一种以木质纤维素降解液作碳源制备细菌纤维素的方法与流程

本发明涉及生物材料的降解及其制备技术领域，特别涉及一种以木质纤维素降解液作碳源制备细菌纤维素的方法。

背景技术：

细菌纤维素作为一种新型的生物材料，具有优良的物理和化学性能：高纯度，高持水性，透气性，高抗张强度和弹性，良好的生物亲和性，生物相容性。使其在医疗，食品，造纸，化妆品等多个行业领域具有广泛的应用前景。

木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，每年仅陆生植物就可以产生木质纤维素大约500亿吨，占地球生物总量的60-80％。我国拥有非常丰富的木质纤维素原料，仅仅农作物秸秆、皮壳一项，每年产量就达到4亿多吨，其中玉米秸杆(35％)，小麦秸杆(21％)和水稻秸秆(19％)是我国的三大秸秆。农作物秸秆主要以焚烧和粉碎的方式处理，不仅造成资源的浪费，而且污染环境。

细菌纤维素由吡喃型葡萄糖残基通过β-1，4-糖苷键连接而成，木质纤维素是d-葡萄糖以β-1，4-糖苷键组成的大分子多糖，二者具有同源性。将木质纤维素降解，提供碳源进行细菌纤维素的合成是一种有效的木质纤维素处理方式，尤其在世界人口不断增长，资源紧缺和环境污染日益严重的情况下，利用木质纤维素降解合成细菌纤维素具有划时代意义和广泛的应用前景。

技术实现要素：

本发明涉及提供一种以木质纤维素降解液作碳源制备细菌纤维素的方法，该方法绿色环保，简单易行，既解决了环境压力又创造了经济价值，为其他行业提供了一种优质材料。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种以木质纤维素降解液作碳源制备细菌纤维素的方法，包括下列步骤：

(1)将剪成小段的小麦秸秆与0.5mnaoh溶液按料液比1∶20混合，于高压蒸汽灭菌锅中121℃预处理1小时，预处理后的样品经过纱布过滤，并用大量的去离子水洗涤至洗液呈中性。弃去上清液，保留固体残渣，待晾干后粉碎并过20目筛。

(2)酶解反应的总体积为200ml，在1000ml的三角瓶中进行，葡聚糖负荷为4％，加入纤维素降解混合酶液，纤维素酶按20fpu/g葡聚糖的负荷添加，然后180rpm，50℃摇床降解。其中葡聚糖负荷定义为葡聚糖的质量在总的固液混合物体积中的百分比(认为小麦秸秆的密度大约为1g/ml)。

(3)酶解液经离心，过滤，除去固体残渣后进行脱毒。先用饱和ca(oh)2调节ph至10.0，30℃，静置10h，然后加入6.0mol/lh2so4调节ph至5.0，加入质量分数5％的活性炭，100rpm，40℃，振荡3h。然后过滤进行高温灭菌得到水解液。最后配制发酵培养基，测定酶解液的葡萄糖浓度，然后稀释到相应的浓度，添加除碳源外的其他营养物质。发酵液培养基成分(g/l)：葡萄糖15-25，蛋白胨6-10，酵母粉4.5-7.5，na2hpo36-10。ph为6.0。

(4)先活化木葡糖酸醋杆菌，然后按照体积比3％的接种量把种子液接种到发酵液中，然后放入30℃的恒温培养箱中培养7d，发酵液表面形成细菌纤维素膜。

(5)取出纤维素膜用去离子水清洗干净，然后用0.1mnaoh溶液浸泡至纤维素膜呈白色，要多次更换naoh溶液，最后用去离子水浸泡至浸泡液ph为中性。

优选的，本发明选择小麦秸秆作为木质纤维素原材料，是因为其简单易得，经过合适预处理后的小麦秸秆纤维素含量高，本发明保护范围不仅仅局限于此种植物。

优选的，本发明选择酶降解木质纤维素，是因为其简单易行，降解效率高。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供了一种以木质纤维素降解液作碳源制备细菌纤维素的方法，木质纤维素材料来源丰富，价格低廉，有大规模实际应用的前景。

(2)木质纤维素的有效利用既解决了环境压力，又创造了经济价值。

(3)生成的细菌纤维素，基于其高纯度，高持水性，透气性，高抗张强度和弹性，良好的生物亲和性，生物相容性，可广泛应用于造纸，食品，医药，纺织，航空航天等领域。

附图说明

图1是小麦秸秆水解液产生的细菌纤维素的sem图

图2是葡萄糖培养基产生的细菌纤维素的sem图

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚，完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种以木质纤维素降解液作碳源制备细菌纤维素的方法，包括以下步骤：

(1)木质纤维素碱处理：将剪成小段的小麦秸秆与0.5mnaoh溶液按料液比1∶20混合，于高压蒸汽灭菌锅中121℃预处理1小时，预处理后的样品经过纱布过滤，并用大量的去离子水洗涤至洗液呈中性。弃去上清液，保留固体残渣，待晾干后粉碎并过20目筛。

