白菜花粉壁发育相关基因PGBc2及其分离方法

专利名称：白菜花粉壁发育相关基因PGBc2及其分离方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种白菜花粉壁发育相关基因PG5c2及其分离方法。
背景技术：
花粉发育与植物雄性不育密切相关，同时是研究细胞生长、分裂、细胞分 化和细胞间信息传递等过程的理想模型。因此，花粉发育研究一直是生命科学 研究领域中的热点。花粉发育过程复杂，涉及众多基因的表达调控。研究发现 花粉基因表达的一大特点就是表达大量与细胞壁合成、调控相关的基因。花粉 粒最具特色的一部分是花粉壁(Blackmore and Barnes, 1990; Owen andMakaroff, 1995)。由花粉外壁和花粉内壁两层组成，在花粉发挥正常功能上起 着举足轻重的作用，尤其是在花粉萌发和花粉管生长过程中，花粉壁的异常是 导致花粉不能完成其生物学功能的主要原因之一。关于作用于花粉壁发育的基因或蛋白质目前研究不多，在模式生物拟南芥 中，只发现了数个花粉外壁发育的异常的突变体，例如迈s么/7p入"e/7和^;^， 以及2个花粉外壁和内壁同时异常的突变体迈s3滩/^7。这些突变体对应的基因 所编码的蛋白质功能均未完全明确(Aarts eta7, 1997; Paxson-Sowders "a7， 1997， 2001; Shukla et a7. ， 1998; Fei and Sawhney， 2001; Ariizumi et a7， 2003， 2005)。在白菜中尚未有作用于花粉壁发育的基因或突变体被分离的报 导。花粉萌发时的水合花粉会释放很多存在于花粉壁中的蛋白质，或者从花粉 内部分泌一些蛋白质，这些蛋白质被认为是花粉壁或花粉管壁发育所必需的 (Cosgrove eta7， 1997, 2000; Allen eta7， 1993)，多聚半乳糖醛酸酶(PG)就是其中之一。它是一种细胞壁水解和疏松酶，参与果胶的降解，使细胞壁结 构解体。尽管目前的研究推测花粉管中的PG可能通过降解花柱细胞壁而允许花 粉管通过花柱，或者可能作用于本身的细胞壁而加速自身的生长(Brown1990; Allen " a7， 1993; Hadfield " <a7, 1998; Honys " a二 2003)。但 是，确切证据却少之又少。因此，花粉壁发育相关的基因的克隆和功能鉴定仍 然是一项重要的工作。发明内容本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足，提供了一种白菜花粉壁发 育相关的基因/^^^及其分离方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的-一种白菜花粉壁发育相关基因尸6及么它包含SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。进一步地，还包括在SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列中添加、取代、插入 或缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。一种权利要求1所述的白菜花粉壁发育相关基因/^^2的分离方法，包括以下步骤(1) 、用A8/T18引物对 <矮脚黄'白菜核雄性不育两用系的不育株系与可育 株系花蕾基因表达差异进行cDNA-AFLP分析，获得在可育株系花蕾中特异表 达的基因片段Bc-A8T18，该片段包含SEQ ID No. 1所述的核苷酸序列和在SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸生成 的衍生物；(2) 、利用RACE技术扩增Bc-A8T18片段相关的基因的cDNA的3'末端和5' 末端，其中，正向特异引物S1序列为5' -CTCCTCTCCAGGTTCTGACATTACT-3，； 反向特异引物A1序列为5， -CTGCTCGGTGTTGGAGATTGG-3，；分别与3' RACE和 5' RACE锚定引物扩增3'末端和5'末端；(3) 、用常规PCR扩增Bc-A8T18片段相关基因的cDNA序列及其DNA序列，该 DNA序列即为SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。