专利名称：一种棉花花粉发育过程中细胞dna的荧光标记方法
技术领域：
本发明涉及一种棉花花粉母细胞DNA物质的荧光标记方法，属于生物技术领域。
二背景技术：
植物的小孢子发生到花粉母细胞的成熟的变化过程一直是生殖生物学研究的重要 内容之一。对于棉花小孢子发生和雄配子发育过程的研究从20世纪就开始了，早期的 研究方法主要是石蜡切片法，用苏木精或番红、固绿染色，随后发展到用超薄切片、电 镜观测或离体培养、荧光染色。但直到现在为止，由于这些方法操作复杂，难以快速观 察雄配子体发育的全过程，观察效果不理想。这主要有两方面的原因， 一是实验材料自 身的局限性；二是检测方法的局限性。
植物成熟的花粉粒的壁可分为外壁和内壁，外壁主要由孢粉素和纤维素等物质组 成。其中孢粉素是一种难以分解、抗逆性强、耐高温的物质，稳定性强，具有抗强酸、 强碱的特性，它使花粉粒的外壁非常牢固。内壁主要由纤维素和果胶质组成，易被酶类 物质分解。棉属植物的花粉粒成熟时体积较大，直径大约为85-105pm左右，从四分体 释放出来以后，形成一层不透明的结构非常致密的外壁，外壁的自发荧光非常强，使得 染料渗透不到花粉内。因此如果采用染色薄壁花粉粒(如水稻、小麦花粉粒)的方法来 对棉花成熟花粉粒进行染色，则完全观察不到它的内部结构。此外，前人在检测棉花雄 配子体发育的过程时所用的染料的特异性不强，而且实验程序比较繁琐，周期较长。因 此尚没有妥善的解决方法。
脱外壁花粉粒是指花粉粒被脱去外壁后，留下的内壁与原生质体，是介于完整花粉 粒与花粉粒原生质体之间的一种结构单位，是一种可用于研究花粉形态与生理特性的独 特材料。脱外壁花粉粒可用来研究内壁的表面结构、剥离的外壁结构与成分、内壁的沉 积、新壁的合成等多方面的内容；脱外壁花粉粒由于排除了外壁对生物大分子的屏障作 用，有利于染料分子的进入。用荧光染料对核DNA进行染色后，再用荧光显微镜或激 光扫描共聚焦显微镜观察，可研究花粉粒内部的核结构及其变化规律。本方法通过热激 -氧化法制备脱外壁花粉粒，再用DNA荧光染料DAPI (4, 6- diamidino- 2- phenylindole， 4， 6-联脒-2-苯基吲哚)进行染色，建立了一种简便的制片程序，荧光显微镜研究了棉 花花粉粒的结构特点及其细胞核的状态。DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，它能粘附在DNA双螺旋的小沟区。DAPI-DNA复合物的激发和发射波长分别为360 nm和460nm具有很高的光漂白承受水平。而且它还可以透过完整的细胞膜，用于活细 胞和固定细胞的染色。本方法探索了用DAPI荧光染料进行检测棉花雄性配子体发育过 程的试验，建立了完整可行的试验方法，操作步骤简单，试验效果稳定、清晰，因此无 论是在科研、检测以及学生试验中都能得到很好的应用。
发明内容
技术问题本发明的目的在于提供一种较快速、有效的的检测棉花雄性配子体发育 过程的方法。花蕾直径大于7mm时，花粉母细胞已经发育为幼嫩花粉粒，需通过次氯 酸钠氧化热激脱去花粉粒外壁，再通过DAPI染色检测细胞内含DNA物质的核变化。 花蕾直径小于7mm时，花粉母细胞还没有发育成幼嫩花粉粒，花粉壁还未形成，则不 需要经过脱外壁处理即可染色镜检。
技术方案
一种棉花花粉母细胞DNA物质的荧光标记方法，包括以下步骤
1) 晴天早晨6 — 7点间随机摘取不同大小的棉花花蕾，剥去苞叶，固定于无水乙醇
冰醋酸配成体积比3:1的卡诺氏固定液，12—24h后转入体积比为70%的乙醇中，保存 于4'C冰箱；
2) 固定好的样品经体积浓度为50%、 30%、 10%的乙醇逐级下行至蒸馏水；
