专利名称：一种可高效降解苯并[a]芘的不动杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及环境难降解有机物处理领域，特别涉及一种苯并[a]芘高效降解菌系及其应用。
背景技术：
苯并[a]芘是一种具有明显致畸、致癌、致突变的有机化合物，它是由一个苯环和一个芘分子结合而成的多环芳烃类化合物。苯并[a]芘主要产生于石油、煤炭、木材、气体燃料和纸张等碳氢化合物的不完全燃烧及其在还原过程中的热分解作用；因此，苯并[a] 芘广泛存在于煤焦油、各类碳黑和煤、石油等燃烧产生的烟气、香烟烟雾、汽车尾气中，以及焦化、炼油、浙青、塑料等工业污水中。地面水中的苯并[a]芘除了工业排污外，主要来自洗刷大气的雨水、储水槽及管道涂层淋溶等。人们长期暴露在含有苯并[a]芘的环境中，会造成慢性中毒；研究表明，生活环境中的苯并[a]芘含量每增加1%，肺癌的死亡率即上升 5%。目前苯并[a]芘(BaP)与黄曲霉毒素和亚硝胺已被美国环保局列入优先控制的有毒有机污染物黑名单，是全世界公认为的三大致癌物质。近年来，随着石油及石油产品的大量使用，环境中的苯并[a]芘有不断增多的趋势。在自然环境条件下苯并[a]芘的水解和光解速率都非常缓慢，如不加以处理必定会造成较大的危害。相对于化学和物理处理方法，微生物法由于具有二次污染少，成本低，操作简单等特点而被广泛使用；其在污染物的迁移转化乃至最终消失中占有重要地位，是环境中多环芳烃类物质去除的最主要途径。微生物能将苯并[a]芘完全矿化，最终将其转化为无毒、无害的无机物质CO2和水，被认为是去除环境中苯并[a]芘的最佳方法。然而，目前发现的具有苯并[a]芘降解能力的细菌种类单一，且降解速率和代谢活性较低，降解能力不强，因此发掘更多的具有较强分解代谢能力的苯并[a]芘降解菌，并将其应用于环境污染物的去除过程，将具有重大的环境意义。
发明内容
本发明的目的在于针对苯并[a]芘生物降解效率低的难题，提供一种高效苯并 [a]芘降解菌及其应用。本发明提供的不动杆菌Acinetobacter sp. Bap30已于2011年1月洸日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC Na 4586。菌株Acinetobacter sp. Bap30是从中国农业大学东校区家属区下水道废水中取样，经驯化、分离及纯化得到的一株革兰氏阴性细菌。形态特征菌株Bap30在37°C下，牛肉膏蛋白胨培养基上培养IMi后，生长为黄色的圆形菌落，菌落边缘整齐，表面湿润光滑；通过革兰氏染色后在显微镜下，菌体呈细小短竿状，大小为1.0 3.0 μ m，接触酶反应结果为阳性，氧化酶反应结果为阴性。根据其形态特征和生理生化特征及其16S rRNA基因序列，鉴定该菌株为不动杆菌，该菌株的16S rRNA具有如序列表示所示的核苷酸序列，序列长度为1390bp。
CGAGCGGAGAGAGGTAGCTTGCTACTGATCTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTTCGAAAGGAATGC
TAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTA-—GCTAG-TTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTTTAGTTAATACCTAGAGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGG-CTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGCTAATTAAGTCAAATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGTTAGCTAGAGTGTGGGAGAGGATGGTA
