鸡胡须性状的基因型快速鉴定方法与流程

本发明涉及分子生物学及遗传育种领域，具体地说，涉及鸡胡须性状的基因型快速鉴定方法。
背景技术：
：中国是世界上家禽遗传资源最丰富的国家之一，家鸡的羽毛和性状特征多样性丰富，常被作为某些品种的特征性状。鸡的胡须是一种在脸颊两侧以及颔下着生的延长生长的羽毛类型。在我国地方鸡种中，惠阳胡须鸡、北京油鸡、丝羽乌骨鸡等均具有胡须性状。惠阳胡须鸡为我国地方优良肉用型品种，又被称为三黄胡须鸡、惠州鸡、龙门鸡、龙岗鸡等，额下呈发达而张开的胡须状房羽(国家畜禽遗传资源委员会组编.中国畜禽遗传资源志地方品种图册.北京：中国农业出版社，2015.2)。惠阳胡须鸡体质结实，胸肌发达，以肉嫩骨细，皮脆味鲜与三黄胡须的外貌驰名中外。鸡的胡须性状同鸡的玫瑰冠、豆冠、复冠、丝羽、缕头、翻毛以及裸颈等性状一样，都可直接在外部表型鉴来定品种和用于育种工作。胡须性状的研究开始于上个世纪初，研究人员通过杂交实验确定胡须是一种常染色体不完全显性遗传的性状(Davenport,C.B.1906.Inheritanceinpoultry.Washington,DC:CarnegieInstitutionPublication,1906；Serebrovsky,A.S.,Petrov,S.G.1930.Onthecompositionoftheplanofthechromosomesofthedomesticshen.J.Exp.Biol.Russia6:157-179.)。然而鸡胡须性状在基因组上的准确定位和解析最近才报道(Guo,Y.,etal.,AComplexStructuralVariationonChromosome27LeadstotheEctopicExpressionofHOXB8andtheMuffsandBeardPhenotypeinChickens.PLoSGenet,2016.12(6):p.e1006071；郭影.鸡胡须性状的基因定位及功能研究,2016,中国农业大学博士学位论文)。该研究采用全基因组关联分析(Genome-wideassociationstudy,GWAS)、连锁分析(Linkageanalysis)、同源一致性(Identitybydescent,IBD)分析、比较基因组杂交芯片(Arraycomparativegenomichybridization,arrayCGH)、全基因组重测序和表达分析等技术手段来研究引起胡须性状的致因基因。研究结果表明胡须性状是由27号染色体上复杂结构变异(Structuralvariation,SV)导致，此结构变异由位于27号染色体上1.7Mb、3.5Mb以及4.4Mb位置的3个拷贝数变异(Copynumbervariation,CNV)组成。3个CNV以CNV3、CNV2和CNV1的顺序串联在一起，并插入CNV1的下游(图1)。该结果在其他鸡胡须鸡群体中(包括北京油鸡，扬州胡须鸡，波兰矮脚鸡，DutchOwl等)验证与胡须性状完全关联。此复杂结构变异区间内共包含七个注释基因，对七个基因在胡须发育的不同阶段基因的表达情况进行检测，结果表明HOXBB基因在下颌皮肤組织中连续的异位高表达，强烈表明其在胡须性状发育过程中具有重要作用。由于鸡胡须性状是由常染色体上一个显性遗传基因控制的，从表型上无法区分纯合型胡须基因个体(Mb/Mb)和杂合性胡须基因个体(Mb/mb)，只能通过测交的方式判定，为胡须性状的选择带来不便。鸡胡须基因(Mb)的定位与鉴定为鸡胡须这一性状的研究和生产应用提供了基础条件。Guo等(2016)报道了一个鉴定胡须基因型的方法，是利用胡须基因复杂结构中重复的CNV1中出现了一个碱基突变(C→T)，建立了一种基于焦磷酸测序的基因分型方法。然而该方法实验过程较多，且需要昂贵的焦磷酸测序仪，在实际应用中不易推广应用。技术实现要素：本发明的目的是提供一种鸡胡须性状的基因型快速鉴定方法。本发明根据鸡胡须基因在基因组上存在CNV的拷贝数位置变化，用常规PCR、电泳技术和PCR产物条带亮度识别直接鉴定基因型，开发了一种简单、快速、准确鉴定鸡胡须基因的分型方法。