一种木聚糖酶杂合酶工程菌株的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种木聚糖酶杂合酶工程菌株的构建方法。
【背景技术】
[0002] 木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是催化水解木聚糖的一类多功能酶的总称。木聚糖酶广泛 分布于自然界中，如动物、植物和微生物等，且种类繁多，应用领域广泛。目前，微生物来源 的木聚糖酶研究报道很多，研究得最多的是来源于细菌和真菌的木聚糖酶。其中，细菌可以 产生碱性和酸性木聚糖酶，而真菌可以产生碱性木聚糖酶。目前，木聚糖酶主要由真菌和细 菌等微生物发酵生产而来。
[0003] 随着生物技术的不断发展，木聚糖酶的研究开发备受关注。在工业应用方面，木聚 糖酶具有很大的工业应用潜力和价值，它是一种重要的工业酶制剂，广泛应用于食品加工、 酿造、纸浆漂白、制药、饲料添加剂、医药、纺织、生物转化等领域。木聚糖酶在使用过程中对 外界物化条件极为敏感，在工业进程中的高温、重金属离子、氧化剂和极端pH等条件下，都 会使木聚糖酶构象遭到破坏，从而限制了酶的应用环境。因此，提高木聚糖酶稳定性已成为 研究者广泛关注的焦点。目前，通过生物信息学分析比对木聚糖酶晶体结构发现，氢键、离 子键数目、盐桥、N端以及α-螺旋处区域等与木聚糖酶的稳定性密切相关。很多人以此为依 据，通过基因工程和酶工程等手段研究木聚糖酶的稳定性，并取得了良好的成果。
[0004]目前已经发现影响木聚糖酶热稳定性的诸多因素，但国内外对于木聚糖酶分子热 稳定性突变位点的报道相对较少。一般来说所有的二硫键在蛋白质折叠和稳定性方面都起 着关键的作用，且与蛋白质的热稳定性密切相关。Ν端二硫键的引入对酶热稳定性的影响国 内外已有报道，但C端引入二硫键对木聚糖酶热稳定性有无影响，未见报道。
[0005] 随着蛋白质组学技术不断发展，人们发现蛋白质糖基化对蛋白质构象的稳定有一 定的作用。糖基化是在酶的控制下，蛋白质或脂质附加上糖类的过程，发生于内质网。在糖 基转移酶作用下将糖转移至蛋白质，和蛋白质上的氨基酸残基形成糖苷键。目前，对于蛋白 质糖基化修饰研究主要是Ν-糖基化和0-糖基化。研究发现，Ν-糖基化多发生在Asn-Xaa-Ser/Thr序列的Asn残基上，0-糖基化多发生β-转角区域。另外，通过糖基化修饰来提高木聚 糖酶稳定性的研究相对较少，因此，有一定的探索空间。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种木聚糖酶杂合酶工程菌株的构 建方法，首先利用生物信息学比对木聚糖酶XynZF-2基因序列（GenBank Accession No. JQ700382)与耐热木聚糖酶EvXynl 1基因序列(GenBank AccessionNo.EU591347)的同源 性，通过N-端替换将XynZF-2的N-端48个氨基酸替换成木聚糖酶EvXynllN-端的34个氨基 酸，并引入芳香族氨基酸P9Y和H14F，进而在XynZF-2酶C端继续引入二硫键Cys38-Cysl91、 α-螺旋及cord区域分别引入疏水性氨基酸K164M、G166A、N160I以及V111A、G109A，最后引入 糖基化修饰位点E42N和F17S，构建多位点突变杂合酶XynZL，期望杂合酶XynZL的热稳定性 有所改善。
[0007] 其技术方案如下：
[0008] -种木聚糖酶杂合酶工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
[0009] 步骤1、木聚糖酶结构分析
[0010] BLAST和DNAMAN6.0同源序列比对与木聚糖酶XynZF-2同源性较高的耐热木聚糖酶 基因，PR0SITE(http : //prosite · expasy · org)预测木聚糖酶功能位点，利用Phyre2 (http ://www. sbg.bio · ic .ac .uk/phyre2/html/page · cgi?id = index)对木聚糖酶建模，并 通过DS ViewerPro6.0分析木聚糖酶的三维结构。采用DiANNA l.l(http:// 13；[0；[11；1^01'1]1&1：；[08.13(3.6(111/(310七61&13/01厶顺厶/)分析二硫键位点，利用如七呢15^1.0 (http://www· cbs · dtu · dk/services/NetNGlyc/)对木聚糖酶XynZF-2糖基化位点进行预 测；
