一种石油降解菌株及分离方法、石油降解菌剂及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及石油污染治理技术领域，尤其涉及一种石油降解菌株及分离方法、石 油降解菌剂及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 石油又称原油，是一种粘稠的、深褐色液体。石油中不同的化合物组分，可分为饱 和烃(包括烷烃和环烷烃）、芳香烃(不饱和烃）、非烃(包括氧、硫、氮的化合)和沥青质(碳、 氢、氧、硫、氮等多种元素组成的复杂结构的高分子化合物）。
[0003] 随着社会的不断发展，人类对能源的需求与日倶增。石油作为一种宝贵的能源和 化工原料，它的普及使用给人类的生产生活带来了巨大的便利。但与此同时，由于使用不当 和日渐频繁的原油泄漏事故的发生，石油，这把双刃剑，在发挥着正面作用的同时，其负面 影响也不容忽视。由于井喷、船舶漏油以及输油管道的泄漏等事故造成的海洋石油污染日 渐增多，严重影响了生态环境及海洋生物资源。从目前的海洋石油污染事件来看，石油污染 大部分集中在海洋和河流入海口附近的水体和沉积物中。全世界范围内的海洋石油污染事 件频繁发生，对海洋生态系统造成了严重破坏。另外，石油的主要化学成分是烷烃和苯、甲 苯、二甲苯等复杂芳香烃等，不仅有致癌变、致畸变、致突变等作用，并很可能在动植物及人 体内富集，危害生物健康。
[0004] 虽然环境中存在着大量微生物，但其中可以利用石油烃物质作为碳源和能源的并 不多。一般而言，当石油污染抑制部分微生物生长的同时，恰恰能促进利用石油烃作为碳源 和能源的微生物生长。据报道，降解烃类的微生物一般只占微生物群落总数的不到1%。而 当石油污染物存在时，降解烃类微生物比例会增加到10%。由此可见石油对于该类菌种具 有某种刺激作用，能够诱导其生长增殖。
[0005] 针对日益严重的石油污染问题，国内外研究人员已经利用物理、化学和生物修复 法在该领域取得了一定的进展，但石油污染治理工作仍然任重而道远。物理处理法主要通 过物理方法和机械装置回收溢油。主要使用的方法有围油栏、吸油船、磁性分离和吸着材料 等。该方法处理海面及海岸带油污的效率最高，但对于厚度小于0.3cm的薄油层和乳化油效 果较差，并且设备庞大、耗费高。化学方法主要使用分散剂、凝油剂、集油剂和沉降剂等，但 化学方法的本质却是向海洋中投入人工合成的化学污染物。不但成本高，也造成了二次污 染。正是由于物理和化学处理法的种种弊端，其应用受到限制。而生物修复方法利用微生物 消除水体表面油膜和分散水中溶解的石油烃类，具有成本低、效率高、对环境友好、不产生 二次污染等显著优点，已经成为一种经济效益和环境效益倶佳的、解决石油污染问题的有 效方法。
[0006] 目前，生物修复法治理石油污染主要依赖于高效石油降解菌株的筛选。而石油降 解菌的筛选主要以实验室研究为主，更多的是以单一石油烃组分或几种石油烃及其中间产 物为碳源进行筛选。然而，将石油降解菌真正应用到实际环境中治理石油污染的报道还相 对较少。
【发明内容】
[0007] 鉴于此，有必要提供一种能够有效降解石油的石油降解菌株和石油降解菌剂。
[0008] -种石油降解菌株，其特征在于，所述菌株为迪茨氏菌属(Dietzia sp.)CN_3,保 藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC Μ 2015537。
[0009] -种上述石油降解菌株的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0010]将蓬莱19-3溢油点的沉积物放入ΒΗΒ培养基中，置于160rpm-200rpm的摇床中，在 30°C培养1-2周，得到富集培养菌液，将所述富集培养菌液分离纯化，得到所述石油降解菌 株；
[0011]其中，所述BHB培养基中添加质量体积浓度为0.5%-1 %石油作为唯一的碳源和能 源；
[0012] 所述BHB培养基的组分为：
[0013] MgS〇4 0.2g，CaCl2 0.02g，KH2P〇4 lg，K2HP〇4 lg，NH4N03 lg，FeCl2 0.05g，NaCl 25g，蒸馏水 1000mL，pH 为 6-8。
[0014] 在其中一个实施例中，将所述富集培养菌液分离纯化包括如下步骤：
[0015] 取所述BHB培养基中培养后的菌液加入至质量体积浓度为0.9%的无菌生理盐水 中，依次稀释成10'10'ΚΓ4的梯度稀释液；
