大豆抗病性数量性状基因座及其组成的鉴定方法与流程

本申请是以下申请的分案申请：申请日：2007年5月24日；申请号：200780027839.2(pct/us2007/012363)；发明名称：同上。相关申请的交叉引用本申请要求2006年5月25日申请的美国临时申请顺序号60/808,430的优先权的权益。序列表的引用序列表存放在文件名为“pa_53517.txt”的文件中，该文件具有65,000字节(按ms-windows统计)，创建于2007年5月22日，存放在与本文一起提交的计算机可读形式的磁盘中并通过引用结合到本文中。发明领域本发明涉及植物育种和抗病性领域。更具体地讲，本发明涉及含有与抗病性有关的数量性状基因座的大豆属(glycine)植物的筛选方法和抗病大豆属植物的育种方法。植物病害可由真菌、病毒、细菌或无脊椎动物引起。本发明还涉及在真菌病原体豆薯层锈菌(phakopsorapachyrhizi)抗性育种程序中将含有赋予抗病性的数量性状基因座(qtl)的保藏(accession)种质渐渗入优良种质中的用途。发明背景栽培大豆(glycinemax(l.)merril)，是一种全球种植的作为植物油和植物蛋白主要来源的重要经济作物(sinclair和backman，compendiumofsoybeandiseases(大豆病害概要),第三版，apspress,st.paul,mn,第106页，(1989))。对低胆固醇和高纤维饮食不断增长的需求也增加了大豆作为健康食品的重要性。在美国，每年由于病害使得大豆产量减少。提高每公顷的产量对于农民的利润率十分重要，尤其在大豆价格低迷的时期。对于农村经济和城区关联产业经济，大豆病害引起的财务损失都非常大。这些损失的影响最终都将在全球大豆市场上反映出来。在美国和加拿大安大略省，估计由病害引起的损失每年都不相同，并且因病害不同而不同。自1999年到2002年，在美国估计大豆产量损失的范围在800万公吨至1000万公吨，在安大略省为90,000-166,000公吨(wrather等，在线，planthealthprogressdoi:10:1094/php-2003-0325-01-rv)。在东半球和西半球均有亚洲大豆锈病(asiansoybeanrust，本文称为asr)的报道。在东半球，已经报道了asr的有澳大利亚、中国、印度、日本、台湾地区和泰国。在西半球，已经观察到asr的有巴西、哥伦比亚、哥斯达黎加和波多黎各。asr可以是破坏性病害，据台湾报道在某些田间引起的产量损失高达70-80％。被严重感染的植物品质较差，豆荚较少，种子较小(frederick等，mycology92:217-227(2002))。1994年首次在美国夏威夷发现asr。asr稍后在2004年夏季传到美国内陆，据推测是热带风暴活动的结果。模型预测法表明，asr已广泛扩散到整个美国东南部，田间和实验室随后的观察结果证实了这种分布状况。两种真菌——豆薯层锈菌(phakopsorapachyrhizisydow)和山水蛭层锈菌(phakopsorameibomiae(arthur)arthur)引起asr。与其它锈病不同，豆薯层锈菌(p.pachyrhizi)和山水蛭层锈菌(p.meibomiae)感染植物品种的范围极其广泛。已知豆薯层锈菌自然感染豆科植物17个属中的31个种，在控制条件下感染其余26个属中的60个种。山水蛭层锈菌自然感染豆科植物19个属中的42个种，并已人工感染了其余12个属中的额外18个种。19个属中的24个植物品种是这两个菌种的宿主(frederick等，mycology92:217-227(2002)))。已经鉴定出大豆植物的asr抗性。已分别在pi200492、pi230970、pi462312(ankur)和pi459025b中鉴定出4个抗豆薯层锈菌的独立遗传的显性小种专化qtl，本文称为asr抗性基因座1(asrresistancelocus1)、asr抗性基因座2、asr抗性基因座3和asr抗性基因座4。这些品系以及其余7个品系疑似含有asr抗性的qtl。在台湾亚洲蔬菜研究开发中心(asianvegetableresearchanddevelopmentcenter)，pi239871a和pi239871b(野生大豆(g.soja))、pi230971和pi459024b和栽培种taitakaohsiung-5、tainung-4和wayne已被用作区别种(differentials)鉴定出9个小种。