一种灵芝诱变株液态发酵米糠麸皮全料生产多糖的方法
【专利摘要】一种灵芝多糖的生产方法，涉及食品微生物应用【技术领域】。按照下述步骤进行：称取原料，米糠为1-5g/100mL，麸皮为1-4.5g/100mL，磷酸二氢钾0.1-0.5g/100mL，硫酸镁0.1-0.5g/100mL；加所需的水后，装料，pH自然，121℃灭菌兼蒸煮30min；冷却后接入同时发明得到的灵芝CCTCC?M2013287液体种子，接种量8-10％，发酵温度25-30℃，发酵时间4-7d；发酵物离心分离液或菌丝经破壁热水浸提后的离心分离液，经脱蛋白、醇沉、离心分离、真空干燥后分别得到胞外多糖和菌丝多糖。该方法更好地实现了米糠麸皮经液态发酵高效高值化转化为灵芝多糖的目的。
【专利说明】一种灵芝诱变株液态发酵米糠麸皮全料生产多糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及食品微生物应用【技术领域】，尤其涉及一种利用灵芝诱变新菌株液态发酵米糠麸皮全料培养基中高产灵芝多糖的方法。
【背景技术】
[0002]自从 Chihara 等人(参考文献:Chihara G, MaedaY, Hamuro J, et al.1nhibitionof mouse sarcomal80by polysaccharides from Lentinus edodes(Berk.) sing[J].Nature, 1969，222 (5194):687-688.)于1969年在《Nature》上发表论文，揭示香菇多糖具有抗肿瘤活性以来，已经发现具有抗肿瘤活性的药用真菌达两百多种，其中一部分还是食用真菌，如灰树花、猴头菌、灵芝等。这些食用菌的菌丝体、子实体、菌核或孢子中能产生诸如氨基酸、蛋白质、维生素、多糖、苷类、黄酮类及抗生素等多种活性成分或富集微量元素硒、锌等，具有提高人体免疫力、抗肿瘤、增强肝功能、抗氧化等多种功效。国内市场已有食用菌保健食品如灵芝胶囊、灰树花胶囊及冬虫夏草胶囊等在热销。国际上新西兰、日本、美国等均产有类似的产品。新西兰的“GanoPoly”系列产品由灵芝、云芝等提取的多糖复合壳聚糖而成，主要用于提高免疫力、辅助抗肿瘤治疗等方面。就灵芝多糖而言，针对其的研究表明:灵芝多糖具有良好的提闻免疫力、辅助抗肿瘤治疗等疗效，例如Huang、Seto等从灵芝菌体中提取灵芝多糖的药效试验表明，灵芝多糖具有免疫调节作用和抗肿瘤作用(参考文献见①Huang S.Q.,Ning Z.X.Extraction of polysaccharide from Ganoderma lucidum andits immune enhancement activity[J].1nt J Biol Macromol，2010，47 (3):336 ~341 ;
②Seto S.ff., Lam T.Y, Tam H.L., et al.Novel hypoglycemic effects of Ganodermalueidum water-extract in obese/diabetic(db/+db)mice[J].Phytomedicine,2009,
(16):426 ~436 ;③ Hikino H, Konno C, Mirin Y, et al.1solation and hypoglycemicactivity of ganoderans A and B, glycans of Ganoderma lucidum fruit bodies[J].Planta Med，1985， (12):339 ~340)