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AAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCTACCTAGCGATAGGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGAAGTAGCTAGCCTAACTGCAAAGA根据其形态特征和生理生化特征及其16S rRNA基因序列，鉴定该菌株为不动杆菌 Acinetobacter sp. 0该菌株能在苯并[a]芘浓度为0_200mg/L的环境中生长繁殖；在好氧条件下，无机盐培养基中，该菌能以苯并[a]芘为唯一碳源和能源生长繁殖，20天内对苯并[a]芘(初始浓度为40mg/L)的降解率达28. 66%。该菌株在中性或偏酸或偏碱性的较宽pH值范围内均能降解苯并[a]芘，最适生长与降解的PH值为5. 5-9. 5，优选为5. 5-7. 0。该菌株降解苯并[a]芘的最佳接种量为0. 5% -10%，优选为2% _5%。该菌株降解苯并[a]芘的最佳装液量为5mL/50mL-30mL/50mL，优选为 5mL/50mL-15mL/50mLo添加适量的共代谢底物，可以有效促进该菌株的生长，提高该菌株对苯并[a]芘的降解速率。所述共代谢底物可为蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、醋酸钠或可溶性淀粉。上述共代谢底物优选为蔗糖，最适浓度范围为40-100mg/L。添加适量的共代谢底物菲，也可促进该菌株对苯并[a]芘的降解。菲添加的最适浓度范围为20_40mg/L。本发明的又一目的在于提供一种用于高效降解苯并[a]芘的微生物菌剂，其活性成分为所述的菌株Acinetobacter sp. Bap30o本发明的不动杆菌及其应用与现有技术相比较有如下有益效果(1)本发明提供的菌株在纯培养条件下，20天内对苯并[a]芘的去除率可达 28. 66 %，与已有菌株相比，降解率大大提高。(2)当苯并[a]芘和菲共同存在时，该菌株在20天内对苯并[a]芘的去除率达 48. 87%，对菲的去除率达100%。利用这些特点，本发明菌株可用于降解水环境中的单一高环多环芳烃苯并[a]芘或高环多环芳烃混合物污染物，或者用于土壤环境中的生物修复；该菌株同时为高环多环芳烃共代谢机理研究提供了一种新的种质资源。
图1为菌株Acinetobacter sp. Bap30的生长与苯并[a]芘的降解曲线图2为不同起始pH值对菌株Acinetobacter sp. Bap30降解苯并[a]芘的影响。图3为不同接种量对菌株Acinetobacter sp. Bap30降解苯并[a]芘的影响。图4为不同装液量对菌株Acinetobacter sp. Bap30降解苯并[a]芘的影响。图5为菌株Acinetobacter sp. Bap30对苯并[a]芘和菲混合体系的降解效果。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1 菌株Acinetobacter sp. Bap30的分离纯化方法与降解芘的性能一、高效降解苯并[a]芘菌株Bap30的分离纯化方法该方法有以下步骤1、将IOmg苯并[a]芘溶于50mL丙酮溶液中，使苯并[a]芘终浓度为200mg/L ；2、取适量脱脂棉，浸泡于上述苯并[a]芘的丙酮溶液中，放置过夜；3、次日用网兜将脱脂棉包裹起来，并用结实的长绳拴住网兜，投置于中国农业大学东校区家属区下水道中；4、放置21日后，将脱脂棉取出，放置在装有50mL驯化培养基的250mL三角瓶中， 驯化培养基的有效成分为(NH4)2SO4 lg, K2HPO4 2g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，NaClO. lg，FeCl3 0. 5g，CaCl2 0. 5g，苯并[a]芘 0. 04g,蒸馏水 IOOOmL, pH 值为 7. O ；5、将上述三角瓶置于160r/min、37°C摇床中振荡培养；6、经过若干代反复驯化后，取ImL培养液均勻涂布于含200mg/L苯并[a]芘的无机盐平板上，无机盐培养基的主要成分为=(NH4)2SO4 IgjK2HPO4 2g，MgSO4 · 7H20 0. 5g, NaCl 0. lg, FeCl3 0. 5g，CaCl2 0. 5g，琼脂 20g,蒸馏水 IOOOmL, pH 值为 7. 0 ；
