专利名称：鞘氨醇单胞菌属菌株及其在蒽醌染料废水脱色中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程、环境工程技术领域。涉及鞘氨醇单胞菌菌株及其在蒽醌染料废水脱色中应用。
背景技术：
由于染料生产过程效率低下导致了大量未被利用的染料直接进入水体。染料废水呈现的颜色直接表明了水体受到污染。因此，将水体中染料进行脱除是环境领域研究的热点。与偶氮染料相比，蒽醌染料由于其结构稳定而使其生物降解受到了限制。因此，到目前为止，关于蒽醌染料生物降解的工作仍十分有限。Itoh ketal等，研究了Bacillus Subtilis对蒽醌染料C.I.Risperse Red 15的生物降解情况。Jiang和Bishop报道了用旋转膜生物反应器进行好氧降解酸性蒽醌染料。G.M Walkeret研究了酸性蒽醌染料的生物降解性和生物吸附作用。
作为一种主要的蒽醌染料中间体，溴氨酸(ABAS)衍生物被频繁的用于染料和纺织工业。但是，关于ABAS生物降解方面的工作国内外进展较少。为此，从自然界筛选出对溴氨酸有高效降解能力的菌株，从而将其制成生物菌制剂，应用于这类染料废水的治理将有着实际的应用价值。
通常，以报道的染料降解菌株大多数都通过共代谢或者是能够以目标底物为唯一碳源生长来降解染料，这些菌株降解染料的功能在一定程度上受到了各种限制，因此，关于这些染料生物降解的微生物资源有待开发。从化学结构角度来说，蒽醌类染料属于稠环芳香化合物。对芳香化合物进行生物降解最常见的微生物是Pseudomonas。近年来，利用16S rRNA对菌种进行鉴定，重新界定了一类对芳香化合物具有普遍降解能力的菌属，即鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)，该菌属归属于变型细菌α亚类。由于传统的细菌分类方法存有局限，所以一直以来，该菌属在系统分类学上没有独立的进化位置。研究表明鞘氨醇单胞菌对异生型化合物具有广谱降解活性，具有重要的生态学意义。因此，任何一株从自然界筛选出的该菌属的新菌株，对其生理生化及其功能进行深入的研究都是必需的，将为异生型化合物生物降解的微生物资源增添新的成员。
本发明的目的在于为蒽醌染料废水的生物处理提供高效的菌制剂，强化蒽醌染料废水的脱色处理，而从自然界中分离出一株鞘氨醇单胞菌，它能够以溴氨酸为唯一的碳、氮及能源生长，对蒽醌染料废水具有高效的脱色作用。
发明内容
本发明的目的就是为蒽醌染料废水的生物处理提供高效的菌制剂，强化蒽醌染料废水的脱色处理，从自然界中分离出一株鞘氨醇单胞菌，能够以溴氨酸为唯一的碳、氮及能源生长，对蒽醌染料废水具有高效的脱色作用的鞘氨醇单胞菌属菌株及其在蒽醌染料废水脱色中的应用。
本发明的技术解决方案是，本发明提供的鞘氨醇单胞菌属菌株为Sphingomonas xenophaga QYY，于2004年6月1日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC NO.1172。
该鞘氨醇单胞菌属菌株是从山东招远化工厂溴氨酸生产车间排污口的污泥中分离得到。
其具体筛选步骤如下从山东招远化工总厂溴氨酸生产车间排污口采集好氧活性污泥样品，作为菌源进行驯化，富集培养。即将所取污泥制成悬浊液，取上清液加到活化富集培养基中(培养基组成g/l牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5)富集，其中培养基在121℃，高压灭菌20分钟后使用。然后再转到以溴氨酸为唯一碳源的培养基中(培养基组成(g/l)(NH4)2SO42，KH2PO41.3，Na2HPO42，微量元素1ml/l)驯化，其中微量元素组成(g/l)(MnSO4·H2O 39.9；ZnSO4·9H2O 68.55；(NH4)6Mo7O24·4H2O34.7)。驯化采用一次性投加高浓度化合物的驯化方法，每个驯化周期结束时，将培养物取一定体积加入到新鲜的唯一碳源培养基中，并不断提高溴氨酸的浓度，同时，不断减少氮源的量，直至混合菌液可以以溴氨酸为唯一的碳、氮及能源生长，将此混合菌液涂布在含一定浓度溴氨酸的固体基础培养基上，反复进行平板涂布，分离出一株对溴氨酸具有高效脱色能力的菌株鞘氨醇单胞菌属菌株；该鞘氨醇单胞菌属菌株适宜在中性及偏酸性(PH6.5～7.0)的培养介质中生长，适合生长温度为25～35℃，其细菌学形态特征为革兰氏阴性杆菌，尺寸为0.3～0.4μm×1.0～1.4μm，无鞭毛，细胞为黄色，好氧，接触酶阳性，氧化酶阳性，无反硝化作用，能够以溴氨酸为唯一碳、氮源生长。
