稀释步骤形成 亚克隆，并通过标准方法生长。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM 或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。
[0033] 由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中，通过常规的免疫球蛋白纯 化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为蛋白A-琼脂糖法（protein A-Sepharose)、羟基 磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等等。
[0034] 本发明的一个优选的方案中，连翘苷单克隆抗体采用Balb/C小鼠腹水生产单克 隆抗体的方法制备。将约10 6-107杂交瘤细胞接种到致敏的小鼠腹腔内，2-4周内可见腹 部明显胀大。抽取腹水，经饱和硫酸按沉淀法粗提出IgG，再将粗提的抗体经亲和层析柱 (Protein G-Sephrose)纯化。
【具体实施方式】
[0035] 实施例1
[0036] 5毫克的半抗原连翘苷溶解在1ml 20%甲醇中，加入含有8毫克的过碘酸钠溶 液lml，室温下反应一个小时，加入到10-20mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，搅拌反 应6小时，装入透析袋，分别用蒸馏水和0.0 lmol/L的CBS缓冲溶液透析3-5d，分装保存 于-20°C的冰箱中。
[0037] 实施例2
[0038] 5毫克的半抗原连翘苷溶解在1ml 20%甲醇中加入含有8毫克的过碘酸钠溶液 lml，室温下反应一个小时，加入到10-20mg/mL的卵清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，搅拌反应6 小时，装入透析袋，分别用蒸馏水和0. 01m〇l/L的CBS溶液透析3-5d，分装保存于-20°C的 冰箱中。
[0039] 实施例3
[0040] 制备方法同实施例1，只是将牛血清白蛋白（BSA)换成KLH，制得连翘苷-KLH完全 抗原120mg。
[0041] 实施例4
[0042] 免疫原（FRN-BSA、FRN-KLH)按常规方法各免疫了三只兔子。从加强免疫第二次开 始，在每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血，血清经适当稀释后用间接ELISA测定效价。 待第4次免疫时，兔子获得了高效价的抗体，经纯化制成冻干粉后的效价为20000 : 1。
[0043] 实施例5
[0044] 先将连翘苷抗原与弗氏佐剂乳化，用PBS将完全抗原连翘苷-KLH配制成lmg/ml 的溶液，然后将完全抗原溶液与弗氏佐剂等体积混合，用高速震荡器震荡形成均匀乳浊液， 将此乳浊液用于动物的免疫。选择6周龄的小鼠进行注射免疫。取6周龄的健康Balb/C小 鼠5只，在第0天，每只腹腔注射完全弗氏佐剂乳化抗原100uL。第14天，再对每只小鼠腹 腔注射不完全弗氏佐剂乳化抗原l〇〇uL。第21天，以摘小鼠眼球法采血，用ELISA方法检测 血清中抗体效价（滴度）。第28天，再次腹腔注射不完全弗氏佐剂乳化抗原100uL。在细 胞融合反应前一周，用100ug/100ul抗原生理盐水再次加强免疫。采血后经测定，所得抗血 清效价为1 : 20000。细胞融合操作3天后检查细胞融合情况，8天后加 HT'完全培养基， 每孔加入lml。在12天间，就可以观察到杂交细胞的克隆。当克隆直径长到约1_时，用人 连翘苷-BSA包被的酶联板来筛选出抗连翘苷的杂交瘤细胞。筛选到的阳性克隆用有限稀 释法进行克隆化，以FRN-BSA包被的ELISA法酶标板来筛选抗连翘苷的特异性杂交瘤细胞。 经五次克隆后，得到一株能分泌专一性抗体的抗连翘苷单克隆细胞。
[0045] 实施例6
[0046] 取实施例4中经过4次免疫的小鼠，用连翘苷-BSA包被的酶联板测定抗血清的 滴度。将包被抗原以l〇ug/ml稀释于pH 9. 6的0. 05M碳酸盐缓冲液中，100ul/孔加入 到96孔酶标板于4°C过夜。弃去包被液后用1%明胶/PBS在37°C下封闭2小时，然后用 PBS-Tween-20洗液洗板3遍，再加入稀释后的连翘苷抗血清，置于37°C孵育1小时。用 PBS-Tween-20洗液洗板3遍，加入1 : 2000的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG多抗，37°C 孵育1小时后用PBS-Tween-20洗液洗板3遍，加 TMB/H202底物进行显色10min，并用终止 液（0· 1M硫酸）终止显色。