为了实现本发明目的，本发明基于胡须基因结构中3个拷贝数变异(CNV1、CNV2和CNV3)在基因组上位置与非胡须鸡不同，提供用于鉴别鸡胡须性状基因型的PCR引物组合，包括：正向引物F1：5'-TGGTTGTGTGCCAAGTAGAG-3'(SEQIDNO.1)；正向引物F2：5'-GCTCTTGCTCTTTTTGGTAA-3'(SEQIDNO.2)；以及反向引物R：5'-CTTTTCGTACTGCGTTGTTA-3'(SEQIDNO.3)。本发明还提供含有上述引物组合的用于鉴别鸡胡须性状基因型的试剂盒。本发明还提供鸡胡须性状的基因型快速鉴定方法，包括以下步骤：1)提取待测鸡的基因组DNA；2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用上述引物组合，进行PCR扩增反应；3)分析PCR产物。利用电泳技术对PCR产物进行电泳；然后用ImageJ软件分析电泳胶图，计算每个泳道中条带的亮度及其比值，从而判定待测鸡的基因型。其中，所述正向引物F1与所述反向引物R组成一对引物，扩增胡须基因207bp序列；所述正向引物F2与所述反向引物R组成一对引物，扩增非胡须基因296bp序列。PCR反应体系以20μl计为：PCR反应条件为：95℃5分钟；95℃30秒，53℃30秒，72℃20秒，共27个循环；72℃7分钟。步骤3)分析PCR产物的方法如下：将PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭染色，凝胶成像系统中观察PCR扩增条带，并拍照。用ImageJ软件分析电泳胶图，计算每个泳道中296bp条带和207bp条带的亮度值，并计算207bp条带亮度值与296bp条带亮度值的比值P；P值在0.7-0.9之间判定为胡须鸡基因纯合子，P值在0.2-0.5之间判定为胡须鸡杂合子；P值为0，只扩增出296bp条带，则判定为非胡须鸡个体。本发明所述胡须鸡包括惠阳胡须鸡、北京油鸡、丝羽乌骨鸡等。非胡须鸡包括白来航鸡等。本发明还提供与鸡胡须性状相关的特异性分子标记，所述分子标记是位于鸡27号染色体上CNV1下游(新增的CNV3与CNV2结合处，图2)，大小为207bp的DNA片段，用于扩增所述分子标记的引物如SEQIDNO.1和3所示。对207bp大小的扩增产物进行测序，通过DNAMAN软件比对，确认其与CNV3与CNV2结合处的碱基序列一致(图3)。本发明还提供所述特异性分子标记在鉴定胡须鸡品种中的应用。本发明进一步提供所述特异性分子标记在鸡分子标记辅助育种中的应用。本发明提供了一种鸡胡须基因的基因型分子鉴定方法及应用，即采用聚合酶链式反应(PCR)和电泳技术来检测具有鸡胡须基因的纯合型、杂合型以及非胡须鸡，根据PCR产物胶图的条带数以及条带亮度进行鸡胡须性状基因型的快速鉴定，可加快选育具有胡须特征鸡种的育种进程，缩短胡须鸡育种时间。附图说明图1为Readdepth分析确定胡须鸡27号染色体存在的CNV及其重排方式。图2为本发明实施例2中鸡胡须基因分型引物扩增位置。图3为本发明鸡胡须基因207bp大小的扩增产物测序峰图及所在位置。图4为本发明实施例2中鸡胡须基因鉴定PCR产物电泳结果。图5为本发明实施例2中ImageJ软件计算PCR产物条带亮度示意图。图6为本发明实施例3中鸡胡须基因鉴定PCR产物电泳结果。图7为本发明实施例4中引物的灵敏度分析结果。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1测交鉴定胡须鸡的基因型及其遗传规律来自广东金种农牧科技股份有限公司惠阳胡须鸡国家级保种场的10只胡须鸡公鸡与中国农业大学实验牧场的150只白来航母鸡(均为非胡须鸡)，按照1只公鸡配15只母鸡的方式组建10个家系进行人工授精，每只母鸡收集10～15枚种蛋，共计约1800枚种蛋进行孵化。孵化出雏后的F1代鸡全部育雏，并饲养至9周龄，观察胡须性状，按照家系统计(表1)。除7号和9号胡须鸡公鸡与白来航鸡杂交F1代鸡有胡须和无胡须鸡个体接近1:1外，其他8只胡须鸡公鸡与白来航鸡的杂交F1代鸡全部具有胡须性状。表1胡须鸡与白来航鸡杂交F1代胡须性状统计公鸡家系号有胡须无胡须112602145031420415505113061490743468113095858101150测交试验结果说明，鸡胡须性状由单基因控制，胡须性状对非胡须性状表现完全显性，除7号和9号公鸡是胡须基因杂合型外，其他8只均为胡须基因纯合型。