根据两端拼接的cDNA全长序 列设计特异引物Tl和T2，从花蕾cDNA中扩增Be-A8T18片段相关基因的cDNA 序列，从基因组DNA中扩增其DNA序列。Tl和T2的序列分别为Tl, 5， -TGGGATTTTCAGCCAATG-3' ; T2， 5' -AGAGCATACATCATAGAC-3，。本发明的有益效果是本发明采用cDNA-AFLP技术对'矮脚黄'白菜核不 育两用系的不育株系与可育株系花蕾基因表达差异进行分析，同时配合RACE技术分离获得与花粉壁发育相关基因为进一步弄清不育株系花粉败育的原因，以及阐明植物花粉壁发育和雄性不育发生的分子机制提供研究基 础，进而为人工创建不育材料、培育优良品种提供物质条件。


图1是白菜尸6^W cDNA和DNA全长序列的扩增图； 图2为推测的白菜尸6^^氨基酸序列图； 图3为白菜尸6^^的时空表达特点示意图； 图4为白菜尸6^^表达的原位杂交分析图；图5为反义/^^2基因表达载体示意图；图6为Northern杂交检测户6^^在转基因菜心中的表达示意图; 图7转反义/^^^基因菜心的花粉离体萌发观察图；图8转反义/^ft^基因菜心花粉扫描电镜观察图；图9转反义/^A^基因菜心花粉发育透射电镜观察图。
具体实施方式
本发明通过基因表达差异分析从白菜^力^5" Wca^^7-W力S'的可育株 系花蕾中分离得到一个可育花蕾特异表达的基因尸"万c么序列分析表明该基因 具有植物PG基因家族的4个保守结构域，并与已知的PG基因具有较高的相似 性，但不同于已知的PG基因家族成员，因此为一个新的PG基因。RT-PCR、 Northern杂交及原位杂交表明，凡Wc2的转录本最早在白菜花药四分体时期的 绒毡层和四分小孢子中出现，且在绒毡层中的表达量要比在四分小孢子中的表 达量高。随后在绒毡层中一直维持很强的表达信号，直到绒毡层的降解退化， 在小孢子中的表达水平从单核小孢子时期开始增强， 一直持续到花粉成熟期。 通过反义RNA技术，将尸6^^的反义基因导入正常可育的白菜细胞，验证了该基因的功能。发现/^&^表达受抑制或沉默的转基因植株花粉因花粉壁发育的 受阻导致花粉不能正常萌发，植株雄性育性降低，表明/^ft^为一个重要的花 粉壁发育相关基因。该基因的分离克隆，有助于阐明花粉发育和植物雄性不育 分子机理，对生产上人为控制植物育性，培育优良品种具有重要的实践意义。 实现本发明的具体技术步骤如下1. 白菜/^5ci"基因的分离和序列分析利用cDNA-AFLP技术分析白菜'Aa力W-^M/W的不育株系与可 育株系花蕾基因表达差异，筛选到A8/T18引物扩增得到的在可育株系花蕾中 特异表达的基因片段Bc-A8T18，长250 bp，具体序列见SEQ ID No. 1。通过 RACE技术扩增得到该片段相关基因的cDNA的3'末端，2次扩增结果均显示 目的片段大小约为1 400bp，如图1A泳道1、2所示；3' RAGE产物克隆至pGEM-T Easy载体，转化DH 5d感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，碱裂解法抽提质 粒，酶切鉴定'(图1B)后测序。类似地，通过RACE技术扩增得到该片段相关 基因的cDNA的5'末端(图1C泳道1、 2)，经克隆后酶切鉴定(图1C泳道3、 4)再测序。根据两端拼接的cDNA全长序列设计引物，常规PCR方法扩增Bc-A8T18 片段相关基因的cDNA序列(图1D泳道1)及其DNA序列(图1D泳道2)，经 克隆后酶切鉴定(图lD泳道l为cDNA单克隆的酶切鉴定，图1D泳道2为DNA 单克隆的酶切鉴定)再测序。DNA序列全长1 594 bp，具体序列见SEQ ID No. 2。利用生物信息学相关 软件分析该基因序列，发现其含有3个外显子和2个内含子，最大开放阅读框 长l 188 bp，编码395个氨基酸。在假定的蛋白质序列的N端具有一段疏水信 号肽。在数据库中进行同源搜索发现推测的氨基酸序列与拟南芥花粉表达的假 定的多聚半乳糖醛酸酶PGA3序列具有86%的一致性和94%的相似性。在蛋白质 结构数据库中搜索发现推测的氨基酸序列中具有一个典型的PG活性位点。与其 他发表的植物PG的氨基酸序列比较，其氨基酸序列中包含植物PG所特有的4 个保守结构域(图2下划线部分即为植物PG特有的功能结构域)。