[0047] 在450nm光波长下测定吸收值（0D)，与空白对照孔的0D均值比较，采用计量资料 的t检验，取P < 0. 05的最低稀释度作为此抗体的效价。经比色测定，所得连翘苷抗血清 的效价为1 : 20000。
[0048] 实施例7
[0049] 融合效率分析用CFSE绿色荧光预标记的淋巴细胞显绿色，用PE标记的抗小鼠 B220单克隆抗体预标记的SP2/0细胞显红色，两种细胞融合形成的杂交瘤细胞带有双色荧 光。经流式细胞仪测定分析双荧光细胞比例，用于反映融合效率。实验中，PE标记抗小鼠 B220单克隆抗体预标记的SP2/0 (骨髓瘤）细胞，CFSE绿色荧光预标记淋巴细胞，带有双色 荧光即为杂交瘤细胞。本实验体系中脾细胞和SP2/0的最初融合效率约为40% ELISA法测 定阳性率为10%。
【主权项】
1. 一种如下通式的免疫原：其中R是〇至6个碳的烷基桥（连接半抗原与载体物质的桥），Pl是赋予抗原性的载 体物质。2. 根据权利要求1的免疫原，R = 0,即Pi直接与芍药苷氧化后的醛基结合。3. 根据权利要求1的免疫原，R是C1-C6取代或未取代的、直链或支链的、饱和或不饱 和的亚。4. 根据权利要求1或3的免疫原，R是C1-C4未取代的、直链的、饱和的亚烷基。5. 根据权利要求1的免疫原，其中载体物质为蛋白质、蛋白质片段、合成或天然多肽或 半合成多肽、合成或天然聚合物。6. 根据权利要求1或5的免疫原，其中蛋白质、蛋白质片段选自白蛋白、血清蛋白、球蛋 白、和脂蛋白。7. 根据权利要求1或5的免疫原，其中蛋白质、蛋白质片段选自牛血清白蛋白、卵清蛋 白、牛丙种球蛋白、甲状腺素结合球蛋白、锁眼形血蓝蛋白（keyhole limpet haemocyanin， KLH)等。8. 根据权利要求1或5的免疫原，其中合成或天然多肽或半合成多肽是具有足够数量 的可利用氨基的合成聚氨基酸。9. 根据权利要求1或5的免疫原，其中合成或天然聚合物选自碳水化合物、酵母或多 糖。10. 抗如权利要求1至9的免疫原的抗体，其中抗体能与完整的芍药苷中的至少一种结 构性抗原决定部位结合。11. 如权利要求10的抗体，其中当抗原固定在支持底物上，特别是聚苯乙烯固体支持 物时，抗体可以与其特异性结合。12. 制备如权利要求10或11中的抗体的方法，该方法包括将如权利要求1至9的免疫 原重复给予动物而使动物免疫，以及从免疫动物中收集所得到的血清抗体；以及利用免疫 学上可接受的细胞系与产生抗体的免疫动物单克隆细胞系融合后产生的细胞系，所制备的 单克隆抗体。13. 如权利要求12的方法，其中该方法还包括将所述血清抗体固定在支持底物上。包 括如权利要求1至3中任一项的半抗原与可检测到的标记物共价结合的偶联物。14. 一种如下结构的偶合物：其中R是0至6个碳的烷基，P2是可检测的标记试剂。15. 根据权利要求14的偶合物，标记试剂选自酶、发光物质、放射性物质或它们的混合 物。16. 根据权利要求14或16的偶合物，标记试剂是过氧化物酶。17. 根据权利要求16的偶合物，标记试剂是辣根过氧化物酶（HRP)。18. 根据权利要求14或15的偶合物，发光物质是生物发光物质、化学发光物质或荧光 物质。19. 用于检测和定量样品中连翘苷的方法，该方法包括将供试样品和如权利要求14至 18中任一项的偶联物或其混合物，与如权利要求10或11的抗体或其混合物接触；检测或 定量结合的偶联物；以及从校准曲线中推出样品中连翘苷的存在或含量。20. 用于检测和定量连翘苷的试剂盒，该试剂盒包括如权利要求14至18中任一项的偶 联物或其混合物，以及如权利要求10或11的抗体或其混合物。
【专利摘要】本发明提供包括连翘苷或其衍生物的半抗原，与赋予抗原性的载体物质结合的前述半抗原的免疫原，与标记试剂结合的前述半抗原的偶联物(包被原)，以及抗前述免疫原的抗体，该抗体能与完整的连翘苷中的至少一种结构性抗原决定部位结合。本发明还提供用于检测或定量样品中连翘苷的方法和试剂盒，以及前述偶联物和前述抗体在检测或定量连翘苷中的用途。本发明对连翘苷具有特异性，可用于样品中检测连翘苷的存在和测定连翘苷的含量。
【IPC分类】C09K11/06, C07K16/16, C07K14/435, C07K14/765, C07H17/07, C07H1/00, C07K16/06, G01N33/53, C07K14/795, C07K14/77, G01N33/577
【公开号】CN105440128
【申请号】CN201410521402
【发明人】赵琰, 屈会化, 王庆国, 胡文婷, 任雅君, 张越, 孙晔, 赵妍, 冯会宾, 李长香
【申请人】北京中医药大学
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年9月30日