[0011]步骤2、目的基因的合成及重组表达载体的构建
[0012]设计好的杂合酶基因 xynZL序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成；
[0013] 参考杂合酶基因 xynZL基因序列以及真核表达载体PPIC9K的多克隆位点，设计以 下两条引物：YS: 5 ' -CCGGAATTCTTCCCCACGACTCTGTCG-3 '（EcoR 頂每切位点）
[0014] γχ: 5 ' -ATAAGAATGCGGCCGCTTACTGAACACAGATGGACG-3 '（Not I )，引物由苏州金唯智 生物科技有限公司合成；
[0015] 以xynZL基因为模板，YS、YX为引物进行PCR扩增，扩增产物回收后，与对应表达载 体经双酶切、回收、连接，连接液转化E. co 1 i DH5a感受态细胞，转化液分别涂布含Amp的LB 平板，阳性克隆子筛选后，提取质粒经酶切及PCR验证，最终获得重组质粒pPIC9K-XynZL。
[0016] 优选地，步骤2中的进行PCR扩增的扩增条件均为:94°C预变性2min; 94°C变性30s， 67°C 退火 30s，72°C 延伸 lmin，30 个循环；72°C 延伸 10min。
[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果：
[0018] 本发明为提高来源于黑曲霉(Aspergillus niger)XZ-3S的中温木聚糖酶XynZF-2 热稳定性，通过N-端替换将XynZF-2的N-端48个氨基酸替换成木聚糖酶EvXynl IN-端的34个 氨基酸，并引入芳香族氨基酸P9Y和H14F。在此突变基因基础上，C端引入二硫键Cys38-Cysl91、a-螺旋及 cord区域分别引入疏水性氨基酸K164M、G166A、N160I以及V111A、G109A， 然后引入糖基化修饰位点E42N和F17S，构建多位点突变基因 xynZL，并与pPIC9K表达载体连 接，转化毕赤酵母，构建了杂合酶工程菌GS115/pPIC9K-xynZL，重组杂合酶酶学性质分析显 示，杂合酶最适温度较原酶有了较大幅度的提升。
【附图说明】
[0019] 图1是杂合木聚糖酶XynZL的三维结构，其中，图la为杂合酶三维结构的正面图，图 lb为杂合酶三维结构的反面图；
[0020] 图2是重组酶最适作用温度示意图；
[0021 ]图3是重组酶温度稳定性示意图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。
[0023] 1材料与方法
[0024] 1.1菌株、质粒与试剂
[0025] 黑曲霉（Aspergillus niger)XZ_3S，大肠杆菌（Escherichia coli)JM109、DH5a由 作者所在实验室保存；真核表达质粒PPIC9K及毕赤酵母（Pichia pastoris)GSl 15购自 Invitrogen公司。DNA聚合酶、限制性内切酶、连接酶购自TaKaRa公司；氨节青霉素(Amp)购 自Sangon公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Sangon公司；溴化乙锭（Ethidium bromi de)购自Amr e sco公司；酵母粉、蛋白胨、琼脂糖均购自BBI公司;G418、无氨基酵母氮源 (YNB)购自Amresco公司;桦木木聚糖购自Sigma公司；其他生化试剂均为国产或进口分析纯 广品。
[0026] 1.2木聚糖酶结构分析
[0027] BLAST和DNAMAN6.0同源序列比对与木聚糖酶XynZF-2同源性较高的耐热木聚糖酶 基因，PR0SITE(http : //prosite · expasy · org)预测木聚糖酶功能位点，利用Phyre2 (http ://www. sbg.bio ·