用于检测和测定连翘苷的抗体、方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及小分子半抗原的抗体及其制备方法与应用，特别是涉及连翘苷及其衍 生物的抗体及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 本发明涉及用于检测和定量连翘苷的方法和试剂盒，以及其中使用的半抗原、免 疫原、偶联物（conjugate)和抗体。
[0003] 其中"检测"是指定性分析物质是否存在。
[0004] 其中"测定"是指对物质进行定量分析。
[0005] 连翘苷，来源于木犀科植物连翘的干燥果实的提取物。
[0006] 分子式：C27H340n 分子量：534. 56
[0007] 连翘苷属于双环氧木脂素类化合物的葡萄糖苷，熔点184°C~185°C。
[0008] 研究表明，连翘苷显示多种生物学活性和药理作用。具有具有抗炎解热，抗氧化， 降血脂，保肝及神经保护等多种药理活性。
[0009] 目前建立了多种连翘苷的定性与定量检测和测定分析方法，如薄层层析法、HPLC 法，HP LC-MS法等。其中最常用的方法是高效液相色谱法。但含连翘苷的生物样品（包括 血浆、尿、唾液等）含有大量的影响含量测定的蛋白质及内源性物质；同时连翘苷可能呈结 合状态，必须经过处理，排除内源性杂质和代谢物的干扰，使结合状态的连翘苷游离后才能 测定；同时还需要浓缩以满足仪器检测灵敏度的要求，处理程序复杂，费时费力；另外由于 连翘苷进入体内后，组织中的分布是极其微量的，即使经过富集，进行含量测定仍是极其困 难的。最后，对于连翘苷在靶器官和组织中分布，以及细胞和亚细胞定位的研究，需要通过 免疫组织化学和westblot等方法，但由于缺乏连翘苷的抗体，阻碍了此方面的研究。因此， 有必要开发出一种用于检侧和测定生物样品中连翘苷的方法，对阐明相关药材或复方的作 用机理，以及其体内分布和代谢研究，将具有特别的价值。
【发明内容】
[0010] 本发明的半抗原连翘苷可提供确定的结构性抗原决定部位，但是它本身并不具备 免疫原性，因此必须要偶联到适宜的赋予抗原性的载体物质上，这样所形成的免疫原才会 在注射到宿主动物体内后诱发免疫应答。因此，本发明提供一种如下结构的免疫原：
[0011]
[0012] 其中R是0至6个碳的烷基桥（连接半抗原与载体物质的桥），优选R = 0,即PI 直接与连翘苷氧化后的醛基结合，或R是C1-C6取代或未取代的、直链或支链的、饱和或不 饱和的亚烷基，更优选R是C1-C4未取代的、直链的、饱和的亚烷基。
[0013] P1是赋予抗原性的载体物质。载体物质选自蛋白质、蛋白质片合成的多肽或半 合成的多肽。其中蛋白质、蛋白质片段选自白蛋白、血清蛋白、球蛋白、目镜蛋白和脂蛋白， 优选为牛血清白蛋白、卵清蛋白、牛丙种球蛋白、甲状腺素结合球蛋白、锁眼形血蓝蛋白 (keyhole limpet haemocyanin，KLH)，更优选自锁眼形血蓝蛋白或牛血清蛋白（BSA)。合 成多肽或半合成多肽是具有足够数量的可利用氨基的合成聚氨基酸，优选多聚赖氨酸。合 成或天然聚合物是带有反应官能基的聚合物材料，特别是能够结合到半抗原产生免疫原的 碳水化合物、酵母或多糖。
[0014] 半抗原的制备本发明描述了半抗原连翘苷的糖苷结构中的两个邻羟基经过过 碘酸钠氧化为醛基从而与载体物质发生的偶联作用，产生免疫原。偶联物成功制备并纯化 后分别经质谱（MS)和核磁共振氢谱和碳谱（1HNMR和13CNMR)确证。
[0015] 免疫原的合成本发明的半抗原和蛋白质载体的连接可使用本领域己知的任何 连接方式。例如过碘酸盐氧化法等。采用过碘酸氧化法制备免疫原时，是将5毫克的半抗 原连翘苷溶解在lml 20%甲醇中，加入含有8毫克的过碘酸钠溶液1毫升，室温下反应一个 小时，缓慢滴加到10_20mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，搅拌反应6小时，装入透析 袋，分别用蒸馏水和〇. Olmol/L的CBS缓冲溶液透析3-5d，分装保存于-20°C的冰箱中。
[0016] 合成免疫原的分析方法为了确认载体物质上结合有适当的半抗原，在免疫前， 使用紫外分光度法或矩阵辅助紫外激光解析/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS)对每个 免疫原进行评估。连翘苷免疫原反应物和产物的吸收峰相比（200nm-400nm)，可判断是否偶 合，并根据反应物和产物的摩尔吸光系数计算偶联物与半抗原的比例。
[0017] 使用voyager STR生物分光度测量方法研究站激光解析质谱与延迟萃取结合进行 MALDI-T0F质谱。将每个要分析的等分试样在0. 1%的三氟乙酸水溶液中稀释制成lmg/ml 的试样溶液。使用芥子酸基质和牛血清白蛋白作为外标分析等分试样（luL)。
