一株好氧降解吲哚的贪铜菌及其应用的制作方法
【专利摘要】一株好氧降解吲哚的贪铜菌及其应用，属于微生物生物【技术领域】。该菌株分离自大连黑石礁海边泥土样品，2014年6月4日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.9265。菌株IDO为革兰氏阴性菌，短杆状，经16SrRNA基因序列测定，其与Cupriavidus具有较高的相似性，因此该菌分类命名为Cupriavidussp.IDO，菌株16SrRNA基因序列的GenBank登录号为KJ875862。该菌株利用多种芳香化合物作为唯一碳源生长，对吲哚具有较高的降解能力，菌株还具有较好的pH和温度耐受性，显示了其在含高浓度吲哚废水处理中的应用前景。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株好氧降解吲哚的贪铜菌及其应用，属于微生物生物【技术领域】。 一株好氧降解吲哚的贪铜菌及其应用
【背景技术】
[0002] 随着工业的发展，我国的水污染情况日益严峻。焦化废水、制药废水等工业废水中 都含有大量的氮杂环化合物，对环境危害严重。吲哚是工业废水中常见的氮杂环有机污染 物之一，具有较高的流动性和水溶性，因此对自然环境和人类健康存在潜在的危害。
[0003] 与物理化学法相比较，生物法具有对人和环境影响小、条件温和、成本低等优点， 因此在污染物处理中得到广泛应用。目前，国内外已有学者筛选到对吲哚具有降解能力的 菌株，如绿脓假单胞菌aerwgifliosa)、产碱杆菌sp.)等细 菌，黑曲霉菌（^5/76?/^ |77/^/>5/7/1§'6?/')、嗜热性侧抱霉菌（5)90/'0(/'/<^?7?从6?/--0/7力27(9)和拟 莖点霉菌等真菌都能以n引哚为唯一碳源进行生长。然而，这 些菌株降解吲哚的速率有限，目前为止报道最高的吲哚降解速率为60小时内降解100 mg/ L的吲哚。因此挖掘新的吲哚降解菌资源，加速吲哚的生物降解研究显得尤为重要。
[0004] 贪铜菌属是近年来受到普遍关注的可以用于治理环境污染的细菌，该菌属可以降 解多数芳香污染物，且可以应用于修复重金属污染等领域，但国内目前对于该菌属研究不 多。本发明采用的贪铜菌sp. ID0不仅能以吲哚为唯一碳源进行生长，而且 吲哚降解速率与已有报道具有明显的优势，因此该菌在吲哚废水处理中具有潜在的应用前 旦 -5^ 〇
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一株好氧降解吲哚的贪铜菌及其应用，该菌株能利用多种 芳香化合物作为唯一碳源生长，对吲哚具有较高的降解能力，菌株还具有较好的pH和温度 耐受性，其在含高浓度吲哚废水处理中的应用前景。
[0006] 本发明所涉及的一株好氧降解吲哚的贪铜菌（拉丁文分类命名为： Opriahi/ttssp. ID0)，所述菌株的登记入册编号为CGMCCNo. 9265,保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中 国科学院微生物研究所，保藏日期为2014年6月4日。所述菌株属于贪铜菌属，是革兰氏 阴性菌，菌体为短杆状，其16S rRNA基因序列Genbank登录号为KJ875862。
[0007] 所述菌株分离自大连黑石礁海边泥土样品，其纯化分离及生长培养基为无机盐培 养基，无机盐培养基的组成为：2. 0 g/L (NH4)2S04、2. 0 g/L KH2P04、3. 28 g/L Na2HP04*12H20 和0.00025 g/L FeCl3，在121 °C高温高压灭菌20 min的无机盐培养基中按要求添加0-250 mg/LD引哚，30°C，150 rpm条件震荡。
[0008] 所述菌株应用于吲哚的降解，在24小时内，菌株ID0在pH 5.0-8.0的范围内对 100 mg/L吲哚的降解率保持在85%以上。
[0009] 本发明的有益效果是：该菌株分离自大连黑石礁海边泥土样品，菌株ID0为革兰 氏阴性菌，短杆状，经16S rRNA基因序列测定，其与Q/priahdfe具有较高的相似性，因 此该菌分类命名为Ci/Ariarii/iAssp· IDO,菌株16S rRNA基因序列的GenBank登录号为 KJ875862。该菌株利用多种芳香化合物作为唯一碳源生长，包括苯甲酸、色氨酸、苯酚、儿茶 酚、水杨酸、靛红等，对吲哚具有较高的降解能力，能在18小时内完全降解100 mg/L的吲 哚，菌株能耐受200 mg/L吲哚。在24小时内，菌株IDO在pH 5.0-8. 0的范围内对100 mg/ L吲哚的降解率保持在85%以上，显示了其在含高浓度吲哚废水处理中的应用前景及具有 能够处理实际焦化废水的应用潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1是一株贪铜菌株ID0电镜图片。
[0011] 图2是一株贪铜菌株ID0对不同吲哚浓度的降解曲线。
[0012] 图3是一株贪铜菌株ID0在不同温度下对吲哚的降解率。
[0013] 图4是一株贪铜菌株ID0在不同起始pH下对吲哚的降解率。
【具体实施方式】
[0014] 实验材料和试剂 1.菌株：菌株ID0由本发明人2014年从大连黑石礁海边泥土样品中分离获得，菌种以 吲哚为唯一碳源培养，经过反复平板涂布分离纯化，得到纯培养物。
[0015] 2.培养基 无机盐培养基：2.0 g/L (NH4)2S04, 2.0 g/L ΚΗ2Ρ04, 3.28 g/L Na2HP04*12H20,0.00025 g/L FeCl3。
[0016] 无机盐固体培养基：无机盐培养基+ 2%琼脂。
[0017] 实施例1 :贪铜菌菌株的获得 将来源于大连黑石礁海边泥土样品经过稀释平板涂布后，将样品涂布在1/10 LB (NaCl 1 g/L、蛋白胨1 g/L、酵母粉0.5 g/L，pH=7,吲哚100 mg/L)平板上，30°C培养，挑 取单菌落用无机盐培养基（(NH4)2S0 4 2.0 g/L、KH2P04 2.0 g/L、Na2HP04*12H20 3.28 g/L、 FeCl3 0.00025 g/L、吲哚 100 mg/L)培养，30°C，pH 7.0,150 rpm 下获得菌液。IDO 的细胞 形态为短杆状，大小为0.5 μπι左右，如图1。
