专利名称：鞘氨醇单胞菌菌株在多环芳烃降解中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及鞘氨醇单胞菌菌株在多环芳烃高效降解中的应用。
背景技术：
多环芳经(Polycyclicaromatic hydrocarbons, PAHs)是指一类具备由 2 个或2个以上苯环以线状、角状或成簇形式构成的独特结构的持久性有机污染物。PAHs污染物主要分布在大气、土壌、水体沉积物及水体水相中，由于PAHs会在生物体内积累并通过细胞毒性、遗传毒性和免疫毒性对生物体产生致癌、致畸、致突变作用，对自然界生物安全和人类健康构成巨大威胁，美国EPA已将16种PAHs列入优先控制污染物黑名单，我国国家环保局在第一批公布的68种优先控制污染物中，也将7种PAHs列入其中。因此，控制和去除多环芳烃具有重要的理论和现实意义。对于环境中的PAHs的去除，自20世纪70年代开始，研究人员就利用微生物技术对受PAHs污染土壌进行修复尝试(受菲、芘或五氯苯酚污染土壌的蚯蚓強化修复方法，专利申请号200910184601. 1),80年代科学家认识到微生物技术是修复受PAHs污染最有前景的技术，并将之应用于石油污染环境的修复，如孙国华等采用不动杆菌(Acinetobacter sp .)对石油烃的降解进行了研究(生物技术通报,2010, —株石油烃降解菌分子鉴定及特性分析)。目前，PAHs在环境中的去除途径有微生物降解，生物富集，光降解、化学氧化等技术，如宋兴良等分离出黄杆菌属(Flavobacterium )对多环芳烃进行降解(海洋环境科学，2010年，多环芳烃蒽高效降解菌的筛选及其降解中间产物分析)，王丽平等分离出芽胞杆菌属{Bacillus sp.对多环芳烃芘进行降解(海洋环境科学，2010年，一株高效多环芳烃芘降解菌株的筛选鉴定及其特性研究)；卓胜等采用黒麦草一摩西球囊菌ー蚯蚓等对多氯联苯污染土壤进行了联合修复(环境科学学报，2010年，黒麦草一菌根ー蚯蚓对多氯联苯污染土壤的联合修复效应)，在天然水体中，魏研等采用假单胞菌属iPsGudomormscitixmellolis对水体中的多环芳烃进行了降解研究(化学与生物工程，2010，多环芳烃降解菌的筛选及其对天然水的浄化效果分析)，取得了一定的效果。研究表明，多环芳烃的水解和光解速率都非常缓慢，生物降解成为它们从环境中缓慢消失的主要途径，并具有环保、高效、廉价的优点，因此高效降解菌的筛选成为修复多环芳烃污染的生态系统的关键，被公认为是去除环境中PAHs的主要途径之一。迄今为止，虽然筛选出多种多环芳烃降解菌种，但主要是不动杆菌(Acinetobacter sp .)，黄杆菌属(Flavobacterium )，芽胞杆菌属(Bacillus sp.)和假单胞菌属(Aeyt/offioaas citr onellolis)等，在鞘氨醇单胞菌方面虽有报导，但主要集中于混合菌种或原生质体融合技术对多环芳烃的降解(如由/ "SeWtZoffioftas sp. GP3A和Pandoraea Pnomenusa GP3B混合菌种降解花(华南理工大学,党志等，一种多环芳烃高效降解菌系及其应用，专利申请号200710031821. 1)， 以及由鞘氨醇单胞菌GYZB (sphingomonas )和假单胞菌GP3A ( Pseudomonas )两株菌的原生质体进行融合,构建出基因工程菌降解菲(华南理工大学，党志等，降解多环芳烃的高效菌株及其构建方法和应用，专利申请号201010265121 . 0)，而采用单一高效鞘氨醇单胞菌降解多环芳烃鲜有报导，因此，筛选高效鞘氨醇单胞菌降解多环芳烃具有重要意义。
