抗莱克多巴胺的抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及抗莱克多巴胺的抗体，及其在制备检测莱克 多巴胺的ELISA试剂盒、胶体金试纸卡的应用。
【背景技术】
[0002] "瘦肉精"是一类属于肾上腺类神经兴奋剂药物。其能使牲畜在代谢过程中促进蛋 白质合成，加速脂肪的转化和分解，继而提高牲畜的生长速度，增加瘦肉率；同时还能减少 饲料使用、使肉品提早上市、降低成本。国务院食品安全委员会办公室《"瘦肉精"专项整治 方案》（食安办[2011]14号）规定的"瘦肉精"品种目录为：盐酸克伦特罗（(：1 611131^虹〇1 Hydrochloride)、莱克多巴胺（Ractopamine，Rac)、沙丁胺醇（Salbutamol)等。其中，莱克 多巴胺（Rac)易在动物组织，特别是内脏中积聚残留，并通过食物链进入人体。继而引起骨 骼肌收缩增强，破坏快缩肌和慢缩肌纤维间的融合现象，引发肌肉震颤，出现面色潮红、头 痛、头晕、胸闷、心悸、四肢麻木等不良反应，严重的可能危及生命。许多国家都将莱克多巴 胺列为违禁物，我国已禁止在畜禽身上使用莱克多巴胺。
[0003]目前，国内外用于检测莱克多巴胺的常用方法有：酶联免疫吸附测定法（ELISA)、 胶体金免疫层析法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用、色谱法、毛细管电泳法、免疫传 感器法等。色谱法、毛细管电泳法、免疫传感器法检测灵敏，但所需的仪器设备昂贵，样品前 处理复杂，一次检测样品量少，检测时间长，且不易普及，而ELISA、胶体金免疫层析法不需 要借助昂贵的仪器，且样品前处理简单，具有高通量等优点。但目前已有的检测莱克多巴胺 的酶联免疫试剂盒或胶体金试纸卡的检测灵敏度或准确度还不是十分理想，分析其原因， 主要在于所采用的抗莱克多巴胺抗体还有待提高。由于莱克多巴胺为化学小分子，其表面 位点少，因而为制备其抗体带来了较大的困难，尤其是特异性较高的抗体，目前市用抗体的 特异性普遍较低，半数抑制浓度（IC50)较高，无法满足应用的需求。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在提供能有效的、特异性结合莱克多巴胺（Rac)的抗体，及其检测莱克 多巴胺（Rac)在动物体内残留的用途。更具体地说：
[0005] 本发明第一个目的是提供一种抗体，所述抗体特异性结合莱克多巴胺（Rac)，所述 抗体包括：
[0006] 重链可变区，其氨基酸序列含有以下的互补决定区：如序列SEQ ID N0 :2所示的 HCDR1、如序列SEQ ID N0 :3所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID N0 :4所示的HCDR3 ;
[0007] 以及轻链可变区，其氨基酸序列含有以下的互补决定区：如序列SEQ ID N0 :6所 示的LCDR1、如序列SEQ ID N0 :7所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID N0 :8所示的LCDR3。
[0008] 优选的是本发明中的抗体含有氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的重链可变区和氨 基酸序列如SEQ ID N0:5所示的轻链可变区。
[0009] 更优选的本发明中抗体的编码基因含有如SEQ ID N0:9所示的重链可变区和如 SEQ ID NO: 10所示的轻链可变区。
[0010] 本发明第二个目的是提供一种单链抗体，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。优选的，所述单链抗体中不含由六个组氨酸构成的HIS标签。
[0011] 本发明第三个目的是提供一种编码上述单链抗体的核苷酸序列，所述核苷酸序列 如 SEQ ID N0:12 所示。
[0012] 本发明第四个目的是提供一种含有上述核苷酸序列的表达载体。
[0013] 本发明第五个目的是提供一种含有上述表达载体的重组宿主细胞，所属宿主细胞 可以是大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞，优选为毕赤酵母。
[0014] 本发明第六个目的是提供一种生产上述抗体的方法，包括：
[0015] 1)在合适的条件下培养上述重组宿主细胞表达抗体；
[0016] 2)然后从宿主菌中纯化、收集抗体。
[0017] 本发明第七个目的是提供上述抗体用于检测莱克多巴胺（Rac)残留的新用途。
[0018] 本发明第八个目的在于提供一种检测莱克多巴胺的胶体金试纸卡或ELISA试剂 盒，所述胶体金试纸卡或ELISA试剂盒含有上述所述抗体。
[0019] 优选的，上述所述ELISA试剂盒，包括：包被了抗原莱克多巴胺的载体蛋白偶联物 的酶标板、含有上述所述抗体的抗体工作液、酶标物、莱克多巴胺标准液、显色液、终止液、 浓缩洗涤液。更优选的，所述载体蛋白为BSA、OVA、KLH。