实施例2鸡胡须基因的基因型鉴定方法的建立1、引物设计：根据鸡胡须性状基因复杂结构的3个拷贝数变异(CNV1、CNV2和CNV3)在基因组上分布的位置，分别下载鸡基因组CNV3后端600bp序列、CNV2前端上游600bp序列和CNV2前端600bp序列。采用PrimerPremier5软件分别设计3条引物：正向引物F1：5'-TGGTTGTGTGCCAAGTAGAG-3'，正向引物F2：5'-GCTCTTGCTCTTTTTGGTAA-3'，反向引物R：5'-CTTTTCGTACTGCGTTGTTA-3'。引物设计构思如下：本发明考虑到用最少的引物来鉴定鸡胡须基因型。引物设计原则是引物结合区段序列保守、3条引物的预测退火温度接近、3条引物构成的2个扩增产物长度200-400bp之间且长度相差可以通过电泳明显区别。另外，综合考虑引物GC含量、产物二聚体、发卡结构、引物末端连续碱基、正反引物退火温度等因素，最终通过优化比较确定以上3条引物。3条引物在胡须鸡和非胡须鸡基因组DNA有A和B两个扩增子(图2)，A扩增子长度207bp，B扩增子长度296bp。在非胡须鸡中，只有B扩增子，产物长度296bp。设计好的引物由生物工程公司合成，并稀释至浓度10μmol/L。2、试验动物：采集实施例1中经过测交确定的2只胡须基因纯合型个体、2只胡须基因杂合型个体和2只白来航鸡(非胡须鸡)血液。3、DNA提取：用DNA提取试剂盒提取鸡血液样品基因组DNA，采用NanoDrop2000超微量分光光度计测定DNA浓度，并用ddH2O稀释至60～100μg/ml，作为PCR扩增的模板。4、PCR扩增条件优化：(1)退火温度的优化以6个胡须鸡和非胡须鸡的基因组DNA混合样为模板，PCR体系为20μl，其中2×PCRMix用量10μl，基因组DNA模板1μl，10μmol/L正向引物F10.5μL、10μmol/L正向引物F20.5μL、10μmol/L反向引物R1μL，最后用ddH2O补充至20μL，混匀，即得PCR扩增反应体系。PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，49-58℃范围内设置8个梯度变化的退火温度30s，72℃延伸20s，36个循环；72℃延伸7min；得到梯度PCR产物。PCR产物用2％的琼脂糖胶电泳，结果显示，8个退火温度条件下均得到207bp和296bp两个PCR产物条带，引物条带均整齐、清晰、无杂带，说明本发明的3条引物多重PCR退火温度范围较宽，本发明选择中间的梯度温度53℃作为3条引物的优化退火温度。(2)PCR循环数的优化以6个已知胡须基因基因型个体的DNA作为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为20μL，其中2×PCRMix用量10μl，基因组DNA1μl，10μmol/L正向引物F10.5μL、10μmol/L正向引物F20.5μL、10μmol/L反向引物R1μL，最后用ddH2O补充至20μL，混匀，即得PCR扩增反应体系。PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸20s，25～35个循环；72℃延伸7min；即得到PCR产物。分别以25、27、29、31、33、35个循环进行6次PCR扩增。以浓度为2％的琼脂糖凝胶对以上不同循环数PCR产物进行电泳，上样量为8μL。观察电泳结果，非胡须鸡只有1个296bp的条带；纯合型和杂合型胡须鸡个体均有296bp和207bp2条带。选择在296bp条带亮度一致的情况下，纯合型个体207bp条带比杂合型207bp条带更亮的胶图(图4)，作为优化的PCR循环数。试验结果发现，在27个循环的PCR条件下，能够从207bp的条带亮度鉴定胡须基因的纯合型与杂合型的差别，最终确定PCR的优化循环数为27。5、电泳条带亮度分析：应用ImageJ软件打开图4的图片文件，分析每个泳道中PCR产物条带的亮度，通过识别条带的峰面积计算亮度值(图5)。然后计算207bp与296bp条带的亮度的比值P(表2)，确定胡须基因纯合型和杂合型的P值范围。经分析，确定纯合型个体的P值大于等于0.7，杂合型个体的P值小于0.5。