发明内容
本发明的需要解决的问 题是针对现有降解多环芳烃存在的弱点，提供ー种多环芳烃高效降解菌系及其应用途径，主要是在废水生物处理和环境污染修复中用于降解多环芳烃的应用。而从自然界中分离出的一株鞘氨醇单胞菌属菌，分离自我国太湖水体，为本土菌种，生物安全性高，能够以菲、芘为碳源和能源生长繁殖，将菲、芘完全矿化成CO2和h2o。在纯培养条件下，该菌系12天能将无机盐培养基中15mg/L的菲、芘降解85 %以上；在流化床运行条件下，22天左右能将15mg/L的菲、芘降解95%，22天左右能将5011^/1的菲、芘降解75%，对多环芳烃具有高效降解作用，为含多环芳烃的エ业废水、生活污水的处理提供了保障；另外，在对自然水体(湖水)中含2mg/L菲、芘的多环芳烃菲、芘的去除可达95%以上，取得了显著效果，为自然水体生物修复提供了有效途径。本发明的技术解决方案是,本发明提供的鞘氨醇单胞菌sp.,于2011年I月30日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，地址“北京市朝阳区北辰西路I号院3号”，其保藏号CGMCC No. 4589，參见“鞘氨醇单胞菌菌株及其在水处理中的应用”，申请号201110044056. 3。本发明的鞘氨醇单胞菌属菌株对多环芳烃菲的降解能力极强，经该菌株作用后，菲大幅度降解，从而降低废水中的菲浓度。该鞘氨醇单胞菌属菌株对多环芳烃芘的降解能力极强，经该菌株作用后，芘大幅度降解，从而降低废水中的芘浓度。该鞘氨醇单胞菌属菌株可在以多环芳烃菲、芘为唯一碳源及能量的基础培养基中生长。本发明的鞘氨醇单胞菌属菌株，可以用新鲜培养的生长期菌种或是固定化菌株对菲和芘进行降解处理。本发明所达到的有益效果是本发明提供的鞘氨醇单胞菌属菌株对多环芳烃菲和芘具有极强的转化能力，降解速度快，降解率高达85 95%。该菌株可作为游离生物菌制剂或固定化菌株，投加到现有的エ业废水、生活污水处理系统中，对含多环芳烃废水进行降解处理，提高原处理系统的反应效率，降低能耗，缩短反应时间，增强原处理系统的处理能力和效率；另外，该菌株可对受多环芳烃菲和芘污染的自然水体进行修复处理，广泛应用在エ业污水、生活污水及受污染的自然水体中。
图I pH对鞘氨醇单胞菌数量及对菲降解作用的影响 一■ ー鞘氨醇单胞菌细胞数量(lg(Cell/L) )，一□一菲去除率 图2 pH对鞘氨醇单胞菌数量及对芘降解作用的影响
一■ ー鞘氨醇单胞菌细胞数量(lg(Cell/L) )，一□一芘去除率图3.鞘氨醇 单胞菌的细胞生长与菲的降解曲线关系图 一■ ー鞘氨醇单胞菌细胞数量(lg(Cell/L) )，一□一菲去除率 图4.鞘氨醇单胞菌的细胞生长与芘的降解曲线关系图 一■ ー鞘氨醇单胞菌细胞数量(lg(Cell/L) )，一□一芘去除率 图5.实验反应装置，(I).流化床；(2).取样ロ ；(3).转子流量计；(4).空压机；
(5).增压泵；(6).循环水槽；(7).加热装置
图6流化床反应器中对含菲、芘废水降解的应用
一■一菲浓度(mg/L)，一▲一芘浓度(mg/L)，一 A —菲去除率，一〇一芘去除率 图7流化床反应器中对含高浓度菲、芘废水降解的应用 一■一菲浓度(mg/L)，一▲一芘浓度(mg/L)，一 A —菲去除率，一〇一芘去除率 图8鞘氨醇单胞菌对受菲、芘污染自然水体生物修复的应用
一A —处理组菲浓度(mg/L), —□一处理组花浓度(mg/L), —▲一对照组菲浓度(mg/L) 一■一对照组芘浓度(mg/L)。