[0003]灵芝(Ganoderma Iuccidum)别名芝草、瑞草,是真菌门,担子菌亚门,层菌纲,非裙菌目，灵芝菌科，灵芝属真菌，主要分布于亚洲、澳洲、非洲和美洲的热带及亚热带地区，少数也分布于温带地区，地处北半球温带的欧洲仅有灵芝属的4种，而北美洲大约5种。中国地跨热带至寒温带，灵芝科种类多而分布广，是世界灵芝属真菌物种多样性最丰富的国家之一。传统上，灵芝的获取方式主要是人工栽培或野外采集，以子实体或孢子粉入药。但人工栽培灵芝周期长、生产效率低、劳动强度大，又受季节、环境等限制，易遭病虫害，质量与产量不稳定，而野外采集灵芝数量有限，难以满足大生产要求。食用菌液体深层发酵技术，比传统的子实体栽培法具有明显的优势。为高效生产灵芝多糖，研究人员十分重视对促进工业化生产的液体培养方法的研究，获得了许多研究成果。組晓艳、曾晓希等对灵芝液态培养的条件进行了研究，此类研究的主要内容涉及生产菌种、培养基成分和发酵工艺参数，将降低生产成本以及提高多糖产量作为研究重点。其中多数工艺采用如淀粉、马铃薯、葡萄糖等作为培养基成分，即便利用到农产品加工副产品如米糠或者麸皮，也是将其作为次要成分，仍是以粮食类原料、葡萄糖、或其他原料为主要碳源和氮源。
[0004]中国是农业大国，农副产品来源丰富。米糠、麸皮作为稻谷和小麦加工的副产物，不但其营养成分丰富，而且价格低廉。米糠中富含淀粉、纤维素等物质，而麸皮富含蛋白、纤维素等物质。从理论上讲，米糠和麸皮复合已经具备了灵芝生长所需要的碳源和氮源物质。在灵芝自身纤维素酶及其他酶的作用下，灵芝可将米糠和麸皮转化成自身的营养物质进行生长，生产灵芝多糖。因此，运用米糠、麸皮等廉价农副产品，完全替代葡萄糖等灵芝液体发酵所需的营养物质，生产具有辅助肿瘤治疗的灵芝糖，对低端原料的高值化应用具有重要意义，具有极高的经济价值。
[0005]根据本专利发明人刘伟民课题组多年的研究经验，一些食用菌菌株在不添加葡萄糖或者其他粮食类原料的米糠或麸皮液态培养基上生长状况并不太理想，需要作特殊处理如菌种诱变以获得良好的生长。例如，刘伟民指导多名硕士研究生对食用菌灰树花液态发酵米糠或麸皮进行过深入的研究，获得了一些成果，形成如下文献:(I)杨锁华.灰树花发酵米糠制备多糖[D].硕士学位论文.镇江:江苏大学.2006 ； (2)顾慧敏.灰树花在米糠培养基中液态培养产多糖和富集有机硒的研究[D].硕士学位论文.镇江:江苏大学.2009 ；
(3)张建.物理法诱变灰树花液体发酵米糠麸皮产多糖的研究[D].硕士学位论文.镇江:江苏大学，2010 ; (4)郭春梅.灰树花的菌种诱变、液体发酵米糠麸皮产多糖及富硒研究[D].硕士学位论文.镇江:江苏大学，2011 ; (5)李永转.转化米糠和麸皮高产多糖的灰树花菌株诱变和已有菌的发酵试验[D].硕士学位论文.镇江:江苏大学，2012 ; (6)刘伟民，张建，郭春梅，等.用于米糠和麸皮复合原料生产多糖的灰树花菌株[P] ,10579078.5，2010 ； (7)刘伟民，张建，郭春梅，等.使用米糠麸皮复合原料和灰树花诱变菌株生产多糖的方法[P] ,1010579048.4，2010 ; (7)刘伟民，郭春梅，张建，等.用于发酵米糠和麸皮提取液生产灰树花多糖的菌株[P], 10150888.3,2011(申请)；(8)李亚楠.灰树花菌种诱变及发酵和产物性能研究[D].硕士学位论文.镇江:江苏大学，2013 (该论文
【公开日】期为2013年6月，与本专利的申请提交年月相同)；(9)赵莉.灰树花在米糠麸皮复合培养基中液态发酵富集锰的研究[D].硕士学位`论文.镇江:江苏大学，2012 ; (10)刘丽丽.高值转化米糠麸皮的灵芝液体发酵及菌种诱变[D].硕士学位论文.镇江:江苏大学，2012 ;(11)郭天龙.灵芝菌种诱变及液态发酵高值化转化全米糠麸皮研究[D].硕士学位论文.镇江:江苏大学，2013 (该论文
【公开日】期为2013年6月，与本专利的申请提交年月相同)。
[0006]由上述参考文献可知，本专利发明人刘伟民一直围绕米糠麸皮高效高值化转化为珍稀食用菌多糖这一专题进行研究，实现多个发明创造设想，并提出了用灵芝进行米糠麸皮全料液体发酵，高效高值化转化米糠麸皮为灵芝多糖的研究思路，对原始菌株加以诱变处理,在刘丽丽诱变试验不成功(为负诱变,见刘丽丽硕士论文p46对表5.2的分析，刘丽丽的硕士论文全部采用米糠麸皮过滤取汁作培养基，不是本发明的米糠麸皮全料液态培养基)的基础上，总结经验，指导郭天龙进行系统的研究，得到了正诱变菌株，并新提出了诱变菌株液态发酵米糠麸皮全料，高效高值化转化米糠麸皮为灵芝多糖的方法，形成了本发明专利和同时申报的另一个发明专利的内容。郭天龙的硕士论文