该鞘氨醇单胞菌属菌株培养特征该菌在固体LB培养基上30℃培养2-3天，菌落小，呈圆形，边缘整齐，表面干涩，菌体呈现暗黄色，极易挑起。
该鞘氨醇单胞菌属菌株生理生化特征，见表1表1鞘氨醇单胞菌属菌株生理生化特征试验项目结果 试验项目 结果 试验项目结果 试验项目 结果革兰氏染色 阴性 硝酸盐还原 -利用唯一碳源生长细胞形状杆状 利用柠檬酸盐 -葡萄糖 + 半乳糖 +鞭毛无利用丙二酸盐 -果糖- 蔗糖-与氧的关系 好氧 精氨酸双水解酶 -海藻糖 - 丙酸盐 -细胞颜色黄色 反硝化 -L-缬氨酸- 山梨醇 -接触酶 + 积累PHB-β-丙氨酸 - 麦芽糖 +氧化酶 + 41℃生长 -DL-精氨酸 - D-酒石酸盐 -产生荧光色素- 4℃生长-乙酸盐 - 亮氨酸 +产生果聚糖 - O/F试验氧化 甘露醇 - 乳糖-产生脓青素 - 葡萄糖产酸 +木糖- L-组氨酸-水解七叶灵 + 阿拉伯糖+ L-色氨酸-水解明胶- 鼠李糖 - α-酮戊二酸盐 -甘露糖 - 苯乙酸盐-依据该菌株形态学及生理生化等特征，可鉴定其为鞘氨醇单胞菌属的菌株。通过扩增该菌株的16S rDNA，得到了长度为1481 bp的16S rDNA全序列。PCR引物采用细菌16S rDNA的通用引物F8(5’-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3’)和R1522(5’-AAG GAC GTC ATC CAG CCG CA-3’)。用PCR仪(GeneAmp，PCR System 9700)进行扩增反应。反应体系总体积为25μl超纯水16.2μl，10xBuffer2.5μl，dNTP2μl，F8引物1μl，R22引物1μl，ExTaq酶0.3μl，总DNA作一定稀释后取2μl于反应体系中。94℃预变性5min，经过30个循环，其中，98℃变性20s，55℃退火40s，72℃延伸1.5min，30个循环后再在72℃延伸7min，1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外检测。通过Blast程序进行同源性比较，表明该菌株与Sphingomonas xenophaga的同源性高达99％。
本发明的鞘氨醇单胞菌属菌株既可在富营养培养基LB中生长，也可在以溴氨酸为唯一碳、氮源的基础培养基中生长。应用前需在溴氨酸存在的条件下进行驯化，菌株在30℃，pH6.5，进行好氧培养。
该鞘氨醇单胞菌属菌株对溴氨酸的脱色能力极强，经该菌株作用后，溴氨酸的紫外-可见扫描谱图在可见区无吸收，培养液接近无色。
本发明的鞘氨醇单胞菌属菌株，可以用新鲜培养的生长期菌种或是制成的休眠细胞及其固定化细胞对溴氨酸进行脱色处理。
本发明所达到的有益效果是本发明提供的鞘氨醇单胞菌属菌株对溴氨酸有着极强的脱色能力，降解速度快，对小于800mg/l的溴氨酸，在短时间内，脱色率高达90％以上。并且，经该发明菌株作用的含溴氨酸染料废水，其出水色度大大降低，接近无色。该菌株可作为生物菌制剂，投加到现有的染料废水处理系统中，增强原处理系统的处理能力。另外，由于该菌种胞外分泌物的特殊性，使其在工业水处理中有着广阔的应用潜力。
图1是本发明的鞘氨醇单胞菌属菌株在富集培养基中生长与溴氨酸降解曲线图。
图2是本发明的休眠细胞对不同浓度溴氨酸的降解情况图。
图3是本发明的鞘氨醇单胞菌属菌株在唯一碳、氮源培养基中对不同浓度溴氨酸的降解情况图。
图4是本发明的不同包菌量固定化小球在模拟SBR系统中处理含ABAS废水情况图。
图中-●-为降解曲线，-○-为生长曲线，-为理论值，■为实验值，-◆-为进水溴氨酸浓度，-□-为2％包菌量，-▲-为5％包菌量，-×-为10％包菌量。
具体实施例方式
下面结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1本发明提供的鞘氨醇单胞菌属菌株的筛选步骤