最重要的小种与3个以上区别种相容，这就表明一些小种已经对已知和疑似抗性基因具有多个毒力因子。澳大利亚野生大豆中也产生了抗性。还证实了减速抗性(rate-reducingresistance)。然而，难以对这一抗性类型进行评价，因为锈病发展的速度依赖于大豆发育和成熟(sinclair等主编，soybeanrustworkshop.collegeofagricultural,consumer,andenvironmentalsciences.natl.soybeanres.lab.publ.1(1996))。评价可能含有赋予asr抗性的qtl的植物可能是耗时的，并且需要大量具备生物防范作用的空间。培养豆薯层锈菌需要使用经批准的生物防范操作台(biologicalcontainmenthood)。此外，栽培用于asr抗性试验的植物的温室和生长室必须按防止意外释放出生物的方式建造，尤其是在尚未观察到所述生物的地区。不同的豆薯层锈菌培养物可具有不同的毒力因子。随着时间推移，新的豆薯层锈菌菌株有可能传入美国。因此，设计培育大豆抗asr抗性的任何育种程序都必需能够快速应对豆薯层锈菌种群的变化。同样，用在其它地理位置的大豆作物育种除提供该区域农民喜欢的农艺性状以外，还需要选择影响该区域的特定菌株的抗性。因此，非常需要用于筛选抗asr种质的快速、省时和有成本效益的高通量方法。这种方法不仅必须提供速度和效率，而且还必须能够用最少的空地量进行，便于在同一时间筛选多个样品。本发明提供用于包含抗病性qtl的大豆植物的筛选和选择方法。发明概述本发明提供一种用于测定大豆植物对病害的抗性、免疫性或易感性的方法，该方法包括：(a)由大豆植物中剥离出植物组织；(b)将所述组织在培养基中进行培养；(c)将所述组织暴露在植物病原体中；和(d)对所述组织由该病原体所引起的病害的抗性、免疫性或易感性进行评价。此外，可通过以下步骤评价植物对病原体的反应：(e)从所述植物中分离出核酸(dna和/或rna)；(f)测定所述核酸(dna、rna和/或cdna)存在的与所述抗性、免疫性或易感性相关的数量性状基因座的一个或多个分子标记；和(g)选出所述植物用于育种程序。植物对特定病原体的抗性、免疫性或易感性的测定法对本领域任何技术人员而言是显而易见的。植物组织可以是叶、维管组织、花、豆荚、根、茎、种子或它们的组成部分，或者是由组织分离出来的细胞。将所述组织暴露在植物病原体中可通过选自以下的方法来完成：(a)将病原体直接用到组织中；(b)培养基中含有病原体；和(c)包含将被病原体有效污染的物质接种到组织中。植物病原体可以是真菌、病毒、细菌或无脊椎动物。植物病原体暴露可以病原体大分子、细胞、组织、整个生物或其组合的形式，其中病原体及其组成部分或是有生命的或是死的，只要该材料在宿主组织中介导免疫应答。本发明的相关病原体大分子包括但不限于毒素、细胞壁、细胞膜、抗原和多糖。本发明还包括赋予针对真菌病原体的抗病性的qtl，所述真菌病原体选自豆薯层锈菌(phakopsorapachyrhizi)、山水蛭层锈菌(phakopsorameibomiae)(亚洲大豆锈病)、平头刺盘孢(colletotrichumtruncatum)、束状刺盘孢平头变种(colletotrichumdematiumvar.truncatum)、大豆小丛壳(glomerellaglycines)(大豆炭疽病)、大豆疫霉菌(phytophthorasojae)(疫霉根茎腐病)、核盘菌(sclerotiniasclerotiorum)(核盘菌茎腐病)、大豆腐皮镰孢(fusariumsolanif.sp.glycines)(猝死综合征)、镰孢(fusariumspp.)(镰孢根腐病)、菜豆壳球孢(macrophominaphaseolina)(炭腐病)、大豆壳针孢(septoriaglycines)(褐斑病)、瓜果腐霉(pythiumaphanidermatum)、德巴利腐霉(pythiumdebaryanum)、畸雌腐霉(pythiumirregulare)、终极腐霉(pythiumultimum)、群结腐霉(pythiummyriotylum)、簇囊腐霉(pythiumtorulosum)(腐霉种子腐病)、菜豆间座壳大豆变种(diaporthephaseolorumvar.sojae)(豆荚枯病)、phomopsislongicola(茎枯病)、拟茎点霉(phomopsisspp.)