【公开日】期为2013年6月，与本专利的申请提交年月相同，不影响本发明的新颖性。
[0007]本发明的关键问题之一为:在得到一种灵芝新菌株的基础上，本发明将给出此新菌株在米糠麸皮全料液态培养基上有效生长并高效转化米糠麸皮全料为灵芝多糖的方法。新菌株的建立及新菌株对米糠麸皮的新利用方式都需要创新，适合于新灵芝菌株的米糠和麸皮组成液体培养基的配比及液态发酵的工艺条件均需新研究得出，还未见报道，因此本发明具有独特、创新和实用性，具备发明专利的基本特征。
[0008]特别说明:本发明所述的米糠麸皮全料液态培养基特指将米糠和麸皮作为培养基中唯一的碳源、氮源，不添加其他碳源、氮源，并且米糠、麸皮加水呈液态状，不过滤，即全料加以利用。
[0009]与本发明同时提交的另一个发明专利给出了通过紫外微波并行诱变的方法，以高产灵芝多糖为指标，定向高效转化米糠麸皮全料液态培养基为基础，选育得到高产的灵芝新菌株灵芝 CCTCC M2013287 (Ganoderma lucidum CCTCC M 2013287)。本发明利用与本发明同时提交的另一个发明专利所得到的新的灵芝CCTCC M2013287，在米糠麸皮全料液态培养基中进行液体发酵，生产灵芝多糖，由此得到一种新的灵芝多糖生产方法。诱变菌株灵芝CCTCC M2013287是新菌株，产糖特性发生变化，产量更高。将此新菌株用于米糠麸皮全料液态培养基，形成新的米糠麸皮利用方法，实现高产灵芝多糖的目标，未见有文献报道本发明的灵芝多糖生产方法和水平。所以，本发明在采用新诱变菌株、实现米糠麸皮全料液态发酵高效高值化转化利用、给出新的灵芝多糖制造方法(新菌株加不同的米糠麸皮全料液态培养基组成和发酵工艺)、米糠麸皮作为培养基的液态发酵所得灵芝多糖(培养基不同，灵芝代谢产物灵芝多糖分子组 成可不同)产量高等方面具有独特性、创新性和实用性，奠定了本发明专利的基础。
【发明内容】
[0010]本发明为了降低生产成本，高效高值化转化米糠和麸皮，高产具有增强免疫力、辅助肿瘤等功效的灵芝多糖，通过紫外微波并行诱变筛选出适合发酵米糠麸皮全料液态培养基的高产灵芝新菌种，利用此新菌种实现高效高值化发酵转化米糠麸皮全料液态培养基高产灵芝多糖的方法。
[0011]本发明所采取的技术方案如下，在米糠麸皮全料液态培养基上，用诱变所得的灵芝菌株发酵生产灵芝多糖的方法按照下述步骤进行:(I)将米糠和麸皮加水121°c灭菌兼蒸煮30min ;(2)将米糠和麸皮全料作为碳源、氮源直接用于灵芝CCTCC M2013287发酵培养基，米糠使用量为l_5g/100mL，麸皮的使用量为1-4.5g/100mL，添加磷酸二氢钾0.1-0.5g/100mL，硫酸镁0.1-0.5g/100mL, pH自然，摇瓶装料量40 %，发酵罐装料量70-80 %，接种量8-10 %，培养温度25-30 V，摇床转速150_180r/min或发酵搅拌浆转速50-70r/min,发酵时间4_7d ； (3)将液体培养所得的含少量的米糠麸皮的菌丝体经离心分离后，用水洗涤，菌丝体破壁后用70°C热水浸提3h，过滤取清液；(4)发酵物离心分离液或菌丝经热水浸提后的离心分离液，经脱蛋白、醇沉、离心分离、真空干燥后分别得到胞外多糖和菌丝多糖，采用苯酚硫酸法测定菌丝多糖和胞外多糖中的多糖含量。
[0012]本发明步骤(2)中使用的灵芝菌株灵芝JSU6161314已经于2013年6月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，菌株保藏编号为编号为CCTCC M 2013287，名称为灵芝 CCTCC M2013287(拉丁名称:Ganoderma lucidum CCTCC M2013287)，该菌株的发明专利申请与本发明专利申请提交日期相同。