[0016] 分别取三种不同梯度稀释液涂布于BHA培养基平板上，在30°C恒温培养箱中培养 24-48小时，其中，所述BHA培养基含质量体积浓度为0.5%-1 %的石油；
[0017] 选择不同形态的单菌落，分别在BHA培养基平板上进行划线分离，重复划线分离操 作，直至形成形态单一的纯化菌落，得到所述石油降解菌株，其中，所述BHA培养基含质量体 积浓度为0.5 %-1 %石油；
[0018] 所述BHA培养基的组分为:MgS〇4 0.2g，CaCl2 0.02g，KH2P〇4 lg，K2HP〇4 lg，NH4N03 lg，FeCl2 0.05g，NaCl 25g，琼脂 15g，蒸馏水 1000mL，pH为6-8。
[0019] -种石油降解菌剂，包括石油降解菌株迪茨氏菌属(Dietzia sp.)CN_3,所述石油 降解菌株迪茨氏菌属CN-3的保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC Μ 2015537〇
[0020] -种上述石油降解菌剂的制备方法，包括如下步骤：
[0021 ]无菌条件下取纯化的石油降解菌株CN-3于试管斜面培养基I中，在30°C，培养24-48小时，得到一级种子，其中，所述培养基I的组成为:Difco? Marine Agar 2216培养基 55. lg，1000mL蒸馈水，pH为6-8;
[0022] 无菌条件下取所述一级种子接入到培养基Π 中，置于160rpm-200rpm的摇床中，在 30°C，培养24-48小时，得到二级种子，其中，所述培养基Π 组成为:Difco? Marine Broth 2216培养基37.48，10001^蒸馏水，？!1为6-8;
[0023]按体积比为10%的接种量将所述二级种子接入到发酵罐的培养基m中，置于 80rpm-100rpm的摇床中，在30°C，培养12-24小时，得到所述石油降解菌剂，其中，所述培养 基ΙΠ 的组成为：蛋白胨8g，酵母粉2g，MgS〇4 0.2g，CaCl2 0.02g，KH2P〇4 lg，K2HP〇4 lg，FeS〇4 0.07g，NaCl 10g，蒸馏水 1000mL，pH 为 6-8。
[0024] -种采用上述石油降解菌剂降解石油的方法，包括如下步骤:按照1%-2%的接 种量将石油降解菌剂接种到石油质量体积浓度为〇 . 5%-1 %的BHB培养基中，在30°C， 160rpm_200rpm摇床中培养1-2周；
[0025] 所述BHB培养基的组分为：
[0026] MgS〇4 0.2g，CaCl2 0.02g，KH2P〇4 lg，K2HP〇4 lg，NH4N03 lg，FeCl2 0.05g，NaCl 25g，蒸馈水 1000mL。
[0027] 在其中一个实施例中，所述BHB培养基的pH为6-8。
[0028] 本发明还提供上述石油降解菌株或石油降解菌剂在降解石油中的应用。
[0029] 上述石油降解菌株或石油降解菌剂还可以通过生物修复法去除环境中石油污染 物。
[0030] 上述石油降解菌株或石油降解菌剂还可以通过生物修复法治理石油污染土壤。 [0031 ]上述石油降解菌株CN-3，在中性偏碱性的环境中对石油的降解效果较好，并且能 够耐受高盐度环境，特别适应于海洋环境。从而扩大了 CN-3菌株在海洋石油污染治理中的 应用范围，使其更加具有应用前景。
[0032] 上述石油降解菌株的分离方法和石油降解菌剂的制备方法中，在石油降解菌的富 集、分离纯化、种子液的制备和菌剂的发酵过程中，培养基都是以石油为唯一碳源和能源。 这种条件下分离的石油降解菌株，以及制备的石油降解菌剂能够对石油有更好的耐受力， 有利于提高其在实际石油污染环境中的生存能力和降解效率等。
【附图说明】
[0033] 图1为一实施方式的石油降解菌株的分离方法流程图。
[0034] 图2为不同石油降解菌株降解饱和烃的气相色谱图（GC-FID)，从上至下依次为空 白对照组、菌株CN-1、菌株CN-2、菌株CN-3、菌株CN-4、菌株CN-5降解饱和烃的效果图。
[0035] 图3为石油降解菌株CN-3的扫描电镜图。
[0036]图4为一实施方式的石油降解菌剂的制备方法的流程图。
[0037]图5为石油降解菌剂CN-3实验组和空白对照组对石油的降解效果图。A为空白对 照组，只加入石油，未加入石油降解菌剂;B实验组，同时加入石油和石油降解菌剂CN-3。 [0038]图6为石油降解菌剂CN-3对石油组分饱和烃降解效果的GC-MS图。A为空白对照组， 未加入石