专利名称：：猪sim1基因及其作为猪生产性状的遗传标记的制作方法
技术领域：
：本发明属于猪的分子生物学领域，涉及猪SIM1(singlemindedl)基因的克隆和测序以及单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)的检测方法，特别地，涉及一种猪SIMl基因及其作为猪生产性状的遗传标记。
背景技术：
：随着人民生活水平的提高，猪肉品质已引起了生产者和消费者更大的关注，因而，肉质性状的改良也逐渐被育种工作者所重视。脂肪性状是肉质性状的一个重要指标，常用背膘厚度来表示。降低背膘厚度可以增加痩肉率，可适应消费需求，增加经济效益。通过研究与脂肪性状相关的基因，利用基因型选择来降低背膘厚度，是肉质性状改良的有效途径。SIM1(Single-minded1)基因是果蝇SIM基因的同系物，它在中枢神经系统的中线细胞系统中扮演着重要角色(Crewsetal.1988)。包括在人、鼠和斑马鱼等很多物种中SIM基因的同系物都已经成功分离获得(Emaetal.1996;Chrastetal.1997;Wenetal.2002)，人的该基因被定位于6号染色体长臂，鼠的该基因被定位于20号染色体长臂(http:〃www.informatics,jax.org/searches/homology_form.shtml)。SIM蛋白是bHLH-PAS(basichelix-loop-helix+period，arylhydrocarbonreceptor,Single-minded)转录因子家族成员之一，研究表明该家族基因编码产生碱性螺旋一环一螺旋转录子，是决定神经细胞分化的功能基因(Holderetal.2000)。在哺乳动物中，SIM1基因主要在中枢神经系统和发育的肝脏组织中表达，并且对于下丘脑视旁核(PVN)的形成至关重要。下丘脑视旁核所控制的神经内分泌细胞对机体一些生理变化的作用相当关键，例如能量平衡和血压等。SIM1敲除基因的小鼠功能缺失实验表明该基因对于下丘脑视旁核神经元的分化非常重要(Michaudetal.1998),缺少SIM1，几乎所有的下丘脑视旁核神经元的发育都将受阻并且67￥7基因突变可导致人与鼠的采食量和体脂的增加(Michaudetal.1998，MonicaCetal.2006)。相对于以上研究，开展猪SIM1基因的研究，揭示SIM1基因对猪生长，脂肪性状和肉质性状的影响具有重要意义。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种猪SIM1基因及其作为猪生产性状的遗传标记。获得猪SIM1基因(DNA)后，通过序列比较分析获得单核苷酸多态性；据此建立适宜的单核苷酸多态分型方法，为猪的生长性状、脂肪性状和肉质性状的标记辅助选择提供有用的分子标记。本发明通过以下技术方案实现一种猪SIM1基因，它具有SEQIDNo.1或SEQIDNo.2的序列。一种猪生产性状的遗传标记，它是猪SIMl基因。一种猪生产性状的遗传标记的分子标记方法，包括以下步骤(1)从猪血液中提取基因组DNA，根据人和鼠SIM1同源序列设计引物SEQIDNo.3和SEQIDNo.4;(2)进行PCR扩增获得猪SIM1基因序列SEQIDNo.1和SEQIDNo.2;(3)基于所述步骤(2)获得的猪SIM1基因序列设计引物SEQIDNo.5和SEQIDNo.6用于PCR-SSCP分型检测一碱基突变834G-834A。本发明的有益效果是本发明的基因标记可用于不同猪品种的SIM1基因多态性分析，以及研究基因与猪生长性状、脂肪性状和肉质性状的关系。图1为金华猪和大白猪SIM1基因序列比较示意图；图2为猪SIM1基因PCR-SSCP不同带型对应的SNP示意图；图3为猪SIM1同源扩增产物部分序列与人鼠SIM1外显子序列比对结果示意图。具体实施方式本发明猪SIM1基因的克隆和测序，其步骤包括选择中国地方品种血统的金华猪和外来品种大白猪作为典型试验材料，从猪的血液中提取基因组DNA，根据人和鼠SIM1基因保守区设计了两个外引物其序列，分别见序列表:SEQIDNo.3和序列表SEQIDNo.4，进行PCR扩增，PCR产物纯化和直接测序，序列比较分析，获得猪SIM1基因编码区部分DNA序列。其中金华猪和大白猪SIM1基因DNA序列，分别见序列表SEQIDNo.l和序列表SEQIDNo.2。比较金华猪和大白猪SIM1基因DNA序列见序列表SEQIDNo.1和序列表SEQIDNo.2的DNA序列，发现了SIM1基因PCR扩增产物的核苷酸834位G—A的单核苷酸多态SNP位点(如图1所示)。建立PCR-SSCP的方法检测猪SIM1基因834位G—A的多态性，根据已知猪SIM1序列见序列表SEQIDNo.1或序列表SEQIDNo.2，设计引物，其序列分别如序列表SEQIDNo.5和序列表SEQIDNo.6所示，进行PCR扩增，选取电泳带型有差异的代表个体进行PCR直接测序，由测序结果可知该SNP位点(如图2所示)。