[0018] 实施例2 :菌株的16S rRNA分子鉴定 挑取无机盐固体培养基平板上生长的单菌落溶于10 μ?灭菌水中，99°C变性后离心取 上清液作为 PCR 扩增反应的模板。使用 TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit,以Forward primer/Reverse primer 2为引物，扩增目的片断。PCR反应体系总体积 为 50 KL:PCR Premix 25 KL，Forward Primer 0.5 KL，Reverse Primer 20.5 KL，模板DNA 5 μ?，无菌超纯水19 μ?。PCR反应条件为：94°C预变性5 min，经过30个循环，其中，94°C 变性1 min，55°C退火1 min，72°C延伸1.5 min，30个循环后，再于72°C延伸5 min，取5 μ? PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外检测。使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2.0 (大连宝生物公司TaKaRa)切胶回收PCR产物。16S rRNA序 列的测序工作上海生工生物工程有限公司完成。测序结果在Genbank中进行Blast比对， 结果显示与其序列相似性达到99%的均为贪铜菌识riahdkssp.)，因此将菌株ID0归属 于贪铜菌属。
[0019] >ID0 16S rRNA gene sequence TGCAGTCGAACGGCAGCACGGGGGCAACCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTG CCCTGTTGTGGGGGATAACTAGTCGAAAGATTAGCTAATACCGCATACGACCTGAGGGTGAAAGCGGGGGACCGTAA GGCCTCGCGCAATAGGAGCGGCCGATGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTA GCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAAT TTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGT CCGGAAAGAAATGGCCTGGGTTAATACCTCGGGTCGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTTGTAA GACAGGCGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATGGCGCTTGTGACTGCAAGGCTAGAGTATGTCAGAGGGGGGTA GAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGACGTCAC TGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACT AGTTGTTGGGGATTCATTTCTTCAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATT AAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTT ACCTACCCTTGACATGCCACTAACGAAGCAGAGATGCATTAGGTGCCCGAAAGGGAAAGTGGACACAGGTGCTGCAT GGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCTAGTTGCTACGA AAGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGG GTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTGCGTACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACGC ATCGTAGTCCGGATCGTAGTCTGCAACTCGACTACGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCG GTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTGCCAGAAGTAGTTAGCCTAA CCGCAAGGAG 实施例3 :贪铜菌IDO的底物广谱性测定 利用实施例1中的菌液，采用无机盐培养基培养，5%接菌量，具体考察了菌株IDO以多 种化合物为唯一碳源生长，包括苯甲酸、色氨酸、苯酚、儿茶酚、水杨酸、龙胆酸、吲哚、靛红、 喹啉、吡啶、萘、菲、联苯等，各种化合物浓度为50 mg/L。表1为贪铜菌ID0在不同化合物为 唯一碳源的培养基中的作用情况。
[0020] 表1贪铜菌ID0的底物广谱性考察
【权利要求】
1. 一株好氧降解n引哚的贪铜菌（CopriariiAAssp. IDO)，其特征在于：所述菌株的登记 入册编号为CGMCC No. 9265,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为 2014年6月4日。
2. 根据权利要求1所述的一株好氧降解吲哚的贪铜菌，其特征在于：所述菌株的培养 条件：无机盐培养基的组分为 2.0 g/L (NH4)2S04、2. 0 g/L KH2P04、3. 28 g/L Na2HP04*12H20 和0.00025 g/L FeCl3，在121 °C高温高压灭菌20 min的无机盐培养基中按要求添加0-250 mg/LD引哚，30°C，150 rpm条件震荡。
3. 权利要求1所述的一株好氧降解吲哚的贪铜菌应用于吲哚的降解。
【文档编号】C02F3/02GK104099274SQ201410335175
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】曲媛媛, 马桥, 张照婧, 沈娥, 王经伟, 沈文丽, 李端行, 李会杰, 刘紫嫣, 周集体 申请人:大连理工大学