[0018] 对于优选的载体物质，牛血清白蛋白或KLH而言，优选半抗原与蛋白质的结合比 为 6-15 : 1。
[0019] 第二方面，免疫检测时需要将连翘苷与标记试剂进行偶合。因此，本发明提供一种 如下结构的偶合物；
[0020]
[0021 ] 其中R是0至6个碳的烷基，P2是可检测的标记试剂，标记试剂选自酶、发光物质、 放射性物质或它们的混合物，更优选地标记试剂是过氧化物酶。最优选地标记试剂是辣根 过氧化物酶（HRP)。发光物质选自生物发光物质、化学发光物质或荧光物质。
[0022] 偶合物的合成本发明的半抗原和蛋白质载体的连接可使用本领域己知的任何 连接方式。例如过碘酸盐氧化法等。采用过碘酸氧化法制备免疫原时，是将5毫克的半抗 原连翘苷溶解在lml 20%甲醇中，加入含有8毫克的过碘酸钠溶液1毫升，室温下反应一 个小时，离心，取上清液加入到10-20mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，搅拌反应6小 时，装入透析袋，分别用蒸馏水和0.0 lmol/L的CBS缓冲溶液透析3-5d，分装保存于-20°C 的冰箱中。
[0023] 另一方面，本发明涉及对于本发明第一方面的免疫原产生的抗体，这些抗体能够 至少与一个连翘苷结构上的表位结合，优选与完整的连翘苷结构表位相结合，该抗体是多 克隆的，或是单克隆的，优选为单克隆抗体，且具有对连翘苷的特异性的抗体。
[0024] 免疫检测时要将该抗体固定在支撑底物上。优选地，该方法进一步包括将所述血 清抗体固定到支撑底物上，优选固体支持物，最优选聚苯乙烯固体支持物。
[0025] 本发明进一步提供一种制备抗体的方法，该方法包含通过重复给予根据本发明的 连翘苷的免疫原免疫动物，优选脊稚动物，最优选哺乳动物，并收集从免疫动物得到的血清 的步骤。
[0026] 另一方面，本发明包括在试样中检测或测定连翘苷的方法，该方法包括用本发明 的偶合物或其混合物和本发明的抗体或其混合物接触试样；检测或测定结合的缀合物的数 量；并且从标准曲线推断试样中连翘苷的的存在或数量。
[0027] 另一方面，本发明还描述了如何将针对这种免疫原产生的抗体用于开发可用来检 测和测定连翘苷的存在的通用分析方法和相应的试剂盒。该试剂盒包括用本发明的偶合 物或其混合物和本发明的抗体或其混合物，同时该试剂盒可以任意地包括应用所述缀合物 和所述抗体在试样中检测或测定连翘苷的指导。优选地，试样是溶液，如生物流体。更优选 地，试样是血清或尿。在本发明的方法和试剂盒中，首选各自不同的交联剂（免疫原的和偶 合物的）。
[0028] 另一方面，本发明包括使用本发明的偶合物或其混合物和本发明的抗体或其混合 物在试验试样如生物流体中检测或测定连翘苷。
[0029] 为了产生多克隆抗血清，将免疫原与Freund佐剂混合，并且将混合物注射入宿主 动物体内，如兔、羊、鼠或马。进一步注射（加强）并取血清试样评价抗体滴度。达到最佳 滴度时，随后将宿主动物放血得到适当体积的特异性的抗血清。要求的抗体纯化水平视计 划的应用而定。对于许多目的，根本不需要纯化，但是，在其它情况下，例如抗体固定在固体 载体上，纯化步骤能够除去不想要的物质和除去非特异性的结合。本发明特异性抗体作为 试剂在免疫试验中用于测定或检测生物流体中的连翘苷的含量是需要纯化的。
[0030] 单克隆抗体的制备本发明所述单克隆抗体是指获自基本上同源的抗体群的抗 体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。
[0031] 本发明的抗体可以通过本领域内技术人员己知的各种技术进行制备。例如，本 发明完全抗原，可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交 瘤技术来制备或可用重组DNA法制备。骨髓瘤细胞可选鼠类的骨髓瘤细胞系，包括衍生自 M0PC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞系以及SP-2/0、ΝΖ0或X63-Ag8-653细胞，以及 人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系。
[0032] 对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗 体的产生，如通过体外结合分析，例如酶联免疫吸附分析（ELISA)或放射免疫分析（RIA)。 表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限