秀丽线虫，观察秀丽线虫的存活率、运动能力、发育情况、繁殖能力、衰老速度和体内氧化应激，来确定莱克多巴胺对秀丽线虫的毒性，并且记录数据后，就能利用秀丽线虫对猪肉中是否含有莱克多巴胺进行检测，如果在受检测的样本上的数据与实验数据较为吻合就能确定是否含有莱克多巴胺。
【具体实施方式】
[0006]该利用秀丽线虫检测莱克多巴胺的方法，将秀丽线虫放置在含有表面涂布有大肠杆菌0P50的NGM琼脂培养基的3cm培养皿上，加入莱克多巴胺暴露溶液使其均匀分布于培养基表面，置于20°C培养箱中培养直至秀丽线虫成长到young adult时期: a、观察安置在莱克多巴胺中的秀丽线虫的存活率，利用跳针刺激培养基上的秀丽线虫观察秀丽线虫的死亡和麻痹的数目；
b、观察秀丽线虫的头部摆动频率、身体弯曲频率和向前运动频率3个方面；
C、秀丽线虫在进入成虫时期后将其转移到含有食物的新板上进行统计，每2天转新板一次，直到没有后代产生为止，计算所有板上所得后代数量的总和；
d、对秀丽线虫体长来进行评测；
e、利用显微镜照相观察秀丽线虫体内的肠道自发荧光量；
f、对秀丽线虫体内ROS水平进行了检测。
[0007]将瘦肉精(莱克多巴胺)暴露后的秀丽线虫在解剖镜下记录下不活动的秀丽线虫数目，并用挑针刺激以确定其中的死亡和麻痹的秀丽线虫数目(死亡秀丽线虫无任何回应)。死亡率是死亡秀丽线虫在测试板上秀丽线虫中所占比例。每一个处理进行三次重复，每次分析不少于50个动物。
[0008]头部摆动的测试是将秀丽线虫转移到含有60 μ L的K-缓冲液的琼脂平面上，待其恢复I分钟后测试其在后一分钟内头部摆动次数。一次成功的头部摆动定义为其头部摆动方向改变，并改变必须转过其身体朝向方向。
[0009]身体弯曲的测试是将秀丽线虫转移到没有食物新琼脂培养基上记录其在20秒内身体弯曲的次数，一次成功的身体弯曲定义为以身体形成的S型中轴线为轴，向前行进一个正弦波形的过程。
[0010]生殖能力通过后代数量来评价。秀丽线虫在进入成虫时期后将其转移到含有食物的新板上进行统计，每2天转新板一次,直到没有后代产生为止,计算所有板上所得后代数量的总和。每个处理进行3次重复实验。
[0011]发育通过秀丽线虫体长来进行评价。其长度主要是通过制片，利用显微镜照相后，运用photoshop统计其身体从头部到尾部中轴线长度。每个处理进行3次重复实验。
[0012]秀丽线虫体内的肠道自发荧光是因为随着组织衰老诱发的脂褐质积累而产生的。观察这种荧光主要是通过制片，利用显微镜照相，这种内生性的荧光可以波长为525nm带滤器、无自动增益装置的荧光激发。为了防止外界光源变化对荧光的影响，所有照相工作均在同一天完成。每个秀丽线虫的肠道自发荧光照片通过荧光显微镜下观察，并用Magnafire?(Olympus, Irving, TX, USA)软件取得照片,然后运用ImageJ (NIH Image)软件通过计算平均像素密度来反应秀丽线虫体内脂褐质积累水平。每个处理进行20次重复实验。
[0013]为了确定瘦肉精能否引起严重的体内氧化应激,对秀丽线虫体内ROS水平进行了检测。受试秀丽线虫被转移到还有I μ g/L的M9缓冲液中20°C孵育3小时，然后转移到含2%琼脂平面上，利用激光扫描共聚焦显微镜于488nm激发波长和510nm发射过滤器激发秀丽线虫产生荧光并照相记录。对所激发的荧光强度进行半定量分析，其荧光的强弱反映了体内ROS水平，其强度表示为相对荧光单位(RFU)。每个处理进行20次重复实验。
[0014]在对瘦肉精(莱克多巴胺)毒性效应评价时，暴露的时期可以选择从其LI幼虫期到成虫时期young adult。因为对于环境相关剂量的瘦肉精致秀丽线虫的毒性效应还没有进行过系统的研究，将秀丽线虫从LI幼虫期到成虫时期暴露于不同浓度的瘦肉精(莱克多巴胺)溶液中，以存活率、发育和生殖作为评价终点对其毒性进行评价，进而能够利用秀丽线虫检测出莱克多巴胺。
【主权项】
1.一种利用秀丽线虫检测莱克多巴胺的方法，将秀丽线虫放置在含有表面涂布有大肠杆菌0P50的NGM琼脂培养基的3cm培养皿上，加入莱克多巴胺暴露溶液使其均匀分布于培养基表面，置于20°C培养箱中培养直至秀丽线虫成长到young adult时期,其特征是: a、观察安置在莱克多巴胺中的秀丽线虫的存活率，利用跳针刺激培养基上的秀丽线虫观察秀丽线虫的死亡和麻痹的数目； b、观察秀丽线虫的头部摆动频率、身体弯曲频率和向前运动频率3个方面； C、秀丽线虫在进入成虫时期后将其转移到含有食物的新板上进行统计，每2天转新板一次，直到没有后代产生为止，计算所有板上所得后代数量的总和； d、对秀丽线虫体长来进行评测； e、利用显微镜照相观察秀丽线虫体内的肠道自发荧光量； f、对秀丽线虫体内ROS水平进行了检测。
【专利摘要】本发明涉及莱克多巴胺毒性检测技术领域，尤其是一种利用秀丽线虫检测莱克多巴胺的方法。一种利用秀丽线虫检测莱克多巴胺的方法，观察安置在莱克多巴胺中的秀丽线虫的存活率，观察秀丽线虫的活动率，对秀丽线虫体发育进行评测，观察秀丽线虫衰老状况，对秀丽线虫体内ROS进行了检测。这种利用秀丽线虫检测莱克多巴胺的方法，观察安置在含有莱克多巴胺的培养基上的秀丽线虫，观察秀丽线虫的存活率、运动能力、发育情况、繁殖能力、衰老速度和体内氧化应激，来确定莱克多巴胺对秀丽线虫的毒性，并且记录数据后，就能利用秀丽线虫对猪肉中是否含有莱克多巴胺进行检测，如果在受检测的样本上的数据与实验数据较为吻合就能确定是否含有莱克多巴胺。
【IPC分类】G01N33-12, G01N21-64
【公开号】CN104880438
【申请号】CN201410071524
【发明人】刘海翠
【申请人】常州秀丽生物科技有限公司
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2014年2月28日