一株少动鞘氨醇单胞菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体是涉及一株少动鞘氨醇单胞菌 (Sphingomonas paucimobilis)及其在发酵生产威兰胶中的应用。
【背景技术】
[0002] 威兰胶(welan gum编号S-130)是由某些产碱杆菌Alcaligenes sp.或鞘氨醇单胞 菌Sphingomonas sp.合成的微生物杂多糖，是美国斯比凯可公司（CP Kelco)20世纪80年代 继黄原胶、结冷胶之后开发的第3代微生物胞外多糖之一，其分子量高达数百万。它的结构 骨架由D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖重复单元构成，侧链由单一的L-甘露糖 或L-鼠李糖构成，结构如图1所示;威兰胶水溶液具有假塑性流体特征，其低浓度水溶液具 有很高的粘度，并具有良好的稳定性，温度升高至150°C时，其黏度基本不变，其耐温极限值 比黄原胶高20~30°C。威兰胶水溶液对酸、碱稳定，其黏度在pH2~13范围内基本不受影响； 威兰胶溶液具有独特的剪切稀释性能，这一点在石油钻井中发挥突出的作用。威兰胶溶液 的独特性质超越许多其它多糖，可作为增稠剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、润滑剂、成膜剂和 粘合剂应用于石油、混凝土、食品、油墨等工业。
[0003] 目前仅美国Kelco公司商业化生产威兰胶，国内尚无商业化生产的报道，国内研究 尚处于实验室研究的起步阶段。
【发明内容】
[0004] 为克服上述现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一株少动 鞘氨醇单胞菌。
[0005] 本发明的另一目的在于提供上述少动鞘氨醇单胞菌的应用。上述的少动鞘氨醇单 胞菌应用于发酵生产威兰胶，并提供发酵生产威兰胶的方法。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现:一株少动鞘氨醇单胞菌，所述的少动鞘氨 醇单胞菌命名为少动鞘氨醇单胞菌Y5(Sphingomonas paucimobilis Y5)，保藏于中国典型 培养物保藏中心;保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏号为:CCTCC Ν0:Μ 2015523;保藏起 始日期为2015年9月11日。
[0007] 所述的少动鞘氨醇单胞菌Y5是本申请发明人从酒精废水处理厂活性污泥分离并 筛选得到。
[0008] 所述的少动鞘氨醇单胞菌Y5,在营养琼脂(NA)平板上菌落形态见图2,为圆形，黄 色，湿润，凸起生长，菌落直径为1~5mm;显微镜检为革兰氏阴性细菌，氧化酶试验为阳性， 接触酶试验为阴性。
[0009] 所述的少动鞘氨醇单胞菌Y5,对少动鞘氨醇单胞菌Y5的16s rDNA进行测序与分子 比对，其与鞘氨醇单胞菌（sphingomonas sp.)16s rDNA核苷酸序列同源性为98%。其中少 动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas paucimobilis)Y5的 16s rDNA序列如SEQ ID NO: 1 所不。
[0010] 所述的少动鞘氨醇单胞菌Y5,经梅里埃API 20NE鉴定条鉴定为少动鞘氨醇单胞菌 (Sphingomonas paucimobilis)〇
[0011 ] 本发明所述的少动鞘氨醇单胞菌Y5(Sphingomonas paucimobilis Y5)可用于发 酵生产威兰胶。
[0012] 当小量摇床发酵培养时，所述发酵生产威兰胶的具体方法为:从活化的少动鞘氨 醇单胞菌Y5菌种斜面挑取1~2环菌种接种到种子培养基，28~32°C，180~200r/min摇床培 养16~18h得到种子液，然后按5%~10% (v/v)接种量接种到发酵培养基，摇床培养条件为 28~32°C，200~250r/min发酵65~72h;发酵液经回收过程获得威兰胶。
[0013] 当大量发酵罐培养时，所述发酵生产威兰胶的具体方法为:从活化的少动鞘氨醇 单胞菌Y5菌种斜面挑取1~2环菌种接种到种子培养基，28~32°C，180~200r/min摇床培养 16~18h得到种子液，然后按5%~10% (v/v)接种量接种到发酵培养基，发酵罐培养条件为 温度28~32°C，搅拌速度400~800r/min发酵65~72h，通气量1.0vvm，pH 6.0~7.0,罐压 0.01~0.03Mpa;发酵液经回收过程获得威兰胶。
[0014]所述的种子培养基的成份及含量为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L， K2HPO4 · 7H20 2g/L，MgS〇4 · 7H20 0.1g/L，溶剂为水。
[0015] 所述的发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐;发酵培养基初始pH 6.0~8.0;所述的 碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉类水解液中的一种或几种，用量为40~60g/L;所述的氮源为牛肉 膏、蛋白胨、酵母膏、NaN〇3中的一种或几种，用量为3~5g/L;所述的无机盐为K2HPO4 · 7H2〇 和MgS〇4 · 7H2O,用量分别为2~4g/L和0.1~0.3g/L。