7、37°C，培养3-5天，从平板上挑取特征不同、生长旺盛且稳定的菌落，在牛肉膏蛋白胨固体平板上反复划线分离以获得纯菌种。将纯化后的单菌落再接种到苯并[a]芘无机盐液体培养基中，在160r/min、37°C 摇床中避光振荡培养20天，选取降解率最高的菌株Bap30作为研究菌株。并将该菌株于 2011年1月沈日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)， 保藏号为CGMCC Na 4586。二、高效降解菌株Bap30对苯并[a]芘的降解性能实施例1 菌株Acinetobacter sp. Bap30的分离纯化方法与降解芘的性能将上述菌株Bap30接种至含苯并[a]芘40mg/L的无机盐培养液(该培养基的成分为(NH4)2SO4 lg，K2HPO4 2g，MgSO4 ·7Η20 0.5g，NaCl 0. lg，FeCl3 0. 5g, CaCl2 0.5g，苯并 [a]芘0. 04g，蒸馏水1000mL，pH值为7. 0)中，在160r/min、37°C摇床中避光振荡培养，在第 0、4、8、12、16、20天的同一时间分别取样，测定培养液中菌密度和苯并[a]芘的残留量，实验结果见图1。从图1可以看出，菌株对苯并[a]芘的快速降解期为4-12d，到降解的后期 (12-20d)，菌株对苯并[a]芘的降解曲线趋于平缓，到第20天时，菌株的OD值达到0. 195， 苯并[a]芘的降解率达到最高，为28. 66%。本实施例说明分离驯化得到的降解菌可利用苯并[a]芘作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，并且具有高效降解苯并[a]芘的能力。实施例2 不同起始pH值对菌株Acinetobacter sp. Bap30的生长和降解苯并[a] 芘的影响调节无机盐培养基(该培养基的成分为=(NH4)2SO4 lg, K2HPO4 2g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，NaCl 0. IgjFeCl3 0. 5g, CaCl2 0. 5g，苯并[a]芘 0. 04g，蒸馏水 IOOOmL)的 pH 值分别为 5. 5、6. 0、7. 0、8. 0、9. 0、9. 5，苯并[a]芘初始浓度为 40mg/L，接种量为 5% (V/V), 160r/ min、37°C摇床中振荡培养7天，测定细菌OD值和苯并[a]芘的残留率，结果见图2。由图2可以看出，在pH为6. 0时，降解菌对苯并[a]芘的降解作用最强，7天后降解率为17. 89%，在pH为9. 5时降解率受到较大的抑制，仅为1. 57%，说明菌株在偏酸性环境中更容易利用降解苯并[a]芘。在酸性到弱碱性环境中，菌株都能对苯并[a]芘进行降解，为其在不同PH环境中的应用提供了保证。实施例3 不同接种量对菌株的生长和降解苯并[a]芘的影响在接种量分别为0. 5%、1. 0%、2. 0%、5. 0%和10. 0%的无机盐培养液(该培养基的成分为(NH4)2SO4 lg, K2HPO4 2g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，NaCl 0. lg, FeCl3O. 5g，CaCl2 0. 5g， 苯并[a]芘0.04g，蒸馏水lOOOmL，pH值为7.0)中，7天后苯并[a]芘的残留率分别为 98. 03%、93· 27%、87· 46%、85· 09%与 89. 21% (见图 3)。由图 3 可知，一定范围内，接种量越大，菌密度越高，菌株的降解率越来越高，但接种量并非越大越好，当接种量为10.0% 时，比接种量为5. 0%时的降解率低。实施例4 不同装液量对菌株的生长和降解苯并[a]芘的影响以不同的装液量(5mL/50mL、10mL/50mL、15mL/50mL、20mL/50mL、25mL/50mL、 30mL/50mL)向三角瓶中加入无机盐培养液(该培养基的成分为=(NH4)2SO4 lg, K2HPO4 2g， MgSO4 · 7H20 0. 5g, NaCl 0. lg, FeCl3 0. 5g, CaCl2O. 5g，苯并[a]芘 0. 04g，蒸溜水 IOOOmL, pH值为7. 