(2)酶解：反应的总体积为200ml，在1000ml的三角瓶中进行，葡聚糖负荷为4％，加入纤维素降解混合酶液，纤维素酶按20fpu/g葡聚糖的负荷添加，然后180rpm，50℃摇床降解。

(3)酶解液经离心，过滤，除去固体残渣后进行脱毒。先用饱和ca(oh)2调节ph至10.0，30℃，静置10h，然后加入6.0mol/lh2so4调节ph至5.0，加入质量分数5％的活性炭，100rpm，40℃，振荡3h。然后过滤进行高温灭菌得到水解液。最后配制发酵培养基，测定酶解液的葡萄糖浓度，然后稀释到相应的浓度，添加除碳源外的其他营养物质。发酵液培养基成分(g/l)：葡萄糖15-25，蛋白胨6-10，酵母粉4.5-7.5，na2hpo36-10。ph为6.0。

(4)先活化木葡糖酸醋杆菌，然后按照体积比3％的接种量把种子液接种到发酵液中，然后放入30℃的恒温培养箱中培养7d，发酵液表面形成细菌纤维素膜。

(5)取出纤维素膜用去离子水清洗干净，然后用0.1mnaoh溶液浸泡至纤维素膜变白，要多次更换naoh溶液，最后用去离子水浸泡至浸泡液ph为中性。

实施例1

(1)木质纤维素酶解之后，经过hplc分析，葡萄糖浓度为30g/l。

(2)将降解液的葡萄糖浓度稀释到25g/l，添加其他营养物质，添加比例为：蛋白胨10g/l，酵母粉7.5g/l，na2hpo310g/l，ph调节至6.0。在121℃下高压蒸汽灭菌20min。

(3)把甘油管中保藏的木醋杆菌(gluconacetobacterxylinus)cgmcc2955接种到固体平板培养基上，放入30℃恒温培养箱中，培养2d后，得到活化菌。称取葡萄糖5.0g，蛋白胨2.0g，酵母粉1.5g，na2hpo32.0g，ph为6.0，配制成200ml种子液培养基。将活化好的菌种接到种子液培养基溶液中30℃，180rpm振荡培养20h，得到种子液。

(4)吸取6ml种子液接种到发酵培养基中，然后放入30℃的恒温培养箱中培养7d，发酵得到细菌纤维素膜。

(5)取出纤维素膜用去离子水清洗干净，然后用0.1mnaoh溶液浸泡脱色，要多次更换naoh溶液，最后用去离子水浸泡至浸泡液ph为中性。

实施例2

(1)木质纤维素酶解之后，经过hplc分析，葡萄糖浓度为30g/l。

(2)将降解液的葡萄糖浓度稀释到20g/l，添加其他营养物质，添加比例为：蛋白胨8g/l，酵母粉6g/l，na2hpo38g/l，ph调节至6.0。在121℃下高压蒸汽灭菌20min。

(3)把甘油管中保藏的木醋杆菌(gluconacetobacterxylinus)cgmcc2955接种到固体平板培养基上，放入30℃恒温培养箱中，培养2d后，得到活化菌。称取葡萄糖5.0g，蛋白胨2.0g，酵母粉1.5g，na2hpo32.0g，ph为6.0，配制成200ml种子液培养基。将活化好的菌种接到种子液培养基溶液中30℃，180rpm振荡培养20h，得到种子液。

(4)吸取6ml种子液接种到发酵培养基中，然后放入30℃的恒温培养箱中培养7d，发酵得到细菌纤维素膜。

(5)取出纤维素膜用去离子水清洗干净，然后用0.1mnaoh溶液浸泡脱色，要多次更换naoh溶液，最后用去离子水浸泡至浸泡液ph为中性。

实施例3

(1)木质纤维素酶解之后，经过hplc分析，葡萄糖浓度为30g/l。

(2)将降解液的葡萄糖浓度稀释到15g/l，添加其他营养物质，添加比例为：蛋白胨6g/l，酵母粉7.5g/l，na2hpo36g/l，ph调节至6.0。在121℃下高压蒸汽灭菌20min。

(3)把甘油管中保藏的木醋杆菌(gluconacetobacterxylinus)cgmcc2955接种到固体平板培养基上，放入30℃恒温培养箱中，培养2d后，得到活化菌。称取葡萄糖5.0g，蛋白胨2.0g，酵母粉1.5g，na2hpo32.0g，ph为6.0，配制成200ml种子液培养基。将活化好的菌种接到种子液培养基溶液中30℃，180rpm振荡培养20h，得到种子液。

(4)吸取6ml种子液接种到发酵培养基中，然后放入30℃的恒温培养箱中培养7d，发酵得到细菌纤维素膜。

(5)取出纤维素膜用去离子水清洗干净，然后用0.1mnaoh溶液浸泡脱色，要多次更换naoh溶液，最后用去离子水浸泡至浸泡液ph为中性。