用于龋齿的替代疗法
【专利摘要】本发明提供可用于改善口腔健康的重组变形链球菌菌株。本发明的一个实施方案提供在易患龋齿的宿主中降低龋齿的发生率或严重性的方法，该方法包括口服给予宿主有效量的本发明分离的重组变形链球菌菌株，用于替代宿主口腔中的引起龋齿的变形链球菌宿主菌株。分离的重组变形链球菌菌株10可被包含在漱口剂、牙膏、口香糖、牙线、咀嚼片、食品或饮料中。
ATCC 55676
1995.06.02
【专利说明】用于龋齿的替代疗法
[0001] 优先权 该申请要求2012年2月27日提交的美国临时申请61/603,661和2012年2月27日 提交的美国临时申请61/603, 693的权益，此二者通过引用以其全部内容结合到本文中。
[0002] 发明背景 龋齿是世界上最流行的慢性感染性疾病之一。超过一半的5-9岁美国儿童具有至少一 个牙洞或牙填料；到17岁，几乎80%的美国年轻人已有牙洞。美国卫生和公众服务部.美 国的口腔健康：一种外科医生的总执行概要（Oral Health in America: A Report of the Surgeon General -Executive Summary)? Rockville, MD :美国卫生和公众服务部，国立牙 科和颅面研究，国立卫生研究院，2000。
[0003] 根据牙科，口腔和颅面数据资源中心，在美国有关治疗龋齿的年度支出估算为每 年400亿美元（$)。龋齿的特征在于牙釉质和牙本质的脱矿质化，最终导致牙齿的破坏。膳 食糖经常被误解为龋齿的原因；然而，龋齿的直接原因是由在牙齿表面上代谢糖的微生物 产生的乳酸。研究提示在大约700种口腔微生物中，变形链球菌 一种几乎在所有人中发现的细菌，是发生龋齿的主要病原体。变形链球菌定居于牙齿表面 上的牙菌斑中，当其将膳食糖转化为乳酸时，从碳水化合物代谢获得能量，而乳酸又继而促 进牙釉质和牙本质的脱矿质化，最终导致牙洞。矿物质丢失的速率取决于几个因素，包括变 形链球菌细胞存在的数目和其消耗糖的频率和量。
[0004] 利用细菌干扰（bacterial interference)，用非致病的、效应菌株替代致病菌株 例如变形链球菌的治疗方案被称为替代疗法。成功的替代疗法需要这样的效应菌株，其：1) 是非致病的，2)改变微环境以防止病原生物的定居或生长，和3)持续地定居于处于风险 的宿主以防止由目标病原生物引起的再感染，和在其中病原为宿主的天然菌群的一部分的 情况下，从处于风险的组织强有力地置换病原生物。
[0005] 替代疗法原理的应用需要分离变形链球菌的非致龋效应菌株，例如缺乏乳酸合成 的变形链球菌菌株，其可比宿主口腔中的天然变形链球菌更具竞争优势（outcompete)。本 领域需要稳定的、乳酸_缺乏的、变形链球菌的非致龋株，其可持续地定居于宿主口腔并比 其中的天然变形链球菌强有力地更具竞争优势，且其适合用于预防和/或治疗龋齿的替代 疗法。
[0006] 效应菌株抢先定居人的口腔且强有力地置换本土野生株的能力最初被认为是依 赖于大量的表型特性的复杂现象。然而，已发现单一表型特性可提供必要的选择性优势。从 人受试者分离出一种天然存在的变形链球菌菌株，其产生称为MU1140的羊毛硫抗生素，其 在针对其进行的试验中能够杀死几乎所有其它的变形链球菌菌株。参见例如，Hillman等 人，Infect. Immun. 44 :141 (1984)。已分离出不产生可检测的MUl 140或产生大约3倍 升高量的突变体。将突变体用于大鼠模型以使羊毛硫抗生素产生与定居潜力相关。已发现 这些菌株抢先定居于宿主且强有力地置换变形链球菌的本土株的能力随着MUl 140产生的 量增加而显著地增加。