(拟茎点霉种子腐病)、东北霜霉(peronosporamanshurica)(霜霉病)、立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)(丝核菌根茎腐病，丝核菌地上部分枯萎病)、大豆茎褐腐病菌(phialophoragregata)(茎褐腐病)、大豆北方茎溃疡病菌(diaporthephaseolorumvar.caulivora)(茎溃疡病(stemcanker))、菊池尾孢(cercosporakikuchii)(种子紫斑病(purpleseedstain))、链格孢(alternariasp.)(黑斑病(targetspot))、大豆尾孢(cercosporasojina)(蛙眼病(frogeyeleafspot))、齐整小核菌(sclerotiumrolfsii)(白绢病)、arkoolanigra(黑色叶斑病)、根串珠霉(thielaviopsisbasicola)(黑色根腐病)、漏斗笄霉(choanephorainfundibulifera)、三孢笄霉(choanephoratrispora)(笄霉叶枯病)、三叶草小光壳(leptosphaerulinatrifolii)(小光壳叶斑病)、mycoleptodiscusterrestris(mycoleptodiscus根腐病)、侵菅新赤壳(neocosmosporavasinfecta)(新赤壳茎腐病)、大豆生叶点霉(phyllostictasojicola)(叶点霉叶斑病)、大豆棘壳孢(pyrenochaetaglycines)(棘壳孢叶斑病)、cylindrocladiumcrotalariae(红色颈腐病(redcrownrot))、dactuliochaetaglycines(红色叶斑枯病)、大豆痂圆孢(spacelomaglycines)(疮痂病)、匍柄霉(stemphyliumbotryosum)(匍柄霉叶枯病)、山扁豆生棒孢(corynesporacassiicola)(黑斑病)、榛针孢酵母(nematosporacoryli)(酵母斑点病(yeastspot))和多主瘤梗孢(phymatotrichumomnivorum)(棉根腐病)。本发明还包括赋予针对病毒病原体的抗病性的qtl，所述病毒病原体选自苜蓿花叶病毒属(alfamovirus)(苜蓿花叶病毒(alfafamosaicvirus，amv))、豇豆花叶病毒属(comovirus)(菜豆荚斑驳病毒(beanpodmottlevirus，bpmv))、马铃薯y病毒属(potyvirus)(菜豆黄色花叶病毒(beanyellowmosaicvirus，bymv))、雀麦花叶病毒属(bromovirus)(豇豆褪绿斑驳病毒(cowpeachloroticmottlevirus，ccmv))、菜豆金色花叶病毒属(begomovirus)(绿豆黄色花叶病毒(mungbeanyellowmosaicvirus，mymv))、马铃薯y病毒属(花生斑驳病毒(peanutmottlevirus，pemov))、马铃薯y病毒属(花生条纹病毒(peanutstripevirus，pstv))、黄瓜花叶病毒属(cucumovirus)(花生矮化病毒((peanutstuntvirus，psv))、花椰菜花叶病毒属(caulimovirus)(大豆褪绿斑驳病毒(soybeanchloroticmottlevirus，sbcmv))、菜豆金色花叶病毒属(大豆皱叶病毒(soybeancrinkleleafvirus，sclv))、黄矮病毒属(luteovirus)(大豆矮缩病毒(soybeandwarfvirus，sbdv))、马铃薯y病毒属(大豆花叶病毒(soybeanmosaicvirus，smv))、线虫传多面体病毒属(nepovirus)(大豆极度矮化病毒(soybeanseverestuntvirus，sssv))和线虫传多面体病毒属(烟草环斑病毒(tobaccoringspotvirus，trsv))。