一株鞘氨醇杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株鞘氨醇杆菌及其在控制蓝藻水华中的应用。从太湖水体中分离获得了一株具有显著溶藻活性的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium?sp.)Lzh-3，保藏号为CGMCC?No.8281，并且从其发酵产物中分离纯化并鉴定出其有效溶藻成分六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和3-异丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮，其中六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和3-异丁基-6-甲基哌嗪-2,5-二酮对铜绿微囊藻9110的半致死量LD50分别为5.7μg/mL和8.2μg/mL。可用于新型生物杀藻剂的研发和生产，最终应用于湖泊蓝藻水华的控制。
【专利说明】一株鞘氨醇杆菌及其在蓝藻水华控制中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及环境微生物领域，特别涉及一株分泌溶藻物质的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.) Lzh-3及其在蓝藻水华控制中的应用。
【背景技术】
[0002]近些年来由于水体富营养化，太湖爆发了严重的蓝藻水华，造成的环境和经济问题日益突出，因此探索控制蓝藻水华发生的有效途径是非常必要的。
[0003]目前控制蓝藻水华的方法可分为物理方法、化学方法和生物方法。但物理方法耗费大量人力物力，化学方法易造成二次污染，生物方法因其高效、专一、环境友好等优点而得到越来越多的关注。之前的报道显示溶藻菌导致了蓝藻水华的消退，因此溶藻菌在控制蓝藻水华方面具有很大的应用潜力。
[0004]因此，本领域的技术人员致力于筛选高效溶藻细菌或分离富集溶藻细菌代谢产生的高效溶藻活性物质，以开发微生物杀藻剂，用以安全和高效的控制蓝藻水华问题。
【发明内容】
[0005]鉴于现有控制蓝藻水华技术中物理方法耗费大量人力物力、处理能力有限和化学方法容易造成二次污染的缺陷，本发明所要解决的技术问题是寻找高效溶藻细菌及分离富集溶藻细菌代谢产生的高效溶藻活性物质，用以安全和高效的控制蓝藻水华问题。
[0006]为实现上述目的，本发明提供了一株具有溶藻活性的鞘氨醇杆菌及其发酵产物在蓝藻水华控制中的应用。
[0007]为实现上述目的，本发明提供的技术方案是:提供一株从太湖水体中分离获得的具有溶藻活性的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.) Lzh_3,该菌株属革兰氏染色阴性菌，细胞呈直杆状，0.6~0.8 μ mX 0.6~4 μ m ;无鞭毛，少有滑行运动；过氧化氢酶阳性，化能异养，无特殊营养需求；室温下放置数日后菌落通常呈淡黄色；不产生吲哚，不水解蛋白，不液化明胶，氧化糖醇类产酸。经16srRNA基因序列分析和同源性比较,得知其与GenBank中某鞘氨醇杆菌菌株有99%的同源性，故鉴定为鞘氨醇杆菌属细菌，命名为鞘氨醇杆菌Lzh-3ο
[0008]该菌株已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC N0.8281，保藏日期为2013年9月27日。保藏机构地址:北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，邮编:100101，电话:86-10-64807355。该菌种的16S rRNA基因在GenBank中的登录号是HQ896843。
[0009]进一步地，本发明提供了上述鞘氨醇杆菌Lzh-3在控制蓝藻水华中的应用。
[0010]进一步地，本发明鞘氨醇杆菌Lzh-3在控制蓝藻水华中的应用方式可以是通过其发酵产物，包括发酵液、发酵液浓缩物、发酵液粗提物或发酵液提取物。
[0011]鞘 氨醇杆菌Lzh-3发酵产物的制备步骤如下:
[0012]I)、发酵鞘氨醇杆菌Lzh-3菌株，获得发酵液；[0013]2)、用萃取剂萃取发酵液，获得萃取液；
[0014]3)、将萃取液蒸干，获得粗提物；
[0015]4)、将粗提物溶于水后过滤；
[0016]5)、将步骤4)过滤后的滤液进一步提纯得到多组分或单一组分的有效溶藻物质，即为发酵液提取物。
[0017]优选地，步骤I)中，发酵条件为，鞘氨醇杆菌Lzh-3接种于PH7.0的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基中，28°C、200rpm环境条件下发酵48h。