[0007] 在人受试者中观察到MU1140产生和定居潜力之间的相同关系，其中需要反复暴 露于野生亲株以获得持久的定居（Hillman等人J. Dent. Res. 66:1092 (1985))，然而 单次暴露于产生3倍升高量的MU1140的菌株是足够的（Hillman等人J. Dent. Res. 66: 1092 (1987))。后一菌株完全替代人受试者口腔中的变形链球菌的本土株需要经过一年。 在此期间，推测它们对龋齿的易感性持续至本土变形链球菌的水平降至阈值水平之下。
[0008]为了进一步增加效应菌株的定居潜力用于龋齿的替代疗法，期望获得一或多株变 形链球菌，其产生升高量的MU1140或产生具有增加的特异性活性的这种分子的变体。这样 的菌株将减少效应菌株除去本土的、产乳酸菌株所需的时间并由此获得充分的有效性。这 样的菌株也更可能克服任何对定居的固有抗性，虽然目前尚不知道，其可存在于所治疗群 体的某些个体中。参见例如，Hillman, Fa/? Zee服e/zAod 82:361 - 366，2002。
[0009] 发明概述 在一个实施方案中，本发明提供分离的重组变形链球菌菌株，其包含： (a) 涉及乳酸合成的多核苷酸的突变，以使乳酸的表达在与野生型变形链球菌菌株比 较时减少约80%或更多； (b) 重组醇脱氢酶多核苷酸； (c) 编码包含式I的羊毛硫抗生素的重组多核苷酸：
【权利要求】
1. 一种分离的重组变形链球菌SM/ia/75·)菌株，其包含： (a) 涉及乳酸合成的多核苷酸的突变，以使乳酸的表达在与野生型变形链球菌菌株比 较时减少约80%或更多； (b) 重组醇脱氢酶多核苷酸； (c) 编码包含式I的羊毛硫抗生素的重组多核苷酸：
(SEQIDNO:1)，其中存在以下突变：PhelIle突变或PhelGly突变；Trp4Ala突变；Dha5Ala突变；Argl3Asp突变；或这些突变的两种或多种的组合。
2. 权利要求1的分离的重组变形链球菌菌株，其中包含式I的变异菌素还包含 Trp4insAla突变或ATrp4 突变。
3. 权利要求1的分离的重组变形链球菌菌株，其中在包含式I的羊毛硫抗生素中存在 以下氨基酸取代：Abu8Ala，或DhbHAla，或Abu8Ala和DhbHAla二者。
4. 权利要求1的分离的重组变形链球菌菌株，其还包含在涉及ComE、ComC或ComE和 ComC二者合成的多核苷酸中的突变，以使ComE、ComC，或ComE和ComC二者的表达在与变 形链球菌菌株比较时减少约80%或更多。
5. 权利要求1的分离的重组变形链球菌菌株，其还包含在涉及D-氨基酸合成的多核 苷酸中的突变，以使D-氨基酸的表达在与野生型变形链球菌菌株比较时减少约80%或更 多。
6. 权利要求5的分离的重组变形链球菌菌株，其中多核苷酸为或用于的启动 子。
7. 权利要求1的分离的重组变形链球菌菌株，其中重组醇脱氢酶多核苷酸是运动发 酵单胞菌醇脱氢酶多核苷酸或变形链球菌醇脱氢酶多核苷酸。
8. -种在易患龋齿的宿主中降低龋齿的发生率或严重性的方法，其包括口服给予宿 主有效量的权利要求1的分离的重组变形链球菌菌株，用于替代宿主口腔中引起龋齿的变 形链球菌宿主菌株。
9. 权利要求8的方法，其中分离的重组变形链球菌菌株包含在漱口剂、牙膏、口香糖、 牙线、咀嚼片、食品或饮料中。
10. -种用于降低龋齿的发生率或严重性的药物组合物，其包含权利要求1的分离的 重组变形链球菌菌株和药学上可接受的载体。
【文档编号】C07K14/315GK104321338SQ201380011223
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2013年2月22日 优先权日:2012年2月27日
【发明者】J.D.希尔曼, J.L.史密斯, S.R.威尔逊-斯坦福德 申请人:奥洁克公司, 得克萨斯农业及机械体系综合大学