从山东招远化工总厂溴氨酸生产车间排污口采集好氧活性污泥样品，作为菌源进行驯化，富集培养。即将所取污泥制成悬浊液，取上清液加到活化富集培养基中富集，培养基组成(g/l)牛肉膏5、蛋白胨10、NaCl 5，其中培养基在121℃，高压灭菌20分钟后使用。然后再转到以溴氨酸为唯一碳源的培养基中驯化，培养基组成(g/l)(NH4)2SO42、KH2PO41.3、Na2HPO42、微量元素1ml/l，其中微量元素组成(g/l)(MnSO4·H2O 39.9、ZnSO4·9H2O 68.55、(NH4)6Mo7O24·4H2O 34.7。驯化采用一次性投加高浓度化合物的驯化方法，每个驯化周期结束时，将培养物取一定体积加入到新鲜的唯一碳源培养基中，并不断提高溴氨酸的浓度，同时，不断减少氮源的量，直至混合菌液可以以溴氨酸为唯一的碳、氮及能源生长，将此混合菌液涂布在含一定浓度溴氨酸的固体基础培养基上，反复进行平板涂布，分离出一株对溴氨酸具有高效脱色能力的菌株QYY；并将该菌株于2004年6月1日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC NO.1172；该鞘氨醇单胞菌属菌株菌株适宜在中性及偏酸性(PH6.5)的培养介质中生长，适合生长温度在30℃，其细菌学形态特征为革兰氏阴性杆菌，尺寸为0.3-0.4μm×1.0-1.4μm，无鞭毛，细胞为黄色，好氧，接触酶阳性，氧化酶阳性，无反硝化作用，能够以溴氨酸为唯一碳、氮源生长。
本发明提供的鞘氨醇单胞菌属菌株的16S rRNA扩增通过扩增该菌株的16S rDNA，得到了长度为1481 bp的16S rDNA全序列。PCR引物采用细菌16S rDNA的通用引物F8(5’-AGA GTT TGA TCA TGG CTCAG-3’)和R1522(5’-AAG GAC GTC ATC CAG CCG CA-3’)。用PCR仪(GeneAmp，PCR System 9700)进行扩增反应。反应体系总体积为25μl超纯水16.2μl，10xBuffer 2.5μl，dNTP2μl，F8引物1μl，R22引物1μl，ExTaq酶0.3μl，总DNA作一定稀释后取2μl于反应体系中。94℃预变性5min，经过30个循环，其中，98℃变性20s，55℃退火40s，72℃延伸1.5min，30个循环后再在72℃延伸7min，1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外检测。通过Blast程序进行同源性比较，表明该菌株与Sphingomonas xenophaga的同源性高达99％，序列如图5所示。
制备鞘氨醇单胞菌属菌株菌株的细胞液体培养物
挑取LB固体培养基上的鞘氨醇单胞菌属菌株菌株单菌落于装有灭菌的LB液体培养基中，其中溴氨酸的浓度为100mg/l，于30℃，pH6.5，150r/min，进行好氧培养12-24小时，取培养好的菌液1ml接种在装有100ml含灭菌溴氨酸(100mg/l)的基础培养基的250ml锥形瓶中，30℃，pH6.5，150r/min，进行好氧培养48小时，即为鞘氨醇单胞菌属菌株的细胞液体培养物。
制备鞘氨醇单胞菌属菌株的休眠细胞将鞘氨醇单胞菌属菌株于8000r/min，4℃下离心10min，用磷酸缓冲液洗涤3次，用同样的缓冲液重悬该沉淀，使得休眠细胞浓度为10mg/l，于4℃冻存，备用，即制得鞘氨醇单胞菌属菌株的休眠细胞。
制备鞘氨醇单胞菌属菌株的固定化细胞[1]将1.1g海藻酸钠加热溶于20ml去离子水中，并冷却至30℃；[2]将实施例4中的细胞悬液20ml置于30℃恒温水浴中至温度稳定；[3]将[1]中1海藻酸钠水溶液与[2]中等体积菌悬液混合并搅拌均匀；[4]用医用注射器将[3]中混合物滴入5％的CaCl2溶液中，制成小球，并于4℃冰箱中交联4h。
用生理盐水将小球冲洗两遍，储存在生理盐水中，并于4℃冰箱保存备用。
实施例2本发明在富营养培养基中对溴氨酸脱色研究的应用，其步骤如下[1]在250ml的锥形瓶中加入50ml LB培养基，再加入溴氨酸使其终浓度为100mg/l，灭菌备用。
将实施例1制得的鞘氨醇单胞菌属菌株的细胞液体培养物或实施例是制备的鞘氨醇单胞菌属菌株的休眠细胞加入上述[1]的锥形瓶中，30℃，150r/min，好氧培养。每隔12小时取样测定。图1为鞘氨醇单胞菌属菌株在富集培养基中生长与溴氨酸降解情况；由图可知，溴氨酸的降解发生在菌株生长的早期而不是对数期；并可以看出，菌体少量的生长足以使溴氨酸降解，接种14小时后，溴氨酸的脱色率高达100％。图2为不同溴氨酸初始浓度对休眠细胞降解溴氨酸的影响，如图2所示休眠细胞对溴氨酸的降解符合典型的底物抑制模型。