并确定不同基因型个体与生产性状间的相关关系。一、基因片段的获得及多态性检测方法的建立(1)SIMl基因序列的获得，择取中国地方品种金华猪和国外品种大白猪作为典型试验材料，采用同源扩增方法，根据人和鼠的SIM1相邻外显子区域设计引物。上游引物为SEQIDNo.3:5，-AGGAGCTTCAGGGGGAMCGCCT-3，下游引物为SEQIDNo.4:5，-ATTGGGCCCGACGTCGCATGCTC-3，PCR反应在含有50ng基因组DNA、15,1/LTris-HCl、50mmol/LKC1(pH8.0)、2mmol/LMgCl2，200Mmol/LdNTPs、引物&和10Mmol/L、1UTaqDNA聚合酶的25W反应体系中进行，反应条件是94-C预变性5min，然后进行程序为94。C变性40s，55。C复性40s，72。C延伸40s，30个循环，最后72°(3延伸7111111，4'C保存。扩增的PCR产物(896bp)被纯化后直接进行序列测定。DNA序列用DNAMAN5.2.2软件进行排列和比对，金华猪和大白猪SIM1基因DNA序列见序列表SEQIDNo.1和序列表SEQIDNo.2。用BLAST软件比较，PCR产物的序列确证PCR产物是SIM1基因，在DNA水平上与对应的人和鼠的外显子序列有很高的同源性(图3)。经过比对分析金华猪与大白猪DNA序列，在SIMl基因PCR扩增产物的核苷酸834位发现了1个碱基改变(G—A)，即SNP(图1):在猪的品种金华猪是A，而大白猪是G。(2)PCR-SSCP方法检测SIM1基因G834—834A的多态根据已知猪SIM1序列见序列表SEQIDNo.1或序列表SEQIDNo.2,设计引物上游引物为SEQIDNo.5:F2:5'-ATTGATTTGGGCCGGTTCAG-3，下游引物为SEQIDNo.6:R2:5，-ATTGGGCCCGACGTCGCATGCTC-3，PCR扩增体系50ng基因组DNA、15咖ol/LTris-HC1、50腿ol/LKCl(pH8.0)、2mmol/LMgCl2，200Mmol/LdNTPs、引物Fi和R,10Hmol/L、1UTaqDNA聚合酶的25W反应体系中进行，反应条件是94i:预变性5min，然后进行程序为9CC变性40s，55。C复性40s，72。C延伸40s,，30个循环，最后72。C延伸7min，4。C保存。PCR-SSCP分析变性反应体系12pl，其中5piPCR产物，7pl的loadingbuffer(98%甲酰氨、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、10mmol/LEDTA(pH二8.0)和2X甘油)，98。C变性10分钟，然后立即冰浴5min以上。12%PAGE胶(29:1)电泳12小时，电泳结束后银染显带，利用凝胶成像系统观察并记录。选取电泳带型有差异的代表个体进行PCR直接测序，由测序结果可知该SNP位点(图2)。二、分子标记在不同猪群中的多态分布在4个国外猪群(大白猪、长白、皮特兰、杜洛克猪)和2个中国猪群(金华猪、嘉兴黑猪)中采用PCR-SSCP分析技术进行SNP分型。检测结果如表l所示。在所检测的几个猪种中国外猪群大白猪、长白、杜洛克猪占优势的A等位基因频率分别为0.80、0.58和0.55，而中国猪群金华猪、嘉兴黑猪A等位基因频率均达到l.OO，在国外猪群皮特兰中A等位基因和B等位基因频率接近，分别为0.50。下表l为不同品种猪SIM1基因型和基因频率示意图。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>三、分子标记与生产性状的关联分析X皮特兰猪F2代作为试验材料，采用实施例2所述的PCR-SSCP方法进行了多态性扫描，并采用SAS统计软件glm程序进行单标记方差分析猪SIM1基因不同基因型与猪生产性状的相关关系，同时采用reg程序计算基因加性效应和显性效应，并进行显著性检验，所采用模型为J^尸//fC/^.十e力wiKw为性状表型值，/^j平均数，^为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用-1，0和1代表GG、AG和M基因型，显性效应用l，-l和1分别代表GG、AG和AG基因型)A、&、K为固定效应，分别代表家系、性别和年度效应，力^为屠宰体重或屠宰日龄的回归系数，胴体性状以屠宰体重为协变量，肉质性状以屠宰日龄为协变量，e^为残差效应。在所检测的337头金华猪X皮特兰猪F2代个体中，SIM1基因GG基因型观测数为43(基因型频率为O.13)，AG基因型观测数为173(基因型频率为0.51)，AA基因型观测数为121(基因型频率为0.34)。