本发明还包括赋予针对细菌病原体的抗病性的qtl，所述细菌病原体选自枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)(芽孢杆菌种子腐病)、萨氏假单胞菌大豆致病变种(pseudomonassavastonoipv.glycinea)(细菌疫病)、丁香假单胞菌丁香亚种(pseudomonassyringaesubsp.syringae)(细菌皱叶病)、地毯草黄单胞菌大豆致病变种(xanthomonasaxonopodispv.glycines)(细菌斑疹病)、萎蔫短小杆菌萎蔫致病变种(curtobacteriumflaccumfacienspv.flaccumfaciens)(细菌褐斑病)、萎蔫短小杆菌萎蔫致病变种(curtobacteriumflaccumfacienspv.flaccumfaciens)、茄科罗尔斯通氏菌(ralstoniasolanacearum)(桑青枯病)和丁香假单胞菌烟草致病变种(pseudomonassyringaepv.tabaci)(野火病)。本发明还包括赋予针对无脊椎动物病原体的抗病性的qtl，所述无脊椎动物病原体选自大豆蚜(aphisglycines)、大豆胞囊线虫(heteroderaglycines)、花生根结线虫(meloidogynearenari)、北方根结线虫(meloidogynehapla)、南方根结线虫(meloidogyneincognita)、爪哇根结线虫(meloidogynejavanica)(根结线虫)、哥伦比亚纽带线虫(hoplolaimuscolumbus)、帽状纽带线虫(hoplolaimusgaleatus)、大针纽带线虫(hoplolaimusmagnistylus)(纽带线虫(lancenematode))、短体线虫(pratylenchusspp.)(根斑线虫(lesionnematode))、突出针线虫(paratylenchusprojectus)、细尾针线虫(paratylenchustenuicaudatus)(针线虫)、肾形小盘旋线虫(rotylenchulusreniformis)(肾形线虫(reniformnematode))、装饰小环线虫(criconemellaornata)(环线虫)、鞘线虫(hemicycliophoraspp.)(鞘线虫(sheathnematode))、螺旋线虫(heliocotylenchusspp.)(螺旋线虫(spiralnematode))、细小刺线虫(belonolainusgracilis)、长尾刺线虫(belonolainuslongicaudatus)(刺线虫(stingnematode))、五沟线虫(quinisulciusacutus)、矮化线虫(tylenchorhynchusspp.)(矮化线虫(stuntnematode))和短小拟毛刺线虫(paratrichodorusminor)(毛刺线虫(stubbyrootnematode))。本发明还提供筛选出来的对以下病原体有抗性的大豆组织和植物：豆薯层锈菌、山水蛭层锈菌(亚洲大豆锈病)、平头刺盘孢、束状刺盘孢平头变种、大豆小丛壳(大豆炭疽病)、大豆疫霉菌(疫霉根茎腐病)、核盘菌(核盘菌茎腐病)、大豆腐皮镰孢(猝死综合征)、镰孢(镰孢根腐病)、菜豆壳球孢(炭腐病)、大豆壳针孢、(褐斑病)、瓜果腐霉、德巴利腐霉、畸雌腐霉、终极腐霉、群结腐霉、簇囊腐霉(腐霉种子腐病)、菜豆间座壳大豆变种(豆荚枯病)、phomopsislongicola(茎枯病)、拟茎点霉(拟茎点霉种子腐病)、东北霜霉(霜霉病)、立枯丝核菌(丝核菌根茎腐病，丝核菌地上部分枯萎病)、大豆茎褐腐病菌(茎褐腐病)、大豆北方茎溃疡病菌(茎溃疡病)、菊池尾孢(种子紫斑病)、链格孢(黑斑病)、大豆尾孢(蛙眼病)、齐整小核菌(白绢病)、arkoolanigra(黑色叶斑病)、根串珠霉、(黑色根腐病)、漏斗笄霉、三孢笄霉(笄霉叶枯病)、三叶草小光壳(小光壳叶斑病)、mycoleptodiscusterrestris(mycoleptodiscus根腐病)、侵菅新赤壳(新赤壳茎腐病)、大豆生叶点霉(叶点霉叶斑病)、大豆棘壳孢(棘壳孢叶斑病)、cylindrocladiumcrotalariae(红色颈腐