[0013]本发明步骤(2)中摇瓶时的装料量为摇瓶容积的40%，接种量为装料体积的10%，转速 150-180r/min，培养时间为 4_7d。
[0014]本发明步骤(2)中上罐发酵时装样量为发酵罐容积的80%，上罐时通风量为装罐液体体积/min，培养温度25-30°C，搅拌速率50_70r/min，上罐发酵4_7d。
[0015]本发明的有益效果
[0016]发明人由现有的灵芝CFCC6043出发，进行紫外和微波并行诱变，以生长速率、菌丝干重和胞外多糖为指标进行筛选，最终获得灵芝CCTCC M2013287,在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮全料液态培养基中生产灵芝产多糖，与原始菌株灵芝CFCC6043相比产量更高，由微波诱变菌株所得菌株灵芝CCTCC M2013287上罐发酵时菌丝干重和菌丝多糖产率产量为6.3g/100mL培养基和0.203mg/100mL培养基，出发菌株灵芝CFCC6043菌丝干重和菌丝多糖产量为5.12g/100mL培养基和0.14mg/100mL培养基，诱变菌株灵芝CCTCC M2013287发酵的菌丝干重和菌丝多糖产率比出发菌株灵芝CFCC6043的菌丝干重和菌丝多糖产量分别增加了 23.0%和45%。所得菌株的发酵能力强，灵芝多糖产量增加显著，具有显著的独特性和创造性特征，推动了该领域的技术进步，获得了有益的技术效果。
[0017]发明人用所述的新菌株灵芝CCTCC M2013287液态发酵米糠麸皮全料培养基，高效高值化转化米糠麸皮为灵芝多糖，并获得高产的灵芝多糖。将低值的米糠麸皮转化成高值的具有多种保健功能的灵芝多糖，对降低生产成本、低端资源高效合理高值化利用、保护大众健康，都具有有益的社会效果。
[0018]本发明之前的灵 芝液态发酵生产多糖多采用粮食类原料，米糠和麸皮作为辅料使用，用量少，过滤取汁使用方式使得米糠麸皮的使用效率低。本发明则将米糠麸皮全料加以应用，并作为培养基的惟一碳源和氮源，获得较高的灵芝多糖产量，说明本发明所提供的利用所述的新菌株进行米糠麸皮全料液态发酵生产灵芝多糖的方法先进，经济效益高，获得有益的经济效果。
[0019]综上所述，本发明已经具备了发明专利的独特性、创造性和实用性，产生了发明专利应该具备的技术、经济和社会的有益效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为本发明所采用的菌株灵芝CCTCC M2013287紫外微波并行诱变选育流程图。【具体实施方式】
[0021]本发明提供灵芝CCTCC M2013287(已经同时另行申请专利)，可以在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮全料液态培养基上相对于原有的灵芝菌株具有高生长速率和高多糖产量；该灵芝菌株灵芝CCTCC M2013287已经于2013年6月25日保藏在中国武汉的武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏菌株编号为CCTCC M2013287，名称为灵芝CCTCC M2013287(拉丁名称为 Ganoderma lucidum CCTCC M2013287)。本发明提供了采用诱变得到的菌株在Ganoderma lucidum CCTCC M2013287米糠麸皮全料液态培养基上生产灵芝多糖的生产方法。
[0022]在【具体实施方式】中，将米糠和麸皮加水121°C灭菌兼蒸煮30min，作为培养基用于发酵。所述菌丝为菌丝混合少量原料的菌丝。