这些结果说 明，该基因是一个典型的PG基因，命名为/^&7么2. /^9c^的时空表达特点分析(1 )RT-PCR和Northern杂交分析尸Cft^在白菜aJ/ fifc5" ' ^c^^;7-^^/^ 可育植株5级不同大小的花蕾(花蕾纵径的大小从I级到V级分别为:小于1 mm、 1.2 ~ 1.6 mm、 1. 8 2. 2 mm、 2. 4 2. 8 mm、 3. 0 3. 4 mm，这些大小不同 的花蕾分别对应于小孢子母细胞形成及形成前时期、四分体时期、单核花粉粒 时期及成熟花粉时期)以及开放的花、嫩角果、花茎和花茎叶片中的表达情况。 结果发现，RT-PCR分析(如图3A所示)和Northern杂交分析(如图3B所示) H^^的表达模式均显示相同的结果，其转录本最早在III级花蕾中也就是四分 体时期开始出现，并且表达量较高，随后在单核花粉粒时期的花蕾、包含成熟花粉粒的v级花蕾、开放的花及嫩角果中持续表达。而在减数分裂以前的II、 I 级花蕾以及花茎和花茎叶片中均未检测到/^^^的表达(图3中，B1 B5表示 Wcsj力W-OW的1 V级花蕾；F、 Si、 S、 L依次表示"ca^W;7-OW开放的 花、嫩角果、花茎和叶片；遍在表达的A7^'/7-7作为对照。)。(2)利用原位杂交技术进一步分析了 /^ft^在不同发育阶段的花蕾中的表 达情况。发现，杂交信号首先在四分体时期的绒毡层和四分小孢子中出现，且 在绒毡层中的信号要比在四分小孢子中的信号强(图4B);在单核小孢子后期， 绒毡层开始降解，但仍能看到很强的杂交信号，而在此时的单核小孢子中，杂 交信号要强于四分体时期(图4C);到成熟花粉期，絨毡层己经完全降解，这时，表达信号仅在花粉粒中检测到，信号强弱类似于单核小孢子时期(图4D);而在四分体时期之前的花药(图4A)、所有被检测花蕾的萼片、花瓣、中柱、雌蕊中， 以及用正义探针进行杂交的对照中(图4 E、 F)均没有检测到/^^2的表达信号。3.利用反义RNA技术验证A^c^的功能分别构建含CaMV35S组成型启动子和BcA9组织特异型启动子的反义/^5c2 基因表达载体(图5)，通过农杆菌介导法转入菜心(白菜的一个变种)植株， 通过菜心无菌苗的培养、菜心子叶-子叶柄外植体的预培养、共培养、分化培养 诱导KanB苗的产生、在无菌瓶中生长扩繁Kar^苗、生根培养、移栽转化植株等 一系列过程，分别获得/^5c2的转基因植株J55"-;^^i"(含CaM35S组成型启动 子的转化植株)和^^-p^bc^ (含BcA9绒毡层特异表达型启动子的转化植株)。 选取转基因直至进行Northern杂交，以白菜Wcaj力^7-^M/5'植株花蕾(图6 中的B)、花(图6中的F)及非转基因菜心植株(图6中的non-tra)花蕾和花 为对照，用尸fift^的cDNA作为模板标记探针。结果显示，选取的其中一株转基 因植株J5S-;^^^的花蕾和花中均没有检测到/^^^的表达信号，在另一株的 花蕾和花中检测到了很弱的杂交信号；在4株选取的^^-;^k^植株中，有l株 的花蕾和1株的花中仍有较弱的表达信号，在另外2株的花蕾和花中均没有检 测到明显的杂交信号。相反在可育株^&a^W7-^^'(图6中的B strain即 为'万ca力W-W万'，A strain为Wcaj7^7-。W )及非转基因菜心植株的花 蕾和花中都检测到很高的/^^2表达水平。这些结果说明凡Wc^的表达在转基 因植株中受到较明显的抑制，经过Northern印迹杂交，得到尸^ft^的表达受到 明显抑制的转基因植株。对S55-;^bc^和力9-;^力c2转基因植株进行形态学性状观察，发现; ^;c^和^9-;^&^营养生长正常，并且能正常开花，花器官的发育也与非转基因植株 的没有明显区别。经蕾期授粉自交，转基因植株能结出果荚，但与非转基因的 野生型植株自交产生的果荚相比，其果荚不饱满，每个果荚只产生1 5粒种 子。而正常非转基因植株果荚饱满，能产生约15粒种子。将非转基因植株正常 的花粉分别授到转基因植株J必-p^^和必-/^7^的柱头上，结出的果荚大小 及产籽数和野生型植株没有差异。转基因植株自交^产生的种子播种能正常生长 发育，得到Ti代植株各50株。这些说明转基因植株雌性育性和胚珠发育正常， 其育性降低应该归咎于花粉功能的异常。