一种与牙鲆数量性状相关的snp位点、其筛选方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于水产养殖中的筛选技术领域，具体设及一种与牙解数量性状相关的 SNP位点、其筛选方法及应用。
【背景技术】
[0002] 牙解（Paralichthys olivaceus)，又名偏口、左口、左偏、牙片等，隶属于蝶形目 (Pleuronectiformes)，牙解科(Bothidae)，牙解属，主要分布在俄罗斯远东地区、日本、韩 国和我国沿海，属于±著种类。它个体大，生长快，味道鲜美，深受东亚各国的青睐。
[0003] 体重、体长等数量性状一直W来都是鱼类育种的主要选育性状。肌肉生长抑制素 基因(Myostatin，MSTN)作为与肌肉生长相关的候选基因成为各种动物育种研究的热点。该 基因又称为生长分化因子-8(GDF-8),属于转化生长因子PdYansforming growth factor-e，TGF-e)家族，是肌肉细胞生长的负调控因子。1997年美国化hn化pkins大学医学院的Mc Pherron等在研究转化生长因子e(TGF-e)时，在小鼠的骨骼肌细胞中发现并首次扩增出该 基因的cDNA。研究表明，敲除MSTN基因的小鼠肌肉是正常野生型小鼠的2~3倍，且肌肉的脂 肪含量也比较低。通过转基因技术和RNAi技术抑制斑马鱼的MSTN基因发现试验鱼的肌肉明 显比正常鱼发达，因此认为该基因在动物肌肉生长发育中起重要的抑制作用，也可能参与 脂肪生成的调节。近年来的一些研究还发现鱼类的MSTN基因可W在除肌肉外的多个组织中 表达，如脑、肠、觸、肾、性腺等，还有可能影响其他组织的发育。由于MSTN在遗传育种上的潜 在应用价值，自其被发现W来，一直备受科研工作者的广泛关注，目前，已克隆得到多种鱼 类的MSTN基因，如斑马鱼、虹縛、大口黑驴、眼斑拟石首鱼、大黄鱼、加州驴、經鱼、日本牙解、 斑点叉尾綱等。人们期望通过对该基因的控制来增加肌肉产量。
[0004] 鉴于MSTN在水产养殖中潜在的应用前景，本发明对牙解鱼的MSTN基因在进行重测 序，筛查SNP，与数量性状进行关联分析，确定与数量性状相关的SNP标记，标记可用于牙解 分子标记辅助选育。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种与牙解数量性状相关的 SNP位点、其筛选方法及应用。通过候选基因关联分析法，对MSTN基因中SNP与牙解数量性状 进行关联分析，获得了一个与数量性状相关的SNP标记，所述SNP标记可用于牙解标记辅助 选育，缩短育种周期。
[0006] 本发明所采用的技术方案为：一种与牙解数量性状相关的SNP位点，所述SNP位点 位于序列为SEQ ID NO: 1的MSTN基因上，包括SNPl位点、SNP2位点和SNP3位点、其中：
[0007] SNPl位点位于所述MSTN基因第2个内含子第74化P位置，其碱基为C或T;
[000引 SNP2位点位于所述MSTN基因第3个外显子第30bp位置，其碱基为C或T;
[0009] SNP3位点位于所述MSTN基因3 ' UTR第330bp位置，其碱基为C或A。
[0010]本发明还提供了一种所述SNP位点的筛选方法，使用第一引物组和第二引物组从 所述MSTN基因中裁剪出MSTN2片段和MSTN3片段，所述SNPl位点和SNP2位点位于所述MSTN2 片段上，所述SNP3位点位于所述MSTN3片段上;所述第一引物组包括第一上游引物和第一下 游引物，所述第二引物组包括第二上游引物和第一下游引物;第一上游引物的序列如SEQ ID N0:2所示，第一下游引物的序列如SEQ ID N0:3所示，第二上游引物的序列如SEQ ID N0:4所示，第二下游引物的序列如SEQ ID N0:5所示。
[0011] 其中，SEQ ID ^:2的序列为6164414616166616〔416。
[0012] 沈Q ID 備：3的序列为4〔6(：1'押01；1'〔0：44(：1'〔4八6;
[0013] 沈Q ID 備:4的序列为〔416〔4(：176〔464461410：;
[0014] SEQ ID
[0015] 作为一种实施方式，使用第一引物组和第二引物组从所述MSTN基因中裁剪出 MSTN2片段和MSTN3片段之前，先对所述MSTN基因进行PCR扩增，在PCR扩增过程中，使用的反 应体系为：总体积为50化，DNA化L，10*buf f e巧化，Mg2+化L，dNTP化L，引物化L/条，Taq酶 0.化L，余量为水。
[0016] 在PCR扩增过程中，使用的PCR扩增程序为:在94°C溫度下预变性3min;然后进行35 个循环，其中每个循环依次包括W下步骤:在94 °C溫度下变性15s，在55°C溫度下复性15s， 在72°C溫度下延伸30s;完成35个循环之后，在72°C的溫度下延伸3min。
[0017] 本发明还提供了所述SNP位点在牙解筛选中的应用。