[0023]实施例一[0024]灵芝菌株采用诱变菌株灵芝CCTCC M2013287。发酵罐装样量为发酵罐容积的80%，培养温度为28°C，通风量1:0.8v/v/mim，搅拌速度60r/min，罐表压0.05MPa，接种量8%，培养时间5d，发酵培养基为米糠5g/100mL，麸皮3g/100mL，磷酸二氢钾0.15g/100mL,硫酸镁0.lg/100mL, pH自然。加水至所需的体积，121°C灭菌兼蒸煮30min，作为培养基用于发酵，将液体培养所得的含少量的米糠麸皮的菌丝体经离心分离后，用水洗涤，菌丝体破壁后用70°C热水浸提3h，过滤取清液。发酵物离心分离液或菌丝经热水浸提后的离心分离液，经脱蛋白、醇沉、离心分离、真空干燥后分别得到胞外多糖和菌丝多糖，采用苯酚硫酸法测定菌丝多糖和胞外多糖中的多糖含量。结果为菌丝干重6.3g/100mL,胞外多糖为436.0mg/1OOmL培养液，胞内多糖为203.0mg/1OOmL培养液。
[0025]实施例二
[0026]灵芝菌株采用诱变得到的灵芝CCTCC M2013287菌株。米糠使用量为2.0g/100mL培养基，麸皮的使用量为 2.5g/100mL 培养基，添加 KH2PO40.25g/100mL, MgSO40.35g/100mL,pH自然，加水至所需的体积，121°C灭菌兼蒸煮30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40%，接种量为10%，培养温度251:，转速150r/min，培养时间7d。将液体培养所得的含少量的米糠麸皮的菌丝体经离心分离后，用水洗涤，菌丝体破壁后用70°C热水浸提3h，过滤取清液。发酵物离心分离液或菌丝经热水浸提后的离心分离液，经脱蛋白、醇沉、离心分离、真空干燥后分别得到胞外多糖和菌丝多糖，采用苯酚硫酸法测定菌丝多糖和胞外多糖中的多糖含量。结果为菌丝干重3.51g/100mL，胞外多糖为263.3mg/100mL培养液，胞内多糖为92.7mg/100mL 培养液。
[0027]实施例三
[0028]灵芝菌株采用诱变得到的灵芝CCTCC M2013287菌株。米糠使用量为2.5g/100mL培养基，麸皮的使用量为 3.5g/100mL 培养基，添加 KH2PO40.5g/100mL, MgSO40.15g/100mL,pH自然，加水至所需的体积，121°C灭菌兼蒸煮30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40%,接种量为10%，培养温度28°C，转速150r/min，培养时间4d。将液体培养所得的含少量的米糠麸皮的菌丝体经离心分离后，用水洗涤，菌丝体破壁后用70°C热水浸提3h，过滤取清液。发酵物离心分离液或菌丝经热水浸提后的离心分离液，经脱蛋白、醇沉、离心分离、真空干燥后分别得到胞外多糖和菌丝多糖，采用苯酚硫酸法测定菌丝多糖和胞外多糖中的多糖含量。结果为菌丝干重4.92g/100mL，胞外多糖为357.6mg/100mL培养液，胞内多糖为138.3mg/100mL 培养液。
[0029]实施例四
[0030]灵芝菌株采用诱变得到的灵芝CCTCC M2013287菌株。米糠使用量为3.0g/100mL培养基，麸皮的使用量为 4.5g/100mL 培养基，添加 KH2PO40.20g/100mL, MgSO40.5g/100mL,pH自然，加水至所需的体积，121°C灭菌兼蒸煮30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40%，接种量为10%，培养温度261:，转速150r/min，培养时间5d。将液体培养所得的含少量的米糠麸皮的菌丝体经离心分离后，用水洗涤，菌丝体破壁后用70°C热水浸提3h，过滤取清液。发酵物离心分离液或菌丝经热水浸提后的离心分离液，经脱蛋白、醇沉、离心分离、真空干燥后分别得到胞外多糖和菌丝多糖，采用苯酚硫酸法测定菌丝多糖和胞外多糖中的多糖含量。结果为菌丝干重5.91g/100mL，胞外多糖为428.7mg/100mL培养液，胞内多糖为173.2mg/100mL 培养液。[0031]实施例五