[0016] 作为优选的实施方式，所述的发酵培养基还包括表面活性剂，所述的表面活性剂 为吐温80，司盘，脂肪酸甘油酯的一种或几种，用量为0.5~lg/L。
[0017] 在威兰胶的生产方法中，所述的产品回收过程包括预处理、提取、干燥、粉碎和过 筛过程，具体步骤如下：
[0018] 1)预处理:发酵液经80°C灭活20min，蛋白酶处理结合离心、过滤除去菌体和不溶 性杂质；
[0019] 2)提取:加入1 · 5~2倍体积有机溶剂提取；
[0020] 3)干燥:有机溶剂分离得到的沉淀60°C干燥；
[0021 ] 4)粉碎:所得干燥的威兰胶用粉碎机粉碎；
[0022] 5)过筛:粉碎后的威兰胶过60~120目筛，即得不同规格的威兰胶产品。
[0023] 步骤2)中所述的有机溶剂为乙醇、甲醇或异丙醇中的一种或几种。
[0024] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0025] 1)本发明分离筛选得到一株少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas paucimobilis) Y5,可利用碳源，氮源，无机盐和水，在合适的条件下发酵生产威兰胶，所需营养成分简单， 操作方便。
[0026] 2)该菌株发酵生产的威兰胶品质好，1 %水溶液粘度达到3500mPa · S，耐酸碱(ρΗ2 ~13范围类性质稳定），耐高温(温度升高至150°C时粘度基本不变）。
[0027] 3)该菌株发酵时糖转化率较高，达到55%~60%，产量较高，达到了25~32g/L(干 重)。
【附图说明】
[0028]图1为威兰胶的分子结构骨架示意图；
[0029]图2为少动鞘氨醇单胞菌Y5在营养琼脂上的菌落形态图。
【具体实施方式】
[0030]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0031 ] 实施例1少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)Y5的分离筛选 [0032]分离:取酒精废水厂的活性污泥样品，用无菌水作10倍梯度稀释，然后涂布于LB琼 脂平板，30°C培养。
[0033]初筛:挑取个头大，有粘性，表面光滑，湿润的单菌落用于复筛。
[0034]复筛:初筛挑取的单菌落分别接种于液体培养基(葡萄糖30g/L，蛋白胨3g/L，酵母 粉lg/L，K2HP〇4 · 7H20 2g/L，MgS〇4 · 7H20 0.2g/L)，30°C，200r/min摇床培养，最终筛选出发 酵液粘度和粗糖产量高的菌株少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobi 1 is)Y5。
[0035] 实施例2少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobi 1 is)Υ5的鉴定
[0036] 1)菌落形态与镜检，结果如图2所示：
[0037]在营养琼脂(NA)平板上菌落形态为圆形，黄色，湿润，凸起生长，菌落直径为1~ 5mm;显微镜检为革兰氏阴性细菌。
[0038] 2)氧化酶与接触酶检验：
[0039]氧化酶试验为阳性，接触酶试验为阴性。
[0040] 3)16s rDNA鉴定：
[0041 ] 用接种环挑取2~5个菌落转移至TE中，37°C温育1.5h，加入NaCl和CTAB溶液混匀， 65°C温育10min，加入酚-氯仿-异戊醇溶液抽提，离心10min，吸取上清转移至新的EP管内， 再用氯仿-异戊醇提取2次，转移至新的EP管中，再加入异丙醇沉淀DNA，4°C静置20min，离心 弃上清，加入70 %乙醇洗涤沉淀，加入TE，溶解沉淀。-20°C保存。将上述提取的总DNA稀释10 倍作为模板，以 F2 7 (CCGGATCCAGAGTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT )和R1492 (CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC)作为引物扩增待测细菌的 16s rDNA。扩增物由 上海英骏生物技术有限公司进行测序，测序结果提交到GENBANK(http : // www · ncbi · nlm. nih · gov/blast)进行比对，结果表明与Sphingomonas sp · ZJ01 同源性达到 98%，归属于鞘氨醇单胞菌属。其中：扩增待测细菌的16s rDNA的测序序列结果如下：
[0042]
[0044] 4)API 鉴定：
[0045] 用灭菌的棉拭子挑取新鲜的菌落，接种至API 20NE接种液中，制成浊度为2个麦氏 单位的菌悬液。将菌悬液接种至API 20NE鉴定条，30°C培养48h观察生化反应，并用API鉴定 系统软件分析，得到鉴定结果为:试验条API 20NE V7.0，生化谱0463340，有意义的分类单 位为Sphingomonas paucimobilis，鉴定％为99·8，T值（T指数）0·93〇
[0046] 实施例3少动鞘氨醇单胞菌Υ5发酵生产的微生物多糖检测分析。
[0047] 菌株发酵生产的多糖聚合物溶于水，不溶于醇、酮等有机溶剂。
[0048] 通过苯酚-硫酸法和硫酸-咔唑法测得多糖样品中葡萄糖醛酸含量为12% ;通过