[0018] -种应用所述SNP位点进行牙解筛选的方法，包括W下步骤：
[0019] A、牙解筛选:根据GB/18654.3-2008中的数量性状指标为标准，筛选得到不同的牙 解，数量性状指标包括但不限于全长、体长和体高；
[0020] B、同池混养:将筛选后的牙解在同池中混养；
[0021] C、基因分型：一定的养殖周期后，对不同牙解的MSTN基因中所述SNP位点进行鉴 定，同时根据GB/18654.3-2008标准，测得不同牙解的数量性状指标；
[0022] D、对不同牙解的数量性状指标与其SNP位点的基因型进行关联分析。
[0023] 优选的，在筛选出牙解之后，将每条牙解分别经过诱导得到不同的雌核发育家系 和/或杂合克隆家系，并对每个雌核发育家系和/或杂合克隆家系进行标记;标记完成后，将 所有家系中的牙解同池混养。每个家系中所有的个体的遗传物质是相同的，后期只需要在 每个家系中选出少量或部分牙解个体进行分型测序即可，极大地减小了后期基因分型测序 的工作量;另外，同一家系中的数据能够采用取平均值的方式进行数据分析处理，增加了数 据的可靠性。
[0024] 作为一种实施方式，对每条牙解的MSTN基因进行PCR扩增后，对PCR产物使用 S化Pshot SNP分型方法对牙解的MSTN基因进行鉴定，S化Pshot SNP分型方法中所用的延伸 引物的序列如下:所述SNPl位点对应的第一延伸引物的序列如SEQ ID N0:6所示;所述SNP2 位点对应的第二延伸引物的序列如SEQ ID N0:7所示;所述SNP3位点对应的第S延伸引物 的序列如SEQ ID NO: 8所示;针对每个SNP位点的延伸体系及反应相同，延伸反应体系为:总 体积为化L，PCR产物化L，Snapshot Mix试剂化L，延伸引物0.化L，余量为水;延伸程序为:在 96 °C溫度下变性Imin,然后进行30个循环，其中每个循环依次包括W下步骤:96°C溫度下变 性10s，在52°C溫度下复性5s，在60°C溫度下延伸30s;延伸程序结束后，使用测序仪对延伸 产物进行测序。
[00巧]S化Pshot SNP分型是一种W单碱基延伸原理为基础，同时利用多重PCR对多个已 知SNP位点进行遗传分型的方法。在一个含有测序酶，四种巧光标记的ddNTP，紧挨多态位点 5'端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经测序 仪跑胶后，根据峰的颜色可知渗入的碱基种类，从而确定该样本的基因型，根据峰移动的胶 位置确定该延伸产物对应的SNP位点。
[00%]其中，SEQ ID
[0027]沈Q ID 備:7的序列为(：1'押(：口'64(：1'〔6(：1'176660：;
[002引 SEQ ID
[00巧]进一步的，所述基因分型步骤中，PCR扩增反应体系为：总体积为15化，DNA化L、 10*buffer 1.5化、1.5化、dNTP 0.3ul、引物0.3ul/条、Taq酶0.3ul、余量为水;使用的PCR扩 增程序为：在94°C溫度下预变性3min;然后进行35个循环，其中每个循环依次包括W下步 骤:在94°C溫度下变性15s，在56 °C溫度下复性15s，在72°C溫度下延伸30s;完成35个循环之 后，在72°C的溫度下延伸3min。
[0030] 所述基因分型步骤中，SNPl位点、SNP2位点和SNP2位3位点分别对应第S引物组， 第四引物组和第五引物组，所述第=引物组包括第=上游引物和第=下游引物，所述第四 引物组包括第四上游引物和第四下游引物，所述第五引物组包括第五上游引物和第五下游 引物：第S上游引物的序列如SEQ ID N0:9所示，第S下游引物的序列如SEQ ID NO: 10所 示，第四上游引物的序列如SEQ ID N0:11所示，第四下游引物的序列如SEQ ID N0:12所示， 第五上游引物的序列如SEQ ID NO: 13所示，第五下游引物的序列如SEQ ID NO: 14所示。
[0031] 其中，SEQ ID ^:9的序列为口'61667^40：4401；1'〔八6;
[0032] 沈Q ID 備：10的序列为(：1'1'口'6〔44616〔41614(：1'。
[0033] 沈Q ID ^:11的序列为押61667^40：4401；1'〔八6;
[0034] 沈Q ID 備：12的序列为(：1'1'口'6〔44616〔41614(：1'。
[0035] 沈Q ID N0:13的序列为ATGCACACATGCTGGACGTTG;
[0036] 沈Q ID ^:14的序列为4601746〔6444〔6161417八6。
[0037] 进一步的，所述基因分型步骤中，PCR循环结束后，进行纯化步骤，再将纯化后的 PCR产物进行挪aPshot SNP分型方法处理；用ExoI去除PCR产物中的剩余引物，用化StAP去 除PCR产物中剩余的dNTP。所述纯化步骤为:取3ul PCR产物用ExoI和化StAP纯化，