[0032]灵芝菌株采用诱变得到的灵芝CCTCC M2013287菌株。米糠使用量为4.5g/100mL培养基，麸皮的使用量为 2.0g/100mL 培养基，添加 KH2PO40.40g/100mL, MgSO40.45g/100mL,pH自然，加水至所需的体积，121°C灭菌兼蒸煮30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40%,接种量为10%，培养温度280°C，转速150r/min，培养时间7d。将液体培养所得的含少量的米糠麸皮的菌丝体经离心分离后，用水洗涤，菌丝体破壁后用70°C热水浸提3h，过滤取清液。发酵物离心分离液或菌丝经热水浸提后的离心分离液，经脱蛋白、醇沉、离心分离、真空干燥后分别得到胞外多糖和菌丝多糖，采用苯酚硫酸法测定菌丝多糖和胞外多糖中的多糖含量。结果为菌丝干重4.92g/100mL，胞外多糖为324.3mg/100mL培养液，胞内多糖为149.7mg/1OOmL 培养液。
[0033]实施例六
[0034]灵芝菌株采用诱变得到的灵芝CCTCC M2013287菌株。米糠使用量为5.0g/100mL培养基，麸皮的使用量为 3.0g/100mL 培养基，添加 KH2PO40.10g/100mL, MgSO40.25g/100mL,pH自然，加水至所需的体积，121°C灭菌兼蒸煮30min，作为培养基用于发酵，摇瓶装样量为40%,接种量为10%，培养温度30°C，转速180r/min，培养时间6d。将液体培养所得的含少量的米糠麸皮的菌丝体经离心分离后，用水洗涤，菌丝体破壁后用70°C热水浸提3h，过滤取清液。发酵物离心分离液或菌丝经热水浸提后的离心分离液，经脱蛋白、醇沉、离心分离、真空干燥后分别得到胞外多糖和菌丝多糖，采用苯酚硫酸法测定菌丝多糖和胞外多糖中的多糖含量。结果为菌丝干重6.0g/100mL,胞外多糖为416.6mg/100mL培养液，胞内多糖为179.5mg/100mL 培养液。
[0035]实施例七
[0036]灵芝菌株采用诱变菌株灵芝CCTCC M2013287。发酵罐装样量为发酵罐容积的80%，培养温度为28°C，通风量1:0.8v/v/mim，搅拌速度60r/min，罐表压0.05MPa，接种量8%，培养时间5d，发酵培养基为米糠20g/L，麸皮25g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，硫酸镁3.5g/L, pH自然。将液体培养所得的含少量的米糠麸皮的菌丝体经离心分离后，用水洗涤，菌丝体破壁后用70°C热水浸提3h，过滤取清液。发酵物离心分离液或菌丝经热水浸提后的离心分离液，经脱蛋白、醇沉、离心分离、真空干燥后分别得到胞外多糖和菌丝多糖，采用苯酚硫酸法测定菌丝多糖和胞外多糖中的多糖含量。结果为菌丝干重3.34g/100mL，胞外多糖为241.3mg/100mL培养液，胞内多糖为123.8mg/100mL培养液。
[0037]实施例八
[0038]灵芝菌株采用诱变菌株灵芝CCTCC M2013287。发酵罐装样量为发酵罐容积的70 %，培养温度为28 V，通风量1:0.8v/v/mim,搅拌速度70r/min，罐表压0.05MPa,接种量10 %，培养时间6d，发酵培养基为米糠30g/L，麸皮45g/L，磷酸二氢钾2.0g/L,硫酸镁5.0g/L, pH自然。将液体培养所得的含少量的米糠麸皮的菌丝体经离心分离后，用水洗涤，菌丝体破壁后用70°C热水浸提3h，过滤取清液。发酵物离心分离液或菌丝经热水浸提后的离心分离液，经脱蛋白、醇沉、 离心分离、真空干燥后分别得到胞外多糖和菌丝多糖，采用苯酚硫酸法测定菌丝多糖和胞外多糖中的多糖含量。结果为菌丝干重5.7g/100mL，胞外多糖为400.4mg/100mL培养液，胞内多糖为192.9mg/100mL培养液。