不同基因型与生产性状间的统计结果总结于表2。表2为SIM1基因型与生长、胴体及肉质性状的统计分析表示意图。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>肉色b值9.603±0.2649.431±0.1369.865±0.1590.075±0.1520.157±0.100肉色c值9.767±0.2679.610±0.13710.046±0.160-0.063±0.1460.120±0.096肉色h值卯.054±1.72990.649±0.88888.167±1.0380.595±0.918-0.779±0.605眼肌pH6.206士0.0576.184±0,0296.137±0.0340.048±0.030-0.006±0.020大腿pH6.320±0.0536.331±0.0276.275±0.0310.023±0.028-0.012±0.019眼肌温度39.046±0.23138.843±0.11838.852士0.1370.021±0.1230.080±0.081大腿温度39.476±0.18039.462±0.09339.423±0.107-0.069±0.0990.050±0.065眼肌导电率2.773±0.1602.879±0.0842，±0.108-0.080±0.0860.007±0.055大腿导电率4.244±0.2343.748±0.1233'.997士0.1580.038±0.1260.145±0.082板油重0.644±0.056b0.761±0.027ab0.827±0.039a-0.012±0.040-0.011±0.026眼肌面积37.095±0.992a35.087±0.535a31.786±0.6192.783±0.602—0.231±0.403系水力0.41.3±0.0160.410±0，0.421±0.010-0.002±0.0090.003±0.006肌内蛋白含量、23.550±0.18023.585±0細23.611±0.120-0.030±0.0970.011±0.063肌内水含量74.041±0.211a73.72l±0.107a73.217±0.1430.362±0.129—0.084±0.084肌内脂肪含量2.424±0.190b2.510±0.096b3.042±0.129a0.245±0.115"0.130±0.075注以上数值为最小二乘均值士标准误；含有相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异极显著；加性效应负值表示A等位基因降低性状表型值；*表示p〈0.05，"表示p〈0.01。由表2可以看出，SIM1基因型不同时，生长性状的初生重、断奶重、90曰龄重、120日龄重、150日龄重、平均日增重，胴体性状的头重、6~7肋背膘厚、最后肋骨背膘厚、腰荐结合处背膘厚、三点平均背膘厚、板油重、眼肌面积，肉质性状的肌内水分含量和肌内脂肪含量都纯在显著或极显著差异。并且主要以加性作用方式为主，在效应方向并不一致，A等位基因在提高了猪生长后期体重的同时降低了最后肋骨和腰荐结合处背膘厚同时提高了眼肌面积、肌内水分含量和脂肪含量。由此可见该标记对于提高猪生产性状相当适宜。序列表〈110>浙江大学〈120〉猪SIM1基因及其作为猪生产性状的遗传标记〈160>2〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉896〈212〉■〈213〉金华猪〈400〉1aggagcttcagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctg608acttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtc鄉ggggcggagcctatggaaaaacgccag120c犯cgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcc180tgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgc240tcgccgcagccgaacgaccg3gCgC3gCg3gtcagtgagcaagagcgccc300aatacgca3accgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacag360gtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtga^gttagctcactca420ttaggcaccccaggctttacatctttatgcttccggctcgtatgttgtgtgg犯ttgtg3g480cgga/taac犯tttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctatttaggtg540atactcaagctatgcatccaacgcgttgggagctctcccatatggtcgac600ctgcaggcggccgcgaattcacteigtgattattgatttgggccggttcagaagcaggttc660atttaccgtcagctgccttctgtctctccaccagttctggta犯ggggC3ggtgsccacc720aagtactaccggttcctggccaagcscggcggctgggtctgggtac卿gctacgcgacc780atcgtgcacaacagccgctcctccaggccacactgcatcgtcagcgtcEiactaagtcctc840犯atcga^ttcccgcggccgccatggcggccgggagcatgcgacgtcgggccc犯t896〈210〉2〈211〉896〈212〉腿〈213〉大白猪〈400〉2aggagcttcaggggg犯3Cgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctg60acttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatgga犯aacgccag120caacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcc180tgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgElgtg6Lgctgataccgc240tcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtc3gtgagcg鄉鄉cggaagagcgccc300aatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacag360gtttcccgactggsi犯gcgggcagtgsgcgc犯cgc幼ttaatgtgagttagctcactca420ttaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaeittgtgag480cggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctatttaggtg540acactatagaatactc犯gctatgcatccaacgcgttgggagctctcccatatggtcgac600ctgcaggcggccgcgaattcactagtgattattgatttgggccggttcag犯gcaggttc660atttaccgtcagctgccttctgtctctccaccagttctggggtgaccacc720aagtactaccggttcctggccaagcacggcggctgggtctgggtac卿gctacgcgacc780atcgtgcacaacagccgctcctccaggccacactgcatcgtcagcgtcaactaggtcctc840aaatcgaattcccgcggccgccatggcggccgggagcatgcgacgtcgggcccaat89权利要求1、一种猪SIM1基因，其特征在于，它具有SEQIDNo.1或SEQIDNo.2的序列。2、一种猪生产性状的遗传标记，其特征在于，它是权利要求1所述的猪SIMl基因。3、一种权利要求2所述的猪生产性状的遗传标记的分子标记方法，其特征在于，包括以下步骤(1)从猪血液中提取基因组DNA，根据人和鼠SIM1同源序列设计引物SEQIDNo.3和SEQIDNo.4。(2)进行PCR扩增获得猪SIMl基因序列SEQIDNo.1和SEQIDNo.2。(3)基于所述步骤(2)获得的猪SIMl基因序列设计引物SEQIDNo.5和SEQIDNo.6用于PCR-SSCP分型检测一碱基突变834G-834A。全文摘要本发明公开了一种猪SIM1基因及其作为猪生产性状的遗传标记，猪SIM1基因，具有SEQIDNo.1或SEQIDNo.2的序列，本发明的基因标记可用于不同猪品种的SIM1基因多态性分析，以及研究基因与猪生长性状、脂肪性状和肉质性状的关系。文档编号C12N15/12GK101255427SQ20081006057公开日2008年9月3日申请日期2008年3月28日优先权日2008年3月28日发明者徐宁迎,赵晓枫,郭晓令,哲陈申请人:浙江大学