后期检测发现1 5^-/^^^和^^-/7^^2 植株所呈现的性状没有明显区别，因此合称pg力c么/^力ci"植株花粉离体正常萌 发率明显降低(图71)，与非转基因植株(图7中的WT)正常的花粉离体萌发(图7A)和花粉萌发时核和内含物在花粉管内的正常移动(图7 B D)相比， /^&^植株约81%的花粉萌发时花粉管爆裂(图7E)，同时，核能进入爆裂的花 粉管(图7F H)。扫描电镜观察显示，与非转基因对照植株(WT)的正常花粉(图8E、 F)相比，"^^表达受抑制的转基因植株<^5""7^力^和^-/7^7^产 生外壁网纹浅的畸形花粉(图8A D)。透射电镜观察显示，转基因植株/^^2在 三核花粉的花粉萌发沟处外壁开始脱落，内壁异常增厚(图9F、 H),范围比非 转基因植株(图犯、G)的萌发沟广，增厚程度大；成熟花粉期，因为外壁破坏， /^bd花粉外壁含油层外溢(图9J、 L)。图9左栏为非转基因对照植株的花粉 发育过程，右栏为转基因植株P^bc2的花粉发育过程，Ba表示基粒棒；exine 表示花粉外壁；Fm表示游离小孢子；Gf表示萌发沟；In表示内壁；Ne表示外 壁内层；Np表示单核花粉；Tc表示覆盖层；Tp表示三核花粉。这些结果说明 尸6^^基因参与了花粉壁的发育。结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明范围。 实施例l /^^^基因的分离和克隆(1) Be-A8T18片段的分离用A8/T18引物对白菜aj力^5" WcajM7-WJ/F的不育株系与可育株系花蕾基因表达差异进行cDNA-AFLP分析，检测 到在可育株系花蕾中特异表达的基因条带Be-A8T18,用手术刀片割下聚丙烯 酰胺凝胶上的差异片段，溶于100 PLTE (10mmol'l^Tris， pH 7. 5, 1画1'L/1 EDTA， pH8.0)，并作为模板进行PCR扩增，条件与cDNA-AFLP中的预扩增相 同。PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，经凝胶回收试剂盒纯化。回收产物连接 到pGEM-T Easy Vector (Promega)并转化到A coh' DH 5 a感受态细胞，经蓝白斑筛选重组质粒，测序，最后RT-PCR验证得到该条带的核苷酸序列。(2) Be-A8T18片段相关的基因的cDNA的3，末端和5，末端扩增根 据双链cDNA合成试剂盒(SMART PCR cDNA Synthesis Kit)中接头及引物的 特征设计了 3' RACE和5' RACE锚定引物P3和P5;根据差异片段Bc-A8T18 设计正向特异引物S1，与锚定引物P3扩增3'末端，反向引物Al与锚定引物 P5扩增5'末端。锚定引物P5的序列为5， -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，； 锚定引物P3的序列为5， -GAGGCGGCCGACATGTTTTT-3，；正向特异引物Sl序 列为5， -CTCCTCTCCAGGTTCTGACATTACT-3，； 反向特异引物Al序列为 5， -CTGCTCGGTGTTGGAGATTGG-3， 。 PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒回收，插入 pGEM-T Easy载体，转化DH 5 a感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，碱裂解法 抽提质粒，酶切鉴定后，重组质粒送上海博亚生物技术有限公司测序，得到 Bc-A8T18片段相关的基因的cDNA的3'末端和5'末端。(3) /^^^基因的全长克隆根据两端拼接的cDNA全长序列设计特异引 物Tl (序列为5， -TGGGATTTTCAGCCAATG-3，)和T2 (序列为 5， -AGAGCATACATCATAGAC-3，)。常规PCR方法再次从花蕾cDNA中扩增 Bc-A8T18片段相关基因的cDNA序列；用同一特异引物对在基因组DNA中扩增 得到其DNA序列。实施例2利用反义RNA技术验证/^ft^的功能(1)反义表达载体的构建根据尸""cDNA全长序列，在尸MW序列内部 第85个碱基至第546个碱基之间设计引物，扩增462 bp序列作为反义基因片 段，见SEQ ID No:3。