鉴定西瓜籽粒大小的InDel分子标记及其引物和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体设及一种鉴定西瓜巧粒大小的InDel分子标记 及其引物和应用。
【背景技术】
[0002] 西瓜的第一用途是鲜食，果肉是食用部分，巧粒偏大影响食用，消费者喜欢无巧或 是巧粒较小的西瓜，因此小粒品种是栽培西瓜的育种目标之一。西瓜的另一用途是巧用，种 子是巧用西瓜主要的产品。研究表明，巧用西瓜种子是优质的蛋白质和植物油资源，并含有 丰富的维生素 D，因此，大粒品种是巧用西瓜的主要育种目标。在资源捜集和数据采集的过 程中，本发明人发现大粒的通常是野生西瓜、黏巧西瓜和地方品种，品质较差;小粒多为普 通栽培西瓜，品质较好，不同品种间种子巧粒大小差异明显，因此巧粒大小也是西瓜的一个 主要分类性状。
[0003] 国内外西瓜巧粒大小的研究主要集中在对控制种子大小、千粒重的基因进行传统 的遗传分析。Weetman (1937)和尚建立等(2015)的研究表明粒重倾向于单基因控制的质量 性状。张杨（2013)和周延峰（2014)的研究均表明粒重都是受一对主基因控制。Pool等 (1941)发现了 1和S运一对控制种子长短的等位基因，Kensler等（1958)和化imotsuma等 (1963)的研究也证实了运一结果。然而，Tanaka等（1995)发现了控制小粒的基因 Ti，与1和S 为非等位基因。Zhang等（1996)的研究表明tomato西瓜种子由单隐性基因 ts控制。虽然采用 的试验材料与方法不同，所得结论也不完全一致，但运些研究有一些共同点，都认为种子大 小属于质量性状，小粒种子显性于大粒种子，且由单基因控制。另一方面，奮文强等（1995) W粒重具有显著差异的两个西瓜高代自交系为亲本研究杂交后代的粒重，西瓜种子千粒重 表现为数量性状遗传的特点。Prothro等(2012)利用重组自交系和F2群体研究巧粒大小，表 明粒重是典型的数量性状。
[0004] 传统的遗传学采用数理统计的方法，只能将控制质量/数量性状的一个或多个基 因作为一个整体进行研究，不能确定单个质量/数量性状基因在染色体上位置及效应(徐云 碧，1992)。随着分子标记技术发展和分子数量遗传学的完善，使得鉴定复杂数量性状的遗 传位点（Q化)成为可能。但是由于西瓜基础研究的相对滞后，西瓜WL定位研究较少，而设及 巧粒大小的则更少。范敏等(2000)利用F2群体定位了影响种子千粒重的6个QTL，与之连锁 的多为同工酶等生化标记。Hawkins等(2001)利用单因素分析的方法检测到与粒长和粒宽 连锁的RAro分子标记。易克(2002)利用重组自交系群体(RILs)定位了一个效应较低的千粒 重QTL，其侧翼的分子标记是AFLP标记。随着西瓜基因组测序的完成，Prothro等（2012)利 用两个西瓜群体在6号染色体上都检测到了一个巧粒大小主效QTL，其侧翼的分子标记皆为 SNP 标记，分别为 NW0251236(5.80Mb)、NW0250242(6.44MbWPNW0248118(5.04Mb)、 NW0248583(6.41)。利用不同的遗传背景（egusi西瓜），Meru和McGregor(2013)在6号染色 体也检测到了巧粒大小主效QTL(最近的遗传标记为NW0250854,对应的物理位置为 4.58Mb)。运些基于测序产生的SNP标记不能直接用于分子标记辅助选择，即使可W转化为 可用的标记（比如CAPS/dCAPS)，检测过程需要酶切，成本较高，步骤繁琐。而基于全基因组 重测序的插入/缺失(InDel)标记为共显性标记，检测容易，成本低廉，但尚存在一些不如意 之处，如变异较少、稳定性不够等。
【发明内容】
[0005] 针对W上问题，本发明通过WL初定位在6号连锁群定位到了千粒重的主效QTL，并 结合亲本重测序制备到与西瓜巧粒大小紧密连锁的InDel分子标记，并设计了其引物，在西 瓜巧粒大小育种中进行了应用，可为鉴定西瓜巧粒大小提供新手段，加速西瓜巧粒大小性 状的改良进程，提高育种的准确性和选择效率。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下： 设计一种鉴定西瓜巧粒大小的InDel分子标记InDell4_S6,其核巧酸长度为46bp，序列 为： TAGCAAGAGCGTTACTACTTCAACTAAAAATATCCATTTCATTTTAo
[0007] 上述InDel分子标记的引物，包括W下的核巧酸序列： InDel14_S6F:TGGTTGTTTCTTTTAGGTGGTA; InDel14_S6R:AGCGATTATGAGCAATTTTA。
[000引上述InDe 1分子标记的筛选方法，包括W下步骤： (1) 利用母本"ZXG0147沪（大粒)和父本"14CB1T (小粒)杂交的F2群体构建高密度的遗 传连锁图谱，并对父母本、Fi和F2群体的单株进行千粒重表型鉴定； (2) 结合遗传连锁图谱和粒重表型鉴定结果，利用WinQTL cartographer 2.5 software 化t1:p: //s1:atgen. ncsu. edu/qtlcart/WQl'lXai't. htm)进行QTL初定位，在LG6鉴 定到一个千粒重的主效QTUTSW6)，其LOD峰值为46.94,解释26.16%的表型变异，置信区间 (2-L0D)为3.68~31.67 cM，对应的物理位置为6号染色体的1.57~6.46Mb。