具体实施例方式实施例I pH对鞘氨醇单胞菌数量及菲降解作用的影响
[I]在250ml的锥形瓶中加入50ml培养基(使菲最终浓度为15mg/L)。[2]将鞘氨醇单胞菌属菌株的细胞液体培养物加入上述[I]的锥形瓶中，调节培养基pH为3 10，28°C，80r/min ,好氧培养。在初始菲浓度为15mg/L条件下，培养14d，測定PH值对鞘氨醇单胞菌数量及菲去除率的影响。图I为pH对鞘氨醇单胞菌数量及对菲降解作用的影响。结果表明，当PH为3时，鞘氨醇单胞菌生长受到较大抑制，细胞数最低，只有IO3左右；相对应的菲的降解率最小，只有12. 3% ;当pH上升到7. 2时，鞘氨醇单胞菌生长最好，对应的细胞数接近于108，对菲的降解效果最好，达到85%左右，而当pH逐步升高时，鞘氨醇单胞菌数量逐渐下降，对菲的降解效果也逐步下降，PH升高到9. 3时，鞘氨醇单胞菌数量下降到IO4左右，对菲的降解率也下降到23. 4%，表明鞘氨醇单胞菌最佳生长pH为 7. 2。实施例2 pH对鞘氨醇单胞菌数量及芘降解作用的影响
[I]在250ml的锥形瓶中加入50ml培养基(使芘最终浓度为15mg/L)。[2]将鞘氨醇单胞菌属菌株的细胞液体培养物加入上述[I]的锥形瓶中，调节培养基pH为3 10，28°C，80r/min ,好氧培养。在初始芘浓度为15mg/L条件下，培养14d，測定PH值对鞘氨醇单胞菌数量及芘去除率的影响。图2为pH对鞘氨醇单胞菌数量及对芘降解作用的影响。结果表明，当PH为3时，鞘氨醇单胞菌生长受到较大抑制，细胞数最低，只有IO3左右；相对应的菲的降解率最小，只有11. 6% ;当pH上升到7. 2时，鞘氨醇单胞菌生长最好，对应的细胞数接近于108，对菲的降解效果最好，达到84. 1%，而当pH逐步升高时，鞘氨醇单胞菌数量逐渐下降，对芘的降解效果也逐步下降，pH升高到9. 3时，鞘氨醇单胞菌数量下降到IO4左右，对菲的降解率也下降到19. 2%，表明鞘氨醇单胞菌最佳生长pH为7. 2。实施例3
本发明在菲降解研究中的应用，其步骤如下[I]在250ml的锥形瓶中加入50ml培养基(使菲最终浓度为15mg/L)。[2]将鞘氨醇单胞菌属菌株的细胞液体培养物加入上述[I]的锥形瓶中，28°C，80r/min，好氧培养。每隔24小时取样測定。图3为鞘氨醇单胞菌的细胞生长与菲的降解曲线图。从图3可以看出，当菌体浓度达到IO7CelVL时足以使菲降解，接种12天后，菲的去除率接近85%。实施例4
本发明在芘降解研 究中的应用，其步骤如下
[I]在250ml的锥形瓶中加入50ml培养基(使芘最终浓度为15mg/L)。[2]将鞘氨醇单胞菌属菌株的细胞液体培养物加入上述[I]的锥形瓶中，28°C，80r/min，好氧培养。每隔24小时取样測定。图4为鞘氨醇单胞菌的细胞生长与芘的降解曲线图。从图4可以看出，当菌体浓度达到IO7CelVL时足以使芘降解，接种12天后，芘的去除率接近85%。实施例5
本发明在实验室模拟流化床反应器中对含菲、芘废水降解的应用，其步骤如下
[I]图5为实验室模拟的流化床反应器。实验在有效容积为I. 7L(内径8cm，高50cm)并带有保温夹套(夹套内通30±1°C的水)的流化床反应器中进行，鞘氨醇单胞菌属菌株的固定化菌株投入反应器中，固定化颗粒的填充率为10%，采用模拟废水间歇式进水，同时进行曝气，调节空气流量，定时从反应器取出水样，分析其中的DO值、pH、菲、芘的浓度，并按下式计算菲去除速率和花去除率
菲去除率=(菲进水一菲出水)/菲进水X100%