3) 直径小于7mm的花蕾，用解剖针剥离出其中的花粉母细胞，置于体积比0.1—0.2 %的甘油中渗透2-3h;用pH7-8的磷酸缓冲液洗涤花粉母细胞，将花粉母细胞用0.5 -lpg/ml的DAPI避光染色l-2h，细胞内DNA物质被荧光标记；
4) 直径大于7mm的花蕾，用镊子剥离出其中的成熟花粉粒，加入质量体积比10% 的次氯酸钠水溶液，室温振荡放置10min，再于60°C水浴处理10 min;用pH7-8的磷 酸缓冲液洗涤花粉粒；花粉粒置于体积比0.1—0.2X的甘油中渗透2-3h;用pH7-8的磷 酸缓冲液洗涤花粉粒；再将花粉粒移至载玻片，加入100-20(^L浓度为2pg/ml的DAPI 溶液，盖片，适度用力斜压至外壁脱掉而花粉粒细胞不破裂为度，放在暗盒中静置10min 后镜检，细胞内DNA物质被荧光标记。上述的方法中所述棉花为陆地棉。
有益效果
本发明提供了一种对棉花雄性配子体发育过程的快速检测方法。本发明的标记和成 熟花粉粒脱外壁方法具有以下优点l)操作简单，快速省略了常规石蜡切片中的切片 步骤；2)用甘油作为渗透试剂，使得荧光染色效率更高；3)标记效果好；4)成熟花粉脱外壁后花粉粒依然完整。本发明方法和结果为开展与棉花花粉粒有关的生殖生物学 研究和开发提供了新的途径和依据。
四、 说明书附图
图1棉花雄性配子体发育到不同时期的观察
A， F) 偶线期(X400), Bar=90nm; B) 减I后期(X400), Bar=100nm; C)减I末
期(X400), Bar=10CVm; D) 二分体时期(X400)， Bar=90nm; E)末期II; F-I)四分
体时期(X400)， Bar=90nm; J-L)成熟花粉粒单核、二核、三核期(X400), Bar=9CVm
图2检测鲁棉21雄性配子体发育过程的技术流程图
五具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分含量如无特别说明均 为体积百分含量。
实施例l、鲁棉21雄性配子体的荧光标记及其显微镜观测(主要技术流程见图2) 首先用本发明的方法对鲁棉21 (生产用种)雄配子体进行荧光标记，包括以下步
骤
1) 早晨6: 30左右采集不同大小的花蕾，剥去苞叶，迅速固定于新鲜配制的卡诺氏
固定液(无水乙醇冰醋酸配成体积比3: l的溶液)，抽气固定12—24h后转入70X乙
醇中，保存于4"C冰箱，备用；
2) 固定好的样品经浓度为50%、 30%、 10%的乙醇(蒸馏水配制)逐级下行至蒸
馏水，每级停留2h;
3.1虔径小于7mm的花蕾，用解剖针剥离出其中的花粉母细胞(除去全部的花药碎 片等杂质)，置于0.15%的甘油(PBS缓冲液稀释)中，在室温下静置渗透2h;
3丄1)用pH7.4的PBS缓冲液洗涤3次，每次在缓冲液中停留10—20min后，静置 几分钟待样品沉淀后再用移液枪将上层缓冲液吸出；
3丄2)将花粉母细胞用0.5Mg/ml的DAPI (Sigma公司，USA)在室温下暗孵育lh， 然后不经洗涤直接在荧光显微镜下检测(观察结果如图l， A-I)。
通过固定、渗透、染色及镜检等操作，观察到了棉花雄配子体的不同发育时期。减
数分裂的偶线期染色体分布比较松散(图l-A);后期I:同源染色体被纺锤丝牵引 分离，均匀拉向两级(图l-B);末期I :染色体平均分配，分别到达两极(图l-C)，细胞壁没有形成，细胞质进行分裂，形成二分体，说明其不是同时型胞质分裂(图l-D); 末期II:染色体逐渐进入解螺旋(图l-E);四分体时期四分体的排列为四面体结构， 4个小孢子被共同的胼胝质包被，小孢子之间也被胼胝质分割(图1-F-I)。
在对棉花雄配子体发育过程的观察中还发现，不同植株、同一植株的不同花序以及 同一花蕾不同小花的花粉母细胞减数分裂的速度亦不同步，甚至同一花药内的细胞分裂 速度也存在差异。因此，实验中在同一制片中可以观察到多于l个的不同时期的分裂相 (图l-F)。