并根据植物双元载体pBI121的多克隆酶切位点，设计分 别含有万』I和Z力a I限制性内切酶位点以及三个保护碱基的两条PCR扩增引 物，上游引物为5' -ACAGGATCCGAGCTTTTACCGTTTTTA-3，，下游引物为 5， -GCCTCTAGATGGCATCTATTGMGATA-3 ，(划线部分为酶切位点)。以 Wca力W-。75，花蕾cDNA为模板进行PCR扩增。产物克隆至pGEM-T Easy载 体，阳性克隆质粒命名为pTPGBc2A。(2) CaMV35S组成型启动子表达载体和BcA9组织特异型启动子表达载体的 构建将反义尸^c^片段与经飽/zH I和JZ^ I双酶切的双元载体pBI121混合 连接，产物转化DH 5 a感受态细胞，在含Kan 50 mg'L—1的固体LB培养基平板 上培养过夜。挑取单菌落，在含Kan50mg'L—'的液体LB培养基中振荡培养过夜， 碱裂解法抽提其质粒DNA，采用PCR和限制性内切酶酶切等方法鉴定阳性克隆。 阳性克隆质粒命名为pBI35S-PGBc2A。 BcA9启动子是从白菜中分离得到的、在花药组织中特异表达的组织特异型启动子。将反义户G&^片段、BcA9启动子和 经历y^III和A』I双酶切的pBI121混合连接，如上方法转化、鉴定获得阳 性克隆质粒，命名为pBIBcA9-PGBc2A。(3) 反义表达载体对菜心的遗传转化将上述构建好的植物表达载体 pBI35S-PGBc2A及pBIBcA9-PGBc2A质粒转入农杆菌LBA4404,菜心的遗传转化 通过组织培养途径实现。各培养基的成分如下预培养和共培养培养基1/2倍浓度肌+的MS培养基的盐类+ 2%蔗糖+ 0.8%琼脂+ 3 mg'l/1 BAP + 1 mg'l/1 NAA + 7.5 mg,L—1 AgN03 (pH值5. 8)。分化培养基1/2倍浓度NH/的MS培养基的盐类+ 2%蔗糖+ 0. 8%琼脂+ 3 mg丄-1 BAP + 1 mg丄—1 NAA + 7. 5 mg'L—1 AgN03 + 7. 5 mg丄-1 Kan + 300 mg'l/1 Amp (pH值5.8)。生根培养基1/2MS培养基的盐类及维生素+0.8%琼脂+5mg'L_1Kan (PH 值5.8)。植物生长调节剂在高压灭菌前加入，AgN03和抗生素在高压灭菌后加入，高 压灭菌的条件为121。C保持20 min， 50。C保温。本实验以子叶-子叶柄为外植体，把子叶柄插入预培养培养基中2 ~ 3 ram 深，培养3 d，农杆菌侵染后平放入共培养培养基上，培养2 d。将共培养2 d 后的菜心子叶-子叶柄外植体转入分化培养基上，大约20 d左右，待分化出的 抗性芽长到一定大小，小心从基部将其切下转入到新的分化培养基上继续生长。 得到的抗性芽在分化培养基上继代并筛选，每20d左右转瓶一次，去除其中的 假阳性植株。待抗性植株长到2 ~ 3 cm时，将其从愈伤组织切下，转到生根培 养基上。待抗性植株在生根培养基上长出大量白色的须状根时，打开瓶口炼苗2 3d，小心去除根上的培养基，移入含水量为60%的培养土中，保湿培养5~7 天后，再转到室外培养。转基因植株经PCR检测、Southern及Northern印迹杂交检测，筛选获得 /^5c2基因表达沉默和受抑制的转基因植株J55"-; ^7C^和力9-j^6c么(4) 转基因植株的形态和细胞学观察检测体外和体内花粉萌发情况,用于 花粉离体萌发的半固体培养基组成为15%蔗糖+ 0.4 mmol L-l硼酸+ 0. 4 mmol *L-1 CaN03 + 0.1%琼脂。采集花朵的时间均为上午9:00左右，每株采5朵 花药刚裂开的花，采后先将花粉抖落到硫酸纸上，充分混匀，将其点涂在载玻 片上的培养基中，不加盖玻片，将载玻片置于铺有湿润滤纸的培养皿中，置于 黑暗、20 25t:恒温条件下培养，4 ~ 6 h后在显微镜下观察萌发率。扫描电镜观察花粉形态，采刚开放的花朵，用镊子夹持花药将花粉轻轻地涂在贴有双面胶的金属载物台上，喷金后在Philips XL-40型扫描电镜下观察花粉形状、饱满 程度及表面网纹，拍照。透射电镜观察花粉发育过程，取不同大小花蕾中的花药， 制备超薄切片观察花粉花药发育过程。