ID NO: 14所示。
[0084] 其中，SEQ ID ^:9的序列为口'61667^40：4401；1'〔八6;
[0085] 沈Q ID 備：10的序列为(：1'1'口'6〔44616〔41614(：1'。
[0086] 沈Q ID ^:11的序列为押616617440：4401；1'〔八6;
[0087] 沈Q ID 備：12的序列为(：1'1'口'6〔44616〔41614(：1'。
[008引 沈Q ID N0:13的序列为ATGCACACATGCTGGACGTTG;
[0089] 沈Q ID ^:14的序列为4601746〔6444〔6161417八6。
[0090] PCR循环结束后，进行纯化步骤，再将纯化后的PCR产物进行測aPshot SNP分型方 法处理；用ExoI去除PCR产物中的剩余引物，用化StAP去除PCR产物中剩余的dNTP。所述纯化 步骤为：取3ul PCR产物用ExoI和化StAP纯化，纯化反应体系为：总体积化L，PCR产物化L， ExoI 0.2化，FastAP 0.祉L,ExoI buffer 0.化L，余量为水；纯化过程为：在37°C溫度下保 持15min后，在80°C溫度下保持15min。
[0091] 对纯化后的PCR产物使用挪aPshot SNP分型方法处理，其中延伸反应体系为:总体 积为化L，PCR产物化L，Snapshot Mix试剂化L，延伸引物0.化L，余量为水;延伸程序为：在96 °C溫度下变性Imin,然后进行30个循环，其中每个循环依次包括W下步骤:96°C溫度下变性 IOs，在52°C溫度下复性5s，在60°C溫度下延伸30s ;延伸程序结束后，取Iul延伸产物，加 IOul上样HI-DI，在95°C溫度下变性3min，立即冰水浴，并使用ABI3730测序仪对延伸产物进 行测序。
[0092] D、关联分析:对不同牙解的数量性状指标与其SNP位点的基因型进行关联分析。运 用一般线性模型(GLM)中LSD方法将实施例1中所述SNP位点基因型间的体重、体长、全长、体 高等数量性状进行多重比较分析，结果如下表：
[0093] SNP位点LSD多重比较结果表
[0094]
[i
123456 注:abc不同字母表示差异显著(P<0.05)，*表示差异极显著(P<0.0 l)。 2 结果显示SNPUSNP2和SNP3与数量性状显著相关(P<0.05)。 3
[009引 SNPl位点位于所述MSTN基因第2个内含子第74化P位置，突变型为C-A，基因型AA为 优势基因型，该基因型的个体数量性状均值显著高于AC和CC型个体；SNP2位点位于所述 MSTN基因第3个外显子第30bp位置，突变型为C-T，密码子GAC-GAT，氨基酸Asp252Asp，氨基 酸位置252,为同义突变，CT为优势基因型，数量性状均值均极显著高于其它个体;SNP3位点 位于所述MSTN基因3 ' UTR第33化P位置，突变型为C-A ,AC为优势基因型。 4 试验例1 5 本试验例是实施例1中所述SNP位点的验证。 6 所述SNP位点的基因型在不同生长速度(f:生长快速家系60尾，S:生长缓慢家系60
[0103] 尾)的家系中的频率进行G-test检验。结果如下表：[0102] SNP标记基因型验证结果
[0104]
[0105] 注:f:生长快速家系；S :生长缓慢家系
[0106] 验证结果显示:优势基因型（SNPl :AA，SNP2:CT，SNP3:AC)与劣势基因型（SNPl :CC， SNP2: AA，SNP3: AA或AC)出现频率在f组和S组中存在极显著差异，并且优势型的个体数量性 状均值显著高于劣势基因型个体。
[0107] 实施例1中所述的SNP位点可用于牙解分子辅助育种中，快速选育出生长快的牙 解，缩短育种周期。
[0108] 最后所应说明的是，W上实施例仅用W说明本发明的技术方案而非限制，尽管参 照较佳实施例对本发明进行了详细说明，所应理解的是，W上所述仅为本发明的具体实施 方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 巧列泰
[0109]
[0110]
[0113]
[0114]
【主权项】
1. 一种与牙鲆数量性状相关的SNP位点，其特征在于，所述SNP位点位于序列为SEQ ID NO: 1的MSTN基因上，包括SNP1位点、SNP2位点和SNP3位点、其中： SNP1位点位于所述MSTN基因第2个内含子第741bp位置，其碱基为C或T; SNP2位点位于所述MSTN基因第3个外显子第30bp位置，其碱基为C或T; SNP3位点位于所述MSTN基因3 ' UTR第330bp位置，其碱基为C或A。2. -种权利要求1所述的SNP位点的筛选方法，其特征在于，使用第一引物组和第二引 物组从所述MSTN基因中裁剪出MSTN2片段和MSTN3片段，所述SNP1位点和SNP2位点位于所述 MSTN2片段上，所述SNP3位点位于所述MSTN3片段上;所述第一引物组包括第一上游引物和 第一下游引物，所述第二引物组包括第二上游引物和第一下游引物;第一上游引物的序列 如SEQ ID N0:2所示，第一下游引物的序列如SEQ ID N0:3所示，第二上游引物的序列如SEQ ID N0:4所示，第二下游引物的序列如SEQ ID N0:5所示。