表2PCR产物条带亮度量化值基因型样品号296bp条带亮度207bp条带亮度P值非胡须157.3-0非胡须255.3-0胡须基因杂合型3142.253.40.38胡须基因杂合型4114.949.50.43胡须基因纯合型596.377.00.80胡须基因纯合型6103.778.20.75实施例3鸡胡须基因的基因型鉴定方法的验证从中国农业大学实习牧场中的纯种惠阳胡须鸡、胡须鸡与白来航鸡杂交F1代、纯种白来航鸡群体中采集7个胡须基因纯合型个体、7个胡须基因杂合型个体和6个非胡须鸡个体，共计20个个体的血液样品。所有血样隐去基因型信息，随机编号。按照实施例2建立的方法进行DNA提取、PCR产物获得、琼脂糖凝胶电泳、电泳条带亮度分析，电泳结果见图6，条带亮度识别及比值见表3。泳道4、6、10、13、14、18中只有一条296bp的条带，直接判定为非胡须鸡。泳道1、2、3、15、16、17、19中有296bp和207bp2个条带，且2个条带的亮度差别不大，P值均大于等于0.7，因此判定为胡须基因纯合型。泳道5、7、8、9、11、12、20中有296bp和207bp2个条带，且明显可见207bp条带亮度比296bp条带亮度低，P值均小于0.5，因此判定为胡须基因杂合型。表3待测个体PCR产物条带亮度量化值及基因型判定样品号296bp条带亮度207bp条带亮度P值基因型1135.2118.90.88胡须基因纯合型2142.7116.30.82胡须基因纯合型3159.1126.80.80胡须基因纯合型4284.3－0非胡须基因5167.869.10.41胡须基因杂合型6365.5－0非胡须基因7166.360.00.36胡须基因杂合型8137.758.80.43胡须基因杂合型9183.574.90.41胡须基因杂合型10363.9－0非胡须基因11114.245.60.40胡须基因杂合型12127.349.10.39胡须基因杂合型13297.0－0非胡须基因14228.9－0非胡须基因15149.3106.70.71胡须基因纯合型16146.3106.30.73胡须基因纯合型17205.4143.80.70胡须基因纯合型18222.4－0非胡须基因19182.2140.20.77胡须基因纯合型2068.124.70.36胡须基因杂合型结果可见，条带亮度的肉眼设别和软件识别判定胡须基因的基因型完全一致，与隐去的实际基因型比较发现，判定准确率达100％。本发明仅利用3条引物进行单次普通的多重PCR反应，就能成功地鉴定胡须鸡的纯合子、杂合子以及非胡须鸡，方法简单、快速且准确，非常实用于胡须鸡外貌性状的选育和提纯。具体优点如下：(1)本发明涉及的鸡胡须性状基因的基因型分子鉴定，能鉴定表型相同情况下纯合型和杂合型个体，有效增加选种的准确性；(2)本发明涉及的分子鉴定不受胡须鸡的年龄、性别等限制，可以用于胡须性状的早期选育，缩短世代间隔，加快胡须鸡的育种进程；(3)检测方法简单、快速、准确。实施例4引物的灵敏度检测实验分别选取非胡须鸡、胡须鸡杂合子以及胡须鸡纯合子各1只，提取基因组DNA，将其DNA浓度分别稀释成100μg/mL、50μg/mL、20μg/mL和10μg/mL，PCR反应的扩增程序和扩增产物检测的方法同实施例2和3，PCR扩增27个循环。扩增反应结束后，用2％的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测，结果如图7所示。1-4泳道分别代表PCR反应中DNA浓度依次为100μg/mL、50μg/mL、20μg/mL和10μg/mL，可以看出各基因型中在1和2泳道上产物条带间的明暗程度最为明显，而在3和4泳道上虽然可以看到PCR产物条带，但条带亮度不够，不适宜通过明暗程度区别PCR产物量，给胡须基因的纯合型和杂合型的鉴别带来较大误差。从图7来看，尽管DNA浓度范围在20-100μg/mL都能够扩增出特征条带，且3条引物PCR扩增所需的DNA模板浓度范围较宽，可将最低限固定在20μg/mL。但是结合本发明最大的特色，依靠条带间的明暗程度来鉴定胡须鸡的纯合型和杂合型，也便于ImageJ软件亮度值的计算，因此最终将50-100μg/mL的DNA浓度作为本发明PCR反应的模板浓度。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页1 2 3