[0020] 优选的，上述所述抗体工作液是用酶稀释液将上述抗体稀释得到，所述酶稀释液 是0. 01M的PBST (pH7. 4)缓冲液，其中含有质量体积比为0. 335%的Na2HP04 ·12Η20、0. 02% NaH2P04 · 2Η20、0· 8% NaCl、0. 02% KC1、0. 1% Casein、。· 05% BSA。
[0021] 优选的，上述所述酶标物为抗His抗体-HRP、抗His抗体-AP、Protein L-HRP或 Protein L-APo
[0022] 优选的，上述所述显色液为TMB显色液或BCIP/NBT显色液。
[0023] 优选的，上述所述终止液为2M的H2S04。
[0024] 优选的，上述所述浓缩洗涤液为含0· 05% TWEEN-20的0· 2M PBS。
[0025] 本发明的第九个目的在于提供一种检测莱克多巴胺的方法，包括以下步骤：
[0026] 1.编号：将样本和标准品对应的微孔按序编号，每个样本及标准品设复孔平行；
[0027] 2.加样：按序每孔加入标准品、样本、酶标物以及抗体工作液，于室温避光反应；
[0028] 3.洗板：反应后，洗板并干燥处理；
[0029] 4.显色：加入显色液，于室温避光反应；
[0030] 5.终止及读数：加入终止液，测定每孔0D值。
[0031] 6.结果判定：
[0032] i).定性判定：由样品孔的吸光率与标准品孔的吸光率的简单对比而来判定：样 品孔的颜色比某一标准品孔的颜色浅则样品中莱克多巴胺的浓度比该孔所含标准品的浓 度高，样品孔的颜色比某一标准品孔的颜色深则样品中莱克多巴胺的浓度比该孔所含标准 品的浓度低；
[0033] ii).定量分析：以标准品的吸光度平均值与第一个标准（Oppb)的吸光度值的百 分比为纵坐标，以莱克多巴胺标准品的浓度（ppb)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样 本的吸光度平均值与第一个标准（Oppb)的吸光度值的百分比代入标准曲线中，从而计算 出样本中莱克多巴胺的实际浓度。
[0034] 本发明的第十个目的在于提供一种检测莱克多巴胺的胶体金试纸卡，包括样品垫 1、金标垫6、硝酸纤维素膜2、吸收垫3、衬板7,样片垫1、金标垫6、硝酸纤维素膜2、吸收垫 3两两相邻并部分层叠从左至右依次粘贴于衬板7上，所述硝酸纤维素膜2上有质控带4 (C 线）和检测带5 (T线），所述金标垫6内含有经胶体金标记的上述抗莱克多巴胺抗体。
[0035] 优选的，质控带4位置包被有抗His抗体或Protein L，检测带5位置包被有莱克 多巴胺半抗原与载体蛋白的偶联物。
[0036] 本发明所提供抗体制备的ELISA检测试剂盒和胶体金试纸卡的灵敏度和准确度 相比市售产品更加理想，并且特异性很好。
【附图说明】
[0037] 图1.抗体K07重链、轻链可变区基因电泳图。条带1为标准DNA，条带2为K07抗 体重链可变区DNA，Lane3为K07抗体轻链可变区DNA
[0038] 图2.抗体K07结构示意图。VH表示重链可变区序列，^表示轻链可变区序列，His 标签为六个组氨酸。
[0039] 图3.抗体表达PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0040] 图4.重组毕赤酵母菌株诱导表达上清培养液鉴定图。图a为SDS-PAGE电泳鉴定 图、图b为Western blot鉴定图。
[0041] 图5.抗体纯化效果图（SDS-PAGE)。条带1-10为不同收集管所获的抗体K07。
[0042] 图6.抗体K07的Western Blot鉴定图。泳道1为标准蛋白质、泳道2为Rac-BSA、 泳道3为Rac-OVA、泳道4为Cle-BSA、泳道5为Cle-OVA、泳道6为Sal-BSA、泳道7为 Sal-0VA〇
[0043] 图7.本发明莱克多巴胺的ELISA检测试剂盒的标准曲线。其中横坐标为莱克多 巴胺标准品浓度对数（lg);纵坐标为莱克多巴胺标准品百分吸光率。
[0044] 图8.本发明莱克多巴胺胶体金检测试纸卡结构示意图。
[0045] 其中1为样品垫、2为硝酸纤维素膜、3为吸收垫、4为质控线（C线）、5为检测线 (T线）、6为金标垫、7为衬板 具体实施例
[0046] 定义
[0047] "抗体"又称免疫球蛋白，是一类由B淋巴细胞分泌的大型Y形蛋白质，能够通过Y 形的其中两个分叉顶端的互补位点（抗原结合位）特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子， 所述靶抗原如蛋白质、糖、多核苷酸、脂、多肽、小分子化合物等。该术语不仅包括完整的多 克隆抗体，也包括其片段（例如Fab、Fab'、F(ab'） 2、Fv)、单链抗体（single chain antibody fragment，scFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白和任一包含抗原识别位点的其他改 变构型的免疫球蛋白分子。抗体包括任一类或多类的抗体，如IgG、IgA、IgD、IgE或IgM(或 其亚类），并且抗体不需要为任一特定类。
[0048] "单链抗体