[0009] (3)结合两个亲本的重测序，在WL置信区间发现23个插入缺失片段大于35bp的 InDels,共设计了 18对InDel引物。
[0010] (4巧Ij用对应的InDel引物在父母本、Fi进行多态性筛选，然后利用多态性的InDel 引物在F2群体中进行基因型鉴定； 巧)把F2群体的93个单株按千粒重进行大粒和小粒的分类，把千粒重性状归为一个形 态学标记TSW6,加上InDel分子标记的基因型鉴定结果与LG6上的其它SNP标记利用 化inMap4.0进行图谱构建，发现千粒重形态学标记TSW6位于主效QTL TSW6的置信区间，并 且是WL峰值的位置，其中一对新开发的引物，InDel 14_S6与TSW6的连锁程度最为紧密，两 者的遗传距离仅为1.0 cM。
[0011] 利用上述技术措施，最终获得了与西瓜巧粒大小紧密连锁的插入缺失标记 InDell4_S6，其对应的西瓜参考基因组物理图谱的位置为6号染色体的5478024bp，序列为： TAGCAAGAGCGTTACTACTTCAACTAAAAATATCCATTTCATTTTA，其引物序列为， InDel14_S6F：TGGTTGTTTCTTTTAGGTGGTA； InDel14_S6R:AGCGATTATGAGCAATTTTA。
[0012] 上述鉴定西瓜巧粒大小的InDel分子标记在西瓜巧粒大小育种中的应用方法，包 括如下步骤： (I)对F2和RIL群体利用所述分子标记InDell4_S6进行基因型鉴定。
[OOK] (2)利用上述（1)中RIL和F2群体的基因型鉴定结果，根据分子标记InDell4_S6的 基因型对不同单株进行分类，并利用千粒重表型数据进行鉴定和验证。
[0014]本发明具有W下积极有益效果： 1.本发明InDel分子标记变异稳定、检测容易，不需要酶切等繁琐的步骤，并且成本低 廉，提高了西瓜巧粒大小育种的选择效率和准确率，从而加快育种进程。
[001引2.本发明标记与目标QTL紧密连锁，遗传距离仅为1. OcM,加快了西瓜巧粒大小基 因的克隆和功能验证。
[0016] 3.本发明在综合考量DNA序列的保守区、二级结构形成、G+C含量、碱基随机分布、 长度等众多因素的基础之上，并经过必要的修饰及大量的试验验证，最终设计并筛选出了 特异性和高灵敏性的InDel标记的引物，其具有高度特异性、敏感性好等特点。
【附图说明】
[0017] 图1 F2群体高密度的遗传连锁图谱。
[001引图2 F2群体的千粒重频率分布图。
[0019] 图3开发InDel标记加入图谱前后分析； A:千粒重WL扫描;B:千粒重作为形态学标记(TSW6)的连锁分析;C:分子标记InDe 114_ S6的连锁分析。
[0020] 图4利用分子标记InDell4_S6的引物在部分F2群体基因组DNA中的扩增结果；父 母本方框中条带为目的条带；名称皆为品种名称\代号的后两/=位。
[0021] 图5利用分子标记InDell4_S6的引物在部分RIL群体基因组DNA中的扩增结果;父 母本方框中条带为目的条带；名称皆为品种名称\代号的后两/=位。
【具体实施方式】
[0022] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合具体实施例，对本 发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并不用于 限定本发明。W下实施例中所设及的原料，如无特别说明均为市售，所设及检测方法如无特 别说明，则均为常规方法。
[0023] 实施例1 鉴定西瓜巧粒大小InDel分子标记的开发方法，具体步骤如下： (1)西瓜千粒重全基因组OTL初定位 利用母本"ZXG0147沪（大粒)和父本"14CB1T (小粒)杂交获得的F2群体已经构建了高 密度的遗传连锁图谱(见图1)，并对父母本、Fi和F2群体的93个单株进行千粒重表型鉴定;结 合遗传连锁图谱和F2群体表型鉴定结果（图2)，利用WinQ^ cartographer 2.5 software 化 ttp: //statgen. ncsu. edu/qtlcai't/WQl'lXai't. htm)进行 QTL 初定位，在 LG6 连锁群鉴定到 一个千粒重主效QTUTSW6)，其LOD峰值为46.94，解释26.16%的表型变异，置信区间（2-L0D) 为3.68~31.67 CM,对应的物理位置为6号染色体的1.57~6.46Mb (图3A)。
[0024] (2)父母本的重测序 利用母本巧(60147沪（大粒)和父本"14CB1T (小粒)进行了22x深度的高通量重测序。 两个亲本共检测到45134个小的InDel。
[0025] (3)9化区域InDel标记的开发 在OTL定位的置信区间发现23个插入缺失片段大于35bp的InDels。利用化rl自编程序 提取插入缺失相应位置前后各5(K)bp的序列，共设计18对对应的InDel引物。
[00%] 实施例2