实施例3本发明在以溴氨酸为唯一碳、氮源培养基中对溴氨酸脱色研究的应用将实施例1中的LB培养基换为以溴氨酸为唯一碳、氮源的基础培养基，其它步骤同实施例6。图3为生长细胞对不同浓度溴氨酸的降解情况；由图3可见，鞘氨醇单胞菌属菌株对溴氨酸的脱色能力极强，可耐受溴氨酸浓度高达1000ppm。
实施例4本发明在实验室模拟SBR反应器中对溴氨酸废水脱色的应用，其步骤如下[1]首先，运行SBR处理系统，为实验室模拟反应器。在250ml锥形瓶中装入50ml污泥悬液，污泥浓度为3g/l，，30℃，150r/min，好氧培养。反应周期包括五个阶段(一个周期为12h)进水0.5h；曝气10h；沉淀1h；排水和闲置0.5h。
将灭菌的溴氨酸加入上述锥形瓶中，其浓度按照试验要求确定。
将实例1制备的鞘氨醇单胞菌属菌株的固定化细胞投入上述[1]的锥形瓶中，30℃，150r/min，好氧培养，每隔12小时取样测定，图5为不同包菌量固定化小球在模拟SBR系统中处理含ABAS废水情况，从曲线趋势可以看出，不同包菌量的固定化小球对溴氨酸的脱色效果不同，10％包菌量的处理效果最好。
<110>大连理工大学环境与生命学院<120>鞘氨醇单胞菌属菌株及其在蒽醌染料废水脱色中的应用<160>序列总数1<211>1481 bp<212>DNA<213>鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas xenophaga)<220>
<221>gene<120>鞘氨醇单胞菌属菌株的16S rRNA全序列1aaggaggtga tccagccgca ggttccccta cggctacctt gttacgactt caccccagtc61 tctaaaccca ccgtggtcac ctgtctccct tgcgggttaa cgcagtgcct tcgggtgaat121 ccaaatccca tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcctg ggaacgtatt caccgcggca181 tgctgatccg cgattactag cgattccgcc ttcatgctct cgagttgcag agaacaatcc241 gaactgagac gacttttgga gattagctac cgctcgcacg gttgcagccc actgtagtcg301 ccattgtagc acgtgtgtag cccagcgcgt aagggccatg aggacttgac gtcatcccca361 ccttcctccg gcttatcacc ggcggttcct ttagagtacc caaccaaatg ctggcaacta421 aaggcgaggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga481 cagccatgca gcacctgtca ctcatccagc cgaactgaag gaaatcatct ctgaaatccg541 cgatgaggat gtcaaacgct ggtaaggttc tgcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct601 ccaccgcttg tgcaggcccc cgtcaattcc tttgagtttt aatcttgcga ccgtactccc661 caggcggata acttaatgcg ttagctgcgc caccgaaaca ccatgtgccc cggcagctag721 ttatcatcgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgtttgctc cccacgcttt781 cgcacctcag cgtcaatact tgtccagcga gccgccttcg ccactggtgt tcttccgaat841 atctacgaat ttcacctcta cactcggaat tccactcgcc tctccaagat tctagcaatc901 cagtctcaaa ggcagttccg gggttgagcc ccgggctttc acctctgact taaatcgccg961 cctacgtgcg ctttacgccc