一种海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法。
【背景技术】
[0002] 硝化-反硝化生物脱氮是废水脱氮最常用的技术之一，氨氧化过程是硝化过程的 关键步骤和限速步骤。长期以来，氨氧化细菌被认为是氨氧化过程的主要承担者。2005年， 氨氧化古菌的发现为自然界氨氧化乃至氮循环过程增添了新内容。近年来，一系列的生理 学研究表明，氨氧化古菌对极端环境的适应性远胜于氨氧化细菌，这也使得氨氧化古菌在 废水脱氮工艺中的应用有了巨大的前景和不容无视的优势。
[0003] 氨氧化细菌是废水处理系统中常见的微生物，但因其生长缓慢、世代时间较长而 难以进行大规模培养，而且氨氧化细菌受环境条件的影响较大。相比而言，氨氧化古菌具有 较宽的环境条件耐受范围。氨氧化古菌对基质氨氮的亲和力远高于氨氧化细菌，其亲和力 常数为0. 13-2. 0yM;实验室中培养的氨氧化细菌在pH值低于6. 5时无法正常生长，而氨 氧化古菌可以在pH值为4. 5左右时进行氨的氧化；氨氧化细菌的最适生长温度为30-35°C， 氨氧化古菌可以在2-80°C条件下正常生长；氨氧化古菌对氧气的亲和力比氨氧化细菌高 10倍以上。上述特性使得氨氧化古菌在废水深度处理、酸性废水的生物脱氮、高温/低温废 水生物脱氮以及低溶解氧废水的生物脱氮等方面具有不容忽视的优势。
[0004] 氨氧化古菌广泛分布于各个生态系统中，包括海洋生态系统、淡水生态系统、农田 生态系统、湿地生态系统等。氨氧化古菌在自然界中的数量巨大，其数量通常为氨氧化细菌 数量的10-1000倍。在海洋环境中，氨氧化古菌可以占到微生物总数量的20%，所以选择海 洋沉积物作为接种物为氨氧化古菌的快速富集培养奠定了基础。
[0005] 传统的梯度稀释-平板划线法对海洋氨氧化古菌的富集培养并不适用。首先是因 为海洋生境中细菌的数量多于古菌，利用传统方法进行富集，富集培养液中会存在大量的 非目标菌；其次，氨氧化古菌伴生细菌生长的现象明显，原因是氨氧化古菌基因组中缺少三 羧酸循环关键环节催化酶的编码基因，氨氧化古菌必须利用细菌三羧酸循环代谢产生的中 间产物才能正常生长。因此在传统方法中，一旦氨氧化古菌的伴生菌死亡，氨氧化古菌就无 法继续生长。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了获得海洋氨氧化古菌的高富集培养物，从而提供了一种海洋 氨氧化古菌的快速富集培养方法。
[0007] 本发明的技术方案如下： 一种海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法，所述方法包括下述步骤： A:富集培养接种物来源的选择和前处理； B:海洋氨氧化古菌培养条件的确定,包括培养温度、氨氮浓度、pH、溶解氧浓度的确 定； C:海洋氨氧化古菌富集培养基的配制，培养基中添加抗生素和微生物三羧酸循环的中 间代谢产物； D:海洋氨氧化古菌的富集培养； E:海洋氨氧化古菌富集过程中的分子生物学检测。
[0008] 优选的，所述步骤A中，选取不同海域的海底沉积物，通过氨氧化古菌功能基因的 定量检测，确定用氨氧化古菌数量最多的沉积物样品作为海洋氨氧化古菌富集培养的接种 物。
[0009] 优选的，所述步骤A中，首先测定沉积物孔隙水的氨氮浓度、pH，然后将沉积物置 于1L的烧杯中，加入一定量的海水，搅拌后静置沉淀，舍弃底部生物量较少的沙粒，抽取上 部沉积物作为海洋氨氧化古菌富集培养的接种物。
[0010] 优选的，所述步骤B中，海洋氨氧化古菌培养温度控制在沉积物样品采集海域的 年平均温度15°C;培养基pH控制在7. 5±0. 1 (与沉积物孔隙水平均pH接近）；富集培养基 氯化铵浓度为〇. 25mM，与原位生境浓度接近；富集培养中溶解氧浓度控制在1. 0-1. 5mg/L， 更加适合对氧气亲和力高的氨氧化古菌生长。
[0011] 优选的，所述步骤C中，海洋氨氧化古菌富集培养基包括：沉积物样品采集海域海 水、氯化铵(终浓度为0. 25禮)、抗生素和三羧酸循环的中间代谢产物。
[0012] 优选的，所述步骤C中，抗生素包括链霉素、庆大霉素、奇霉素、青霉素，培养基中 四种抗生素浓度均为50mg/L。
[0013] 优选的，所述步骤C中，三羧酸循环的代谢产物包括a-酮戊二酸、草酰乙酸、丙酮 酸，三种中间产物的浓度均为100yM。
[0014] 优选的，所述步骤C中，富集培养基的配制方法为：称取氯化铵0. 014g、四种抗生 素各0. 05g、a-酮戊二酸〇. 015g、草酰乙酸0. 013g、丙酮酸0. 009g，溶于1L海水中，将pH 调为7. 5±0. 1，配制完成后，使用0. 22ym的滤膜进行过滤，防止非目标菌随培养基进入富 集培养物中。
[0015] 优选的，所述步骤D中，氨氧化古菌的富集培养在连续流反应器中进行，水力停留 时间为48h。
[0016]优选的，所述步骤E中，氨氧化古菌富集培养的过程中，使用荧光定量PCR和荧光 原位杂交对氨氧化古菌的富集程度进行实时监测。
[0017] 本发明的有益效果：1)海洋氨氧化古菌富集培养物的获得将为海洋氨氧化古菌 的生理特性研究奠定基础，同时为海洋氨氧化过程和氮循环的研究提供基础数据和理论支 撑。2)氨氧化古菌对于环境条件的变化有很强的耐受性，其耐低氧的特性可以大大降低生 物脱氮过程硝化段的运行成本，其对氨氮极高的亲和力可以为废水的深度处理提供保障和 新思路。
【附图说明】
[0018]图1是海洋氨氧化古菌的快速富集培养方法流程图。
【具体实施方式】
[0019] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图、附表及实施 例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发 明，并不用于限定本发明。
[0020] 如图1所示，本发明的流程如下： (1)选取舟山潮间带、舟山潮下带和东海大陆架沉积物三个取样点，通过氨氧化古菌功 能基因的定量检测，确定用氨氧化古菌数量最多的东海大陆架沉积物作为海洋氨氧化古菌 富集