[0018]优选地，步骤2)中，萃取剂为乙酸乙酯，萃取体系中乙酸乙酯与发酵液的体积比为1:1，混合后，放入振荡器中振荡24h，分离出的上层乙酸乙酯溶液即鞘氨醇杆菌Lzh-3发酵液的萃取液。
[0019]优选地,步骤3)中，过滤为使用0.22 μ m孔径滤膜过滤。
[0020]优选地，步骤4)中，进一步提纯手段为组层析，具体为:将滤液通过半制备柱，用HPLC进行初步纯化，得到溶藻成分；将得到的溶藻成分通过分析柱，用HPLC进行进一步纯化，得到两种有效溶藻成分S-3A和S-3B。
[0021]鞘氨醇杆菌Lzh-3的发酵产物中有效的溶藻成分S-3A和S_3B的化学结构通过LC-MS、GC-MG和NMR分析获得。
[0022]有效溶藻成分S-3A的分子尚子峰为155.0820m/z,样品分子量为154.0742,分子式为C7HltlN2O2，GC-MS分析结果显示S-3A与GC-MS数据库中六氢吡咯并[I，2_a]吡嗪-1，4- 二酮的结构相似，核磁共振氢谱结果是1H NMR (400MHz, D2O) 54.31 (dd, J =
11.5，4.7Hz, 1H)，4.15 (dd, J = 17.3，2.6Hz, 1H)，3.86 (d, J = 17.3Hz, 1H)，3.53 (dd, J =
8.7，4.8Hz, 2H), 2.31 (dd, J = 8.5, 3.2Hz, 1H)，2.05 (dd, J = 7.3, 3.2Hz, 1H)，1.94 (ddd, J =16.6，6.6，4.6Hz, 2H)。
[0023]有效溶藻成分S-3B的分子离子峰为185.1288m/z，样品分子量为184.1212，分子式为C9H16N2O2, GC-MS分析结果显示S-3B与已知文献中3-异丁基-6-甲基哌嗪-2，5- 二酮的结构相似，核磁共振氢谱结果是1H NMR (400MHz, D2O) δ 4.16 (d, J =
7.2Hz, 2H)，1.74 (s, 3H)，1.49 (d, J = 7.1Hz, 3H)，0.95 (s, 6H)。
[0024]由此可以确定，上述鞘氨醇杆菌Lzh-3的发酵提取物中两种具有溶藻活性的有效成分分别为具有结构式⑴的六氢吡咯并[l，2-a]吡嗪-1，4-二酮和具有结构式(II)的3-异丁基-6-甲基哌嗪-2，5- 二酮。
[0025]
【权利要求】
1.一株具有溶藻活性的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.) Lzh_3,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC N0.8281，保藏日期为2013年9月27曰。
2.如权利要求1所述的鞘氨醇杆菌Lzh-3在控制蓝藻水华中的应用。
3.如权利要求1所述的鞘氨醇杆菌Lzh-3的发酵产物在控制蓝藻水华中的应用。
4.一种具有结构式(II)所示结构的化合物在控制蓝藻水华中的应用。
5.一种溶藻菌剂，其特征在于，所述溶藻菌剂中包含权利要求1所述的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)Lzh_3。
6.一种溶藻药剂，其特征在于，所述溶藻药剂中包含权利要求1所述的鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)Lzh-3的发酵产物,所述发酵产物为发酵液、发酵液浓缩物、发酵液粗提物或发酵液提取物。
7.一种制备鞘氨醇杆菌Lzh-3发酵产物的方法，包括如下步骤: 1)、发酵权利要求1所述的鞘氨醇杆菌Lzh-3，获得发酵液； 2)、用萃取剂萃取发酵液，获得萃取液； 3)、将萃取液蒸干，获得粗提物； 4)、将粗提物溶于水后过滤； 5)、将步骤4)过滤后的滤液进一步提纯得到多组分或单一组分的有效溶藻物质，即为发酵液提取物。
8.如权利要求7所述的方法，其中步骤I)中，发酵条件为，鞘氨醇杆菌Lzh-3接种于PH7.0的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基中，28°C、200rpm环境条件下发酵48h。
9.如权利要求7所述的方法，其中步骤2)中，萃取剂为乙酸乙酯，乙酸乙酯与发酵液的体积比为1:1。
10.如权利要求7所述的方法，其中步骤4)中，所述进一步提纯手段为:将滤液通过半制备柱，用HPLC进行初步纯化，得到溶藻成分；将得到的溶藻成分通过分析柱，用HPLC进行进一步纯化，得到单一组分的有效溶藻成分。
【文档编号】C12R1/01GK103992970SQ201410190528
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月7日 优先权日:2014年5月7日
【发明者】杨虹, 李正华, 林升钦 申请人:上海交通大学