最后，还需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然， 本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本 发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。序列表〈110>浙江大学〈120〉白菜花粉壁发育相关基因尸6^C2及其分离方法〈160〉 2〈170> Patentln version 3.1〈210〉 1〈211〉 250〈212〉 DNA〈213> Brassica ra<400〉 1ttttattaaaggggtgcatattttggagctttttccgtttttatttt60ctgtttattgggattttcagccaatgctgtatacatcaccattggctcctctccaggctc120caggcacttctgagcattc3C3acagcatgccaatctccaacaccgag180cgtggtg3tCCCgg3g3gttCgcttgggtgagatccagatgggtccat240gcagctcc250〈210〉 2〈211〉 1594〈212〉 DNA〈213> Brassica ra〈400〉 2gaeigaaacaacaaataaaatagtaatattaaatttttt60gggtgcatatUtggagcttttaccgtttttattttctgtttattgggat120tttcagccaatgctgtatscatcaccattggctcctctccttctgacattactcagg180ttagttacattgctctcctttttcttgctatacaagcaatatattatcgg240ctacgttgttaaggttctattgcgcatgacatatgcaggcacttctgaaagC3ttC3C33300C￡lgC3tgCC￡lccgagcgtggtgatccc3aggagagttcaagcttg360gtgagatccagatgaggggtccatgcaaagctccagtcgagatcaccattcaaggcactg420tcaaaLgctg3tggtaacgcgatcc3gggaggscacatggattgtctttggcaac3tta480atggctttaagttgaacggaggtggagctttcgatggtga3cgcagcttggg540ttcaactgtcaccagactttcaactgcaagaaacttcccatcgtatgtgtgcttatat600atgtCCtC3LSLtttaattggcttttgtgaaaaataatageit.tagtgatgtt660attttgtcttttttttatag3gt3taaggtttgatttcgtggeLgaacgctgagatcaaag720acatatcttcaatagatgccaagaacttccgctcggtgcc780ccatggatcacatcaacatcattgccccaaaagaceLgtcccaacactgacggtatccatt840tggga卿3gtgacggagtc犯gstccttactccaccggagacgactgta900tatccgttgg卿tggg2Ltgaagaaccttc3Cgtgg卿3agtcacgtgcggtcc鄉ac960atggaatcagtgtcgg鄉ccttgg犯ggtacggaaacgaac3ggaitgtcagcggcatta1020g3gtc￡ita<aactgcactctcC6LaCELgactgacaacggactgaggatxaagacatggcctt1080ctgcagcttgCtCC3CC3CCgcctccgatattcatttcgagaatatcattctcaagaacg1140ttatgaacccaatcctcatcgaccaagagtactgcccttggaaccaatgtaac犯gcaga1200aaccat caacgattaagcttgccaacatcagcttcaagcagatc柳ggaacatcagggat1260acaaggatgceigtgeL8igcta>ttgtgCEigcaggggatacccatgccaaaacgttg鄉ttg1320g￡lga_C3ttg3cattaggtacagcggagcag3tggtccagcgactttccagtgctcaaacg1380tgagccccaaactcatgggaactcagagccctaaagcttgC3gtggtCC3gtgaccaact1440taccccaata3gt3g犯gCtcaaaaaatatt aaac t aaaacacccattcattatttgttt1500tgtttcctac8cccaattta3tttatatggtctatgatgtatgctctcattctttctaat1560tcaatataaatgcattcattatgcctttttgELCC159权利要求