3.2)直径大于7mm的花蕾，用镊子剥离出其中的成熟花粉粒，加入10%次氯酸钠 水溶液，室温振荡放置10min，再于6(TC水浴处理10min;
3.2.1) 用pH7.4的PBS缓冲液洗涤3次，每次在缓冲液中停留10—20min后，静置
几分钟待样品沉淀后再用移液枪将上层缓冲液吸出；
3.2.2) 洗涤后的样品再置于0.15%的甘油(PBS缓冲液稀释)中渗透2h;
3.2.3) 用pH7.4的PBS缓冲液洗涤3次，每次在缓冲液中停留10—20min后，静置
几分钟待样品沉淀后再用移液枪将上层缓冲液吸出；
3.2.4) 再用移液枪将花粉粒细胞移至载玻片，加入100nL浓度为2pg/ml的DAPI (Sigma公司，USA)溶液，迅速盖片，适度用力斜压至外壁脱掉而花粉粒细胞不破裂
为度，放在暗盒中静置10min后再在荧光显微镜下镜检(观察结果如图l， J-L)。
在荧光显微镜观察下，可清晰地看到经过DAPI染色后的脱外壁花粉粒的内部核结 构，可清楚地分辨出单核花粉粒(图l-J)、双核花粉粒(图l-K)和三核花粉粒(图 l-L)等三种不同类型的花粉粒(图中箭头所指皆表示核)。单核花粉粒中的细胞核还没 有进行有丝分裂，或者已进行过一次有丝分裂，但是，营养核与生殖核仍然聚集在一起。 双核花粉粒已进行了一次有丝分裂，形成一个营养核与一个生殖核，且两者已经明显分 开。三核花粉粒已进行过两次连续的有丝分裂，包含一个营养核和两个精细胞核，且三 者已经明显分开。
权利要求
1、一种棉花花粉发育过程中细胞DNA的荧光标记方法，包括以下步骤1)晴天早晨6—7点间摘取棉花花蕾，剥去苞叶，固定于无水乙醇冰醋酸配成体积比3∶1的卡诺氏固定液，12—24h后转入体积比为70％的乙醇中，保存于4℃冰箱；2)固定好的样品经体积浓度为50％、30％、10％的乙醇逐级下行至蒸馏水；3)直径小于7mm的花蕾，用解剖针剥离出其中的花粉母细胞，置于体积比0.1—0.2％的甘油中渗透2-3h；用pH7-8的磷酸缓冲液洗涤花粉母细胞，将花粉母细胞用0.5-1μg/ml的DAPI避光染色1-2h，细胞内DNA物质被荧光标记；4)直径大于7mm的花蕾，用镊子剥离出其中的成熟花粉粒，加入质量体积比10％的次氯酸钠水溶液，室温振荡放置10min，再于60℃水浴处理10min用pH7-8的磷酸缓冲液洗涤花粉粒；花粉粒置于体积比0.1—0.2％的甘油中渗透2-3h；用pH7-8的磷酸缓冲液洗涤花粉粒；再将花粉粒移至载玻片，加入100-200μL浓度为2μg/ml的DAPI溶液，盖片，用力斜压至外壁脱掉而花粉粒细胞不破裂为度，放在暗盒中静置10min后镜检，细胞内DNA物质被荧光标记。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述棉花为陆地棉。
全文摘要
本发明公开了一种检测棉花花粉母细胞DNA物质的荧光标记方法，属于生物技术领域。包括晴天早晨摘取花蕾，样品经不同浓度乙醇逐级下行至蒸馏水；直径小于7mm的花蕾中的花粉母细胞，置于甘油中渗透2-3h；洗涤后用DAPI避光染色1-2h，细胞内DNA物质被标记。直径大于7mm的花蕾中的成熟花粉粒，加入10％次氯酸钠水溶液于60℃水浴中处理10min；洗涤后置于0.1-0.2％甘油中渗透2-3h；洗涤后再加入DAPI溶液，静置10min后镜检，细胞内DNA物质被标记。本发明具有操作简单、快速，对细胞的损伤小，标记效果好，易观察的优点，将在棉花雄配子体发育过程的研究中发挥重要作用，实际应用价值高。
文档编号C12Q1/68GK101413033SQ20081023456
公开日2009年4月22日 申请日期2008年11月21日 优先权日2008年11月21日
发明者吴李君, 吴跃进, 唐灿明, 岳洁瑜 申请人:南京农业大学