[0039]实施例九[0040]灵芝菌株采用诱变菌株灵芝CCTCC M2013287。发酵罐装样量为发酵罐容积的80%，培养温度为25°C，通风量1:0.8v/v/mim,罐表压0.05MPa,接种量10%，培养时间5d，发酵培养基为米糠45g/L，麸皮20g/L，磷酸二氢钾4.0g/L,硫酸镁4.5g/L，pH自然。将液体培养所得的含少量的米糠麸皮的菌丝体经离心分离后，用水洗涤，菌丝体破壁后用70°C热水浸提3h，过滤取清液。发酵物离心分离液或菌丝经热水浸提后的离心分离液，经脱蛋白、醇沉、离心分离、真空干燥后分别得到胞外多糖和菌丝多糖，采用苯酚硫酸法测定菌丝多糖和胞外多糖中的多糖含量。结果为菌丝干重5.lg/100mL，胞外多糖为364.3mg/100mL培养液，胞内多糖为158.7mg/100mL培养液。
[0041]实施例十
[0042]灵芝菌株采用诱变菌株灵芝CCTCC M2013287。发酵罐装样量为发酵罐容积的70%，培养温度为30°C，通风量1:0.8v/v/mim，罐表压0.05MPa，接种量10%，培养时间7d，发酵培养基为米糠50g/L，麸皮20g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁1.0g/L,pH自然。将液体培养所得的含少量的米糠麸皮的菌丝体经离心分离后，用水洗涤，菌丝体破壁后用70°C热水浸提3h，过滤取清液。发酵物离心分离液或菌丝经热水浸提后的离心分离液，经脱蛋白、醇沉、离心分离、真空干燥后分别得到胞外多糖和菌丝多糖，采用苯酚硫酸法测定菌丝多糖和胞外多糖中的多糖含量。结果为菌丝干重5.3g/100mL，胞外多糖为377.4mg/100mL培养液，胞内多糖为178.5mg/100m L培养液。
【权利要求】
1.一种灵芝诱变株液态发酵米糠麸皮全料生产多糖的方法，其特征在于利用诱变得到的灵芝菌株，用米糠麸皮全料液态培养基发酵生产灵芝多糖，按照下述步骤进行:(I)称取原料米糠为l-5g/100mL，麸皮为1-4.5g/100mL,磷酸二氢钾0.1-0.5g/100mL,硫酸镁0.1-ο.5g/100mL(2)加所需的水后，装料，pH自然，121°C灭菌兼蒸煮30min，冷却后接入同时发明得到的灵芝CCTCC M2013287液体种子，进行液体发酵；接种量8_10 %，发酵温度25-30°C，发酵时间4-7d ;(3)将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，用水清洗，得菌丝物；(4)菌丝破壁后用70°C热水浸提3h，离心分离，取上清液脱蛋白、醇沉、离心分离、真空干燥后得到菌丝多糖；(5)发酵物过滤液经脱蛋白、醇沉、离心分离、真空干燥后得到胞外多糖。
2.根据权利要求1所述的一种灵芝诱变株液态发酵米糠麸皮全料生产多糖的方法，其特征在于其中所使用的新诱变得到的菌株灵芝CCTCC M2013287(Ganoderma lucidum CCTCCM2013287)，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏菌株编号为CCTCC M2013287。
3.权利要求1或2所述的一种灵芝诱变株液态发酵米糠麸皮全料生产多糖的方法，其特征在于将米糠和麸皮全料加水作为液态培养基使用即全料使用。
4.根据权利要 求1所述的一种灵芝诱变株液态发酵米糠麸皮全料生产多糖的方法，其特征在于摇瓶发酵时，接种量8-10%，装样量为40 %，发酵温度25-30°C，摇床转速150-180r/min，发酵时间 4_7d。
5.根据权利要求1所述的一种灵芝诱变株液态发酵米糠麸皮全料生产多糖的方法，其特征在于上罐发酵时，接种量8-10%，装样量为70-80%，发酵温度25-30°C，搅拌浆转速50-70r/min，发酵时间 4_7d。
【文档编号】C12N13/00GK103555786SQ201310275061
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年6月28日 优先权日:2013年6月28日
【发明者】刘伟民, 沈国栋, 郭天龙, 周文彪, 张笑飞, 赵杰文, 马海乐, 陈静 申请人:江苏大学