生物法制备16,17α‑环氧黄体酮的方法与流程

本发明涉及甾体类药物中间体的生产方法，具体来说是利用微生物发酵3-羟基-5烯-16,17α-环氧物制备16,17α-环氧黄体酮的方法。

背景技术：

16,17α-环氧黄体酮作为中间体应用于几乎所有甾体激素包括地塞米松、倍他米松、6α-甲基氢化泼尼松、泼尼松、氢化泼尼松等产品的制造。甾体激素类药物是仅次于抗生素的一类重要药物，具有抗炎、抗免疫、避孕、抗癌、调节内分泌等多种作用,广泛应用于风湿、心血管病、胶原性病症、淋巴白血病、人体器官移植、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调、老年性疾病、激素依赖性肿瘤等疾病的治疗。

目前16,17α-环氧黄体酮的制备方法，国内外报道均采用传统的化学法制造，化学反应路线如下所示：

环氧反应

Oppenauer氧化

以双烯孕酮醋酸酯为原料经双氧水氧化形成3-羟基-5烯-16,17α-环氧物，通过Oppenauer氧化使3-羟基-5烯转变成3-酮-4烯结构，再经水蒸汽蒸馏、萃取、浓缩、精制等最终获得16,17α-环氧黄体酮。该工艺水平的限制性因素在于Oppenauer氧化的有效反应较低，造成了反应过程副产物多，影响了转化率和收率，目前，投入100Kg双烯孕酮醋酸酯,仅能获取70～73Kg 16,17α-环氧黄体酮，再加上，传统化学工艺使用大量的有机溶剂、反应条件剧烈，而且不得不采用水蒸汽蒸馏装置，造成能耗大、排放高，致使16,17α-环氧黄体酮的Oppenauer氧化反应已成为整个甾体药物工业发展的瓶颈，因此提供一种能够提高16,17α-环氧黄体酮收率，并且反应温和、能够实现绿色制造的方法已成为亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明就是提供一种反应条件温和、绿色环保，并且能够提高16,17α-环氧黄体酮收率的微生物发酵3-羟基-5烯-16,17α-环氧物制备16,17α-环氧黄体酮的方法。

本发明的反应路线如下：

生物法制备17α-环氧黄体酮的方法，以3-羟基-5烯-16,17α-环氧物为底物，经简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94一步发酵制备16,17α-环氧黄体酮。本发明的简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94来自中国科学院微生物研究所。

所述的生物法制备16,17α-环氧黄体酮的方法，1L水中,发酵培养基还含有以下成分：葡萄糖10～15g,酵母提取物3～5g，玉米浆30～40g，磷酸二氢钾0.8～1.2g，泡敌0.1～0.3g。

所述的生物法制备16,17α-环氧黄体酮的方法，1L水中,发酵培养基由以下成分组成：葡萄糖10g,酵母提取物3g，玉米浆30g，磷酸二氢钾0.8g，泡敌0.1g。

所述的生物法制备16,17α-环氧黄体酮的方法，发酵培养基的初始pH5.8～8.0。

所述的生物法制备16,17α-环氧黄体酮的方法，简单节杆菌的接种量为10～15％。

所述的生物法制备16,17α-环氧黄体酮的方法，简单节杆菌的接种量为10％。

本发明的简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94通过常规的斜面培养和种子培养，得到转化或发酵用菌。

斜面培养

斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，琼脂粉20g/L。

培养条件：33±1℃

培养时间：48h

种子培养

种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，玉米浆12g/L，磷酸二氢钾2.5g/L。

无菌生理盐水洗斜面培养物，制成菌悬液，菌体浓度大于1.0×108CFU/ml，2.5m³种子罐，接种量1％，转速120r/min，通风1:0.5。种子罐压力0.05MPa，培养时间22h。

所述的生物法制备16,17α-环氧黄体酮的方法，1L水中，发酵底物3-羟基-5烯-16,17α-环氧物2.5g，发酵培养基由以下成分组成：葡萄糖10g,酵母提取物3g，玉米浆30g，磷酸二氢钾0.8g，泡敌0.1g，在通风机械搅拌发酵罐中配置发酵液，调节初始pH 5.8，蒸汽灭菌，冷却至33±1℃，按照10％接种量在无菌条件下接种种子培养液于发酵罐的发酵液中，发酵罐转速80r/min，通风量1:0.5，培养时间72h，转化完毕，90℃发酵液灭活，冷却到室温，板框压滤，滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，即16,17α-环氧黄体酮。

本发明的有益效果：与传统的化学法制备16,17α-环氧黄体酮相比较，本发明提供的一种生物法制备16,17α-环氧黄体酮的方法具有以下优点，

1)本发明以3-羟基-5烯-16,17α-环氧物为底物，利用简单节杆菌生物发酵制备16,17α-环氧黄体酮，反应条件温和，发酵过程中不使用危险化学品原料，如异丙醇铝、环己酮、甲苯等，实现了16,17α-环氧黄体酮的绿色制造。

2)本发明简单节杆菌生物发酵制备16,17α-环氧黄体酮的方法，所得16,17α-环氧黄体酮的收率大于90％，纯度大于98.5％，而传统的化学法，在相同的纯度下，16,17α-环氧黄体酮的收率仅为70～73％。

附图说明：

图1所示为本发明制备的16,17α-环氧黄体酮结构紫外光谱鉴定；

图2所示为本发明制备的16,17α-环氧黄体酮结构红外光谱鉴定；

图3所示为本发明制备的16,17α-环氧黄体酮ESI-MS质谱图；

图4所示为本发明制备的16,17α-环氧黄体酮核磁共振H谱；

图5所示为本发明制备的16,17α-环氧黄体酮核磁共振C谱。

具体实施方式：

为了更好地理解本发明，下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。相关技术人员应理解，对本发明的技术特征所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。

实施例1

本发明的简单节杆菌Arthrobacter simplex AS1.94来自中国科学院微生物研究所，通过斜面培养和种子培养，得到转化或发酵用菌。

斜面培养

斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，琼脂粉20g/L。

培养条件：33±1℃

培养时间：48h

种子培养

种子培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，玉米浆12g/L，磷酸二氢钾2.5g/L。

无菌生理盐水洗斜面培养物，制成菌悬液，菌体浓度大于1.0×108CFU/ml，2.5m³种子罐，接种量1％，转速120r/min，通风1:0.5。种子罐压力0.05MPa，培养时间22h。

按照1L水中，发酵底物3-羟基-5烯-16,17α-环氧物2.5g，1L水中,发酵培养基由以下成分组成：葡萄糖10g,酵母提取物3g，玉米浆30g，磷酸二氢钾0.8g，泡敌(消泡剂GPE，江苏斯德瑞克化工有限公司)0.1g，在25m³的通风机械搅拌发酵罐中配置18m³发酵液，调节初始pH 5.8，常规湿热蒸汽灭菌，冷却至33±1℃，按照10％接种量在常规无菌条件下接种种子培养液于25m³发酵罐的发酵液中。发酵罐转速80r/min，通风量1:0.5，培养时间72h，取样，TLC分析,底物转化完全,样品用乙酸乙酯萃取,将上层乙酸乙酯常压浓缩或挥发至干，HPLC法测定转化结果，3-羟基-5烯-16,17α-环氧物含量1.2％，16,17α-环氧黄体酮含量98.2％，其它物质含量0.6％。

转化完毕，90℃发酵液灭活，冷却到室温，板框压滤，滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率98.5％，16,17α-环氧黄体酮含量98.7％。

所得白色晶体，经紫外光谱、红外光谱、ESI-MS质谱、核磁共振H谱、核磁共振C谱鉴定，为16,17α-环氧黄体酮(如说明书附图所示)。

实施例2

斜面、种子培养方法如实施例1所述。

按照1L水中，发酵底物3-羟基-5烯-16,17α-环氧物2.5g，发酵培养基组分和重量为葡萄糖12g,酵母提取物4g，玉米浆35g，磷酸二氢钾1.0g，泡敌(消泡剂GPE，江苏斯德瑞克化工有限公司)0.2g的比例在25m³的通风机械搅拌发酵罐中配置18m³发酵液，调节初始pH 6.7，常规湿热蒸汽灭菌，冷却至33±1℃，按照12％接种量在常规无菌条件下接种种子培养液于25m³发酵罐的发酵液中。发酵罐转速80r/min，通风量1:0.5，压力0.05MPa，培养时间72h，取样，TLC分析,底物转化完全,样品用乙酸乙酯萃取,将上层乙酸乙酯常压浓缩或挥发至干，HPLC法测定转化结果，3-羟基-5烯-16,17α-环氧物含量1.4％，16,17α-环氧黄体酮含量97.8％，其它物质含量0.8％。

转化完毕，90℃发酵液灭活，冷却到室温，板框压滤，滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率98.8％，16,17α-环氧黄体酮含量98.5％。

所得白色晶体，经紫外光谱、红外光谱、ESI-MS质谱、核磁共振H谱、核磁共振C谱鉴定，为16,17α-环氧黄体酮(如说明书附图所示)。

实施例3

斜面、种子培养方法如实施例1所述。

按照1L水中，发酵底物3-羟基-5烯-16,17α-环氧物2.5g，发酵培养基组分和重量为葡萄糖15g,酵母提取物5g，玉米浆40g，磷酸二氢钾1.2g，泡敌(消泡剂GPE，江苏斯德瑞克化工有限公司)0.3g的比例在25m³的通风机械搅拌发酵罐中配置18m³发酵液，调节初始pH8.0，常规湿热蒸汽灭菌，冷却至33±1℃，按照15％接种量在常规无菌条件下接种种子培养液于25m³发酵罐的发酵液中。发酵罐转速80r/min，通风量1:0.5，种子罐压力0.05MPa，培养时间72h，取样，TLC分析,底物转化完全,样品用乙酸乙酯萃取,将上层乙酸乙酯常压浓缩或挥发至干，HPLC法测定转化结果，3-羟基-5烯-16,17α-环氧物含量1.8％，16,17α-环氧黄体酮含量97.5％，其它物质含量0.7％。

转化完毕，90℃发酵液灭活，冷却到室温，板框压滤，滤饼用乙酸乙酯提取，浓缩，得到白色晶体，粗品收率97.8％，16,17α-环氧黄体酮含量98.7％。

所得白色晶体，经紫外光谱、红外光谱、ESI-MS质谱、核磁共振H谱、核磁共振C谱鉴定，为16,17α-环氧黄体酮(如说明书附图所示)。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。