1、一种白菜花粉壁发育相关基因PGBc2，其特征在于它包含SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
2、 根据权利要求1所述的白菜花粉壁发育相关基因其特征在于 还包括在SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或 多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。
3、 一种权利要求l所述的白菜花粉壁发育相关基因HWc^的分离方法，其特征在于，包括以下步骤(1) Bc-A8T18片段的分离用A8/T18引物对白菜的不育株系与可育株 系花蕾基因表达差异进行cDNA-AFLP分析，检测到在可育株系花蕾中特异表 达的基因条带Bc-A8T18，用手术刀片割下聚丙烯酰胺凝胶上的差异片段，溶 于100叱TE，并作为模板进行PCR扩增，条件与cDNA-AFLP中的预扩增相 同，PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，经凝胶回收试剂盒纯化，回收产物连接 到pGEM-T Easy Vector并转化到f. DH 5 a感受态细胞。 经蓝白斑筛选重组质粒，测序，最后RT-PCR验证得到该条带的核苷酸序列。(2) Be-A8T18片段相关的基因的cDNA的3，末端和5，末端扩增根 据双链cDNA合成试剂盒中接头及引物的特征设计3' RACE和5' RACE锚定引 物P3和P5;根据差异片段Be-A8T18设计正向特异引物SI和反向特异引物Al, 正向特异引物SI与锚定引物P3扩增3'末端，反向特异引物Al与锚定引物 P5扩增5'末端。锚定引物P5的序列为5， -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，； 锚定引物P3的序列为5， -GAGGCGGCCGACATGTTTTT-3，；正向特异引物Sl序 列为5' -CTCCTCTCCAGGTTCTGACATTACT-3';反向特异引物Al序列为 5， -CTGCTCGGTGTTGGAGATTGG-3' ; PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒回收，插入 pGEM-T Easy载体，转化DH 5 a感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，碱裂解法 抽提质粒，酶切鉴定后，测序，得到Bc-A8T18片段相关的基因的cDNA的3， 末端和5'末端。(3) /^&^基因的全长克隆根据两端拼接的cDNA全长序列设计特异引 物Tl和T2， Tl的序列为5， -TGGGATTTTCAGCCAATG-3， ， T2的序列为 5， -AGAGCATACATCATAGAC-3，；常规PCR方法再次从花蕾cDNA中扩增Be-A8T18 片段相关基因的cDNA序列；用同一特异引物对在基因组DNA中扩增得到其DNA 序列SEQ ID No. 2。
全文摘要
本发明公开了一种白菜花粉壁发育相关基因PGBc2及其分离方法，白菜花粉壁发育相关基因PGBc2包含SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，该基因的分离克隆及功能验证，有助于阐明花粉发育和植物雄性不育产生的分子机理，对生产上人为控制植物育性，培育优良品种具有重要的实践意义。
文档编号C12N15/10GK101255429SQ20081006058
公开日2008年9月3日 申请日期2008年3月28日 优先权日2008年3月28日
发明者叶意群, 张爱红, 张豫超, 曹家树, 鹂 黄 申请人:浙江大学