3. 根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，使用第一引物组和第二引物组从所述 MSTN基因中裁剪出MSTN2片段和MSTN3片段之前，先对所述MSTN基因进行PCR扩增，在PCR扩 增过程中，使用的反应体系为：总体积为50yL，DNA lyL，10*buffer 5yL，Mg2+5yL，dNTP lyL， 引物lyL/条，Taq酶0 · 6yL，余量为水。4. 根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，在PCR扩增过程中，使用的PCR扩增程 序为:在94°C温度下预变性3min;然后进行35个循环，其中每个循环依次包括以下步骤:在 94°C温度下变性15s，在55°C温度下复性15s，在72°C温度下延伸30s;完成35个循环之后，在 72°C的温度下延伸3min。5. 权利要求1所述的SNP位点在牙鲆筛选中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤： A、 牙鲆筛选:根据GB/18654.3-2008中的数量性状指标为标准，筛选得到不同的牙鲆， 数量性状指标包括但不限于全长、体长和体高； B、 同池混养:将筛选后的牙鲆在同池中混养； C、 基因分型：一定的养殖周期后，对不同牙鲆的MSTN基因中所述SNP位点进行鉴定，同 时根据GB/18654.3-2008标准，测得不同牙鲆的数量性状指标； D、 对不同牙鲆的数量性状指标与其SNP位点的基因型进行关联分析。7. 权利要求6所述的应用，其特征在于，在筛选出牙鲆之后，将每条牙鲆分别经过诱导 得到不同的雌核发育家系和/或杂合克隆家系，并对每个雌核发育家系和/或杂合克隆家系 进行荧光标记;标记完成后，将所有家系中的牙鲆同池混养。8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述基因分型步骤中，对每条牙鲆的MSTN 基因进行PCR扩增后，对PCR产物使用SNaPshot SNP分型方法对牙鲆的MSTN基因进行鉴定， SNaPshot SNP分型方法中所用的延伸引物的序列如下:所述SNP1位点对应的第一延伸引物 的序列如SEQ ID N0:6所示；所述SNP2位点对应的第二延伸引物的序列如SEQ ID N0:7所 示;所述SNP3位点对应的第三延伸引物的序列如SEQ ID NO: 8所示;针对每个SNP位点的延 伸体系及反应相同，延伸反应体系为：总体积为6yL，PCR产物2yL，SnapshotMix试剂lyL，延 伸引物0.3yL，余量为水;延伸程序为:在96 °C温度下变性lmin，然后进行30个循环，其中每 个循环依次包括以下步骤:96°C温度下变性10s，在52°C温度下复性5s，在60°C温度下延伸 30s;延伸程序结束后，使用测序仪对延伸产物进行测序。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述基因分型步骤中，PCR扩增反应体系 为：总体积为 15yL，DNA lyL、10*buffer 1.5yL、Mg2+1.5yL、dNTP 0.3ul、引物0.3ul/条、Taq 酶0.3ul、余量为水;使用的PCR扩增程序为:在94 °C温度下预变性3min;然后进行35个循环， 其中每个循环依次包括以下步骤:在94°C温度下变性15s，在56 °C温度下复性15s，在72°C温 度下延伸30s;完成35个循环之后，在72 °C的温度下延伸3min。10. 根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述基因分型步骤中，PCR循环结束 后，进行纯化步骤，再将纯化后的PCR产物进行SNaPshot SNP分型方法处理;所述纯化步骤 为：取3ul PCR产物用ΕχοΙ和FastAP纯化，纯化反应体系为：总体积7yL，PCR产物3yL，ExoI 0.2yL，FastAP 0.8yL，ExoI buffer 0.7yL，余量为水；纯化过程为：在37°C温度下保持 15min后，在80°C温度下保持15min。
【专利摘要】本发明提供了一种与牙鲆数量性状相关的SNP位点、其筛选方法及应用。通过候选基因关联分析法，对MSTN基因中SNP与牙鲆数量性状进行关联分析，获得了一个与数量性状相关的SNP标记，所述SNP标记可用于牙鲆标记辅助选育，缩短育种周期。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105713974
【申请号】CN201610172234
【发明人】张晓彦, 王桂兴, 侯吉伦, 王玉芬, 刘海金, 于清海, 杨立更
【申请人】中国水产科学研究院北戴河中心实验站
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2016年3月24日