0)，苯并[a]芘初始浓度为40mg/L，接种量为5% (V/V)，于160r/min、37°C摇床中振荡培养7天，苯并[a]芘的残留率分别为83. 28%,85. 09%,86. 57%,91. 21%,94. 83%, 97. 46% (见图4)，说明培养基中溶解氧浓度的高低直接影响微生物的生长和代谢，装液量越少，菌密度越高，溶氧量越大，有利于该菌株产生活性物质，所以降解率越高。实施例5 添加碳源对菌株的生长和降解苯并[a]芘的影响将菌株Bap30接种至含苯并[a]芘40mg/L的无机盐培养基(该培养基的成分为 (NH4)2SO4 lg，K2HPO4 2g，MgSO4 ·7Η20 0. 5g, NaCl 0. lg，FeCl3 0. 5g，CaCl2O. 5g，苯并[a]芘 0. 04g，蒸馏水lOOOmL，pH值为7. 0)中，在培养液中分别添加终浓度为40mg/L的蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、醋酸钠和可溶性淀粉作为共代谢底物，7天后测定培养液中的菌密度和苯并 [a]芘残留量，计算降解率，结果如表1所示。由表1可知，采用蔗糖、麦芽糖和葡萄糖作为碳源时降解率比较高，添加可溶性淀粉的效果最不明显，可见选择合适的碳源对提高菌株的降解率至关重要。表1中的结果还表明，蔗糖是最佳的共代谢碳源。表1添加碳源对菌株Acinetobacter sp. Bap30生长和苯并[a]芘降解率的影响
权利要求
1.不动杆菌Acinetobacter sp. Bap30，保存编号为 CGMCC Ns 4586。
2.权利要求1所述的不动杆菌Acinetobactersp. Bap30在苯并[a]芘降解中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于能以苯并[a]芘为唯一碳源和能源生长繁殖，20天内对苯并[a]芘(初始浓度40mg/L)的降解率达28. 66%。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于该菌株降解苯并[a]芘的最佳接种量为0. 5% -10%，优选为2% -5%。
5.根据权利要求2-4任一所述的应用，其特征在于该菌株降解苯并[a]芘的最佳装液量为 5mL/50mL-30mL/50mL，优选为 5mL/50mL-15mL/50mL。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于添加适量的共代谢底物，可以有效促进该菌株的生长，提高该菌株对苯并[a]芘的降解速率。所述共代谢底物可为蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、醋酸钠或可溶性淀粉。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于添加适量的共代谢底物菲，也可促进该菌株对苯并[a]芘的降解。菲添加的最适浓度范围为0-100mg/L，优选为20-40mg/L。
8.一种用于降解苯并[a]芘的微生物菌剂，其活性成分为权利要求1所述的不动杆菌 Acinetobacter sp.Bap30o
全文摘要
本发明公开了一株苯并[a]芘降解菌及其应用，该苯并[a]芘降解菌为Acinetobacter sp.Bap30，CGMCC №4586。该菌株能以苯并[a]芘为唯一碳源和能源生长，在苯并[a]芘浓度为40mg/L的无机盐培养基中，37℃振荡培养20天，菌株对苯并[a]芘的降解率可达28.66％。添加适量的共代谢碳源，如蔗糖和麦芽糖等可有效提高菌株对苯并[a]芘的降解速率。当以另一多环芳烃类物质菲为共代谢基质与苯并[a]芘混合存在时，该菌株对苯并[a]芘的降解率可提高至48.87％，同时可实现对菲100％的去除。本发明所提供的菌株可为水环境或土壤环境中高环多环芳烃的降解提供新的微生物资源。
文档编号A62D3/02GK102174445SQ20111004739
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月28日 优先权日2011年2月28日
发明者倪晋仁, 朱婷婷 申请人:北京大学