agtaattccg aacaacgcta gctccctccg tattaccgcg1021 gctgctggca cggagttagc cggagcttat tctcccgata ctgtcattat catctcgggt1081 aaaagagctt tacaacccta aggccttcat cactcacgcg gcattgctgg atcaggcttt1141 cgcccattgt ccaatattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc gtgtctcagt1201 cccagtgtgg ctgatcatcc tctcagacca gctaaggatc gttgccttgg tgagccttta1261 ccccaccaac tagctaatcc tacgcgggct catccctggg cgataaatct ttggactttc1321 gtcatcatcc ggtattagct tcagtttccc gaagttattc cgaacccaag ggcagattcc1381 cacgcgttac gcacccgtgc gccactagac ccgaaggtct cgttcgactt gcatgtatta1441 ggcatgccgc cagcgttcgt tctgagccat gatcaaactc t
权利要求
1.鞘氨醇单胞菌属菌株，其特征在于，鞘氨醇单胞菌属菌株为Sphingomonasxenophaga QYY，该菌株于2004年6月1日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC No.1172。
2.根据权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌属菌株，其特征在于，从山东招远化工厂溴氨酸生产车间排污口的污泥中分离得到；该菌株在PH值6.5～7.0培养基介质中培养，适合的生长温度为25～35℃；其细菌学形态特征为革兰氏阴性杆菌，尺寸为0.3～0.4μm×1.0～1.4μm，无鞭毛，细胞为黄色，好氧，接触酶阳性，氧化酶阳性，无反硝化作用，能够以溴氨酸为唯一碳、氮源生长。
3.权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌属菌株在蒽醌染料废水脱色中的应用，其特征在于，鞘氨醇单胞菌属菌株通过破坏蒽醌环结构，使得溴氨酸在可见光区最大吸收峰(485nm)消失，从而使含溴氨酸的染料废水脱色。
4.根据权利要求3所述的鞘氨醇单胞菌属菌株在蒽醌染料废水脱色中的应用，其特征在于，鞘氨醇单胞菌属菌株的休眠细胞通过破坏蒽醌环结构，使得溴氨酸在可见光区最大吸收峰485nm消失，从而使含溴氨酸的染料废水脱色。
5.根据权利要求3所述的鞘氨醇单胞菌属菌株在蒽醌染料废水脱色中的应用，其特征在于，鞘氨醇单胞菌属菌株的固定化细胞通过破坏蒽醌环结构，使得溴氨酸在可见光区最大吸收峰485nm消失，从而使含溴氨酸的染料废水脱色。
6.根据权利要求3所述的鞘氨醇单胞菌属菌株在蒽醌染料废水脱色中的应用，其特征在于，鞘氨醇单胞菌属菌株的细胞液体培养物通过破坏蒽醌环结构，使得溴氨酸在可见光区最大吸收峰485nm消失，从而使含溴氨酸的染料废水脱色。
全文摘要
鞘氨醇单胞菌属菌株及其在蒽醌染料废水脱色中的应用属于生物工程、环境工程技术领域。涉及鞘氨醇单胞菌菌株及其在蒽醌染料废水脱色中应用。本发明涉及的鞘氨醇单胞菌菌株，为Sphingomonas xenophaga QYY，于2004年6月1日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC No.1172；是从山东招远化工厂溴氨酸生产车间排污口的污泥中分离得到；该菌株可以以蒽醌染料中间体—溴氨酸为唯一碳、氮及能源生长，其细胞液体培养、休眠细胞及固定化细胞均可以破坏蒽醌环，能够作为生物强化制剂对蒽醌染料废水进行脱色处理。本菌的益处是脱色能力强、降解速度快，适用于工业水处理。
文档编号C02F3/34GK1618953SQ20041002083
公开日2005年5月25日 申请日期2004年6月24日 优先权日2004年6月24日
发明者周集体, 曲媛媛, 王竞, 吕红, 邢林林, 夏元化, 张劲松, 项学敏, 金若菲 申请人:大连理工大学