芘去除率=(花进水一芘出水)/芘进水X100%
[2]实验进水中菲和芘浓度分别为15mg/L，在30°C，pH 7. 0 7. 2，曝气量为250ml/min条件下进行反应，每隔24个小时进行取样測定。图6是流化床系统进水菲和芘浓度、菲和芘去除率随时间的变化，结果表明，在15mg/L菲和芘的浓度条件下，经过30天的连续运行，流化床可以去除大部分的菲和芘，22天左右去除率分别高达95%和93%，去除效果显著。实施例6
本发明在实验室模拟流化床反应器中对含高菲、芘废水降解的应用，其步骤如下
[1]图5为实验室模拟的流化床反应器。实验在有效容积为I.7L(内径8cm，高50cm)并带有保温夹套(夹套内通30±1°C的水)的流化床反应器中进行，将鞘氨醇单胞菌属菌株的固定化菌株投入反应器中，固定化颗粒的填充率为10%，采用模拟废水间歇式进水，同时进行曝气，调节空气流量，定时从反应器取出水样，分析其中的DO值、pH、菲、芘的浓度，并按下式计算菲去除速率和花去除率
[2]实验进水中菲和芘浓度分别为50mg/L，在30°C，pH7. 0 7. 2，曝气量为250ml/min条件下进行反应，每隔24个小时进行取样測定。图6是流化床系统进水菲和芘浓度、菲和芘去除率随时间的变化，结果表明，在50mg/L高浓度菲和芘条件下，经过30天的连续运行，流化床可以去除大部分的菲和芘，22天左右去除率分别达到75%和74%，去除效果明显。实施例7
本发明的鞘氨醇单胞菌对自然水体(太湖水)中含菲、芘的生物修复研究，其步骤如下
[I]取300ml灭菌的富营养化太湖水加入500ml的锥形瓶中，添加含菲芘的母液，使菲、芘最終浓度为2.0mg/L。将分离纯化得到的鞘氨醇单胞菌菌株培养、富集，取对数生长期的菌液，按接种量3%转接到装有灭菌湖水的三角瓶中。细菌密度设为3. 8X IO8Cel 1/L，于28°C，pH 7.0 7.2，80r/min条件下好氧培养。每组均设3个平行，以未接菌组作对照，每隔24小时取样测定菲、芘的残留量。实验结果表明，经过连续7天时间的反应，当鞘氨醇单胞菌数量达到IO8时，可以有效的去除多环芳烃中的菲和芘，去除率达到95%，为对自然水体(太湖水)中含菲、芘的生物修复提供了有效途径
权利要求
1.一种鞘氨醇单胞菌属菌株、游离生物菌制剂或固定化菌株在多环芳烃降解中的应用。
2.一种鞘氨醇单胞菌属菌株、游离生物菌制剂或固定化菌株在受多环芳烃污染的工业废水或生活污水处理中的应用。
3.一种鞘氨醇单胞菌属菌株、游离生物菌制剂或固定化菌株在受多环芳烃污染的自然水体生物修复中的应用。
全文摘要
本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及鞘氨醇单胞菌菌株在多环芳烃高效降解中的应用。本发明涉及的鞘氨醇单胞菌菌株，能够以多环芳烃菲、芘为唯一碳源和能源生长繁殖，将菲、芘完全矿化。其菌液、休眠细胞以及固定化菌株均可对多环芳烃菲和芘进行降解，对多环芳烃具有高效降解作用，为含多环芳烃的工业废水、生活污水的处理提供了保障；另外，能将含2mg/L多环芳烃菲、芘的自然水体(湖水)降解95%以上，为自然水体生物修复提供了有效途径，适用于含多环芳烃工业废水、生活污水的处理，并可为受多环芳烃污染的自然水体生物修复提供有效途径。
文档编号A62D3/02GK102614619SQ201110048168
公开日2012年8月1日 申请日期2011年3月1日 优先权日2011年3月1日
发明者冯露露, 吴宁梅, 周涛, 周莉, 李正魁, 王易超, 范念文, 赵琳 申请人:南京大学