病)、dactuliochaetaglycines(红色叶斑枯病)、大豆痂圆孢(疮痂病)、匍柄霉(匍柄霉叶枯病)、山扁豆生棒孢(黑斑病)、榛针孢酵母(酵母斑点病)、多主瘤梗孢(棉根腐病)、苜蓿花叶病毒属(苜蓿花叶病毒，amv)、豇豆花叶病毒属(菜豆荚斑驳病毒，bpmv)、马铃薯y病毒属(菜豆黄色花叶病毒，bymv)、雀麦花叶病毒属(豇豆褪绿斑驳病毒，ccmv)、菜豆金色花叶病毒属(绿豆黄色花叶病毒，mymv)、马铃薯y病毒属(花生斑驳病毒，pemov)、马铃薯y病毒属(花生条纹病毒，pstv)、黄瓜花叶病毒属(花生矮化病毒，psv)、花椰菜花叶病毒属(大豆褪绿斑驳病毒，sbcmv)、菜豆金色花叶病毒属(大豆皱叶病毒，sclv)、黄矮病毒属(大豆矮缩病毒，sbdv)、马铃薯y病毒属(大豆花叶病毒，smv)、线虫传多面体病毒属(大豆极度矮化病毒，sssv)、线虫传多面体病毒属(烟草环斑病毒，trsv)、枯草芽孢杆菌(芽孢杆菌种子腐病)、萨氏假单胞菌大豆致病变种(细菌疫病)、丁香假单胞菌丁香亚种(细菌皱叶病)、地毯草黄单胞菌大豆致病变种(细菌斑疹病)、萎蔫短小杆菌萎蔫致病变种(细菌褐斑病)、萎蔫短小杆菌萎蔫致病变种、茄科罗尔斯通氏菌(桑青枯病)、丁香假单胞菌烟草致病变种(野火病)、大豆蚜、大豆胞囊线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫(根结线虫)、哥伦比亚纽带线虫、帽状纽带线虫、大针纽带线虫(纽带线虫)、短体线虫(根斑线虫)、突出针线虫、细尾针线虫(针线虫)、肾形小盘旋线虫(肾形线虫)、装饰小环线虫(环线虫)、鞘线虫、螺旋线虫、细小刺线虫、长尾刺线虫(刺线虫)、五沟线虫、矮化线虫或短小拟毛刺线虫(毛刺线虫)。本发明还提供选自大豆属成员的精选植物，更尤其选自glycinearenaria、glycineargyrea、glycinecanescens、澎湖大豆(glycineclandestine)、glycinecurvata、glycinecyrtoloba、glycinefalcate、glycinelatifolia、glycinelatrobeana、栽培大豆(glycinemax)、glycinemicrophylla、glycinepescadrensis、glycinepindanica、glycinerubiginosa、野生大豆(glycinesoja)、大豆(glycinesp.)、glycinestenophita、烟豆(glycinetabacina)和短绒野大豆(glycinetomentella)。本发明还提供用于选择方法的培养基，该培养基中含有未处理水、蒸馏水或去离子水。培养基可含有维持病原体或植物组织的任何必需成分，只要该成分不干扰qtl所赋予的抗性的表达。本发明还提供采用所述方法选出的大豆植物。本发明还提供选自以下基因座的qtl：疫霉(根腐病)感染耐受性基因座、大豆腐皮镰孢(猝死综合征)抗性基因座、大豆尾孢(蛙眼病)抗性基因座、大豆茎褐腐病菌(phialophoragegata)(茎褐腐病)抗性基因座、核盘菌(茎腐病)抗性基因座、asr抗性基因座1、asr抗性基因座2、asr抗性基因座3、asr抗性基因座4、asr抗性基因座5、asr抗性基因座6、asr抗性基因座7、asr抗性基因座8、asr抗性基因座9、asr抗性基因座10、asr抗性基因座11、asr抗性基因座12和asr抗性基因座13。本发明还提供筛选出来的含有一个或多个真菌病抗性qtl的植物，其中包括asr抗性基因座1、asr抗性基因座2、asr抗性基因座3、asr抗性基因座4、asr抗性基因座5、asr抗性基因座6、asr抗性基因座7、asr抗性基因座8、asr抗性基因座9、asr抗性基因座10、asr抗性基因座11、asr抗性基因座12和asr抗性基因座13。本发明还提供用于asr抗性基因座1的一个或多个单核苷酸多态性(snp)标记基因座，其中所述snp标记选自ns0093250、ns0119710、ns0103004、ns0099454、ns0102630、ns0102915、ns0102913、ns0123728、ns0129943、ns0102168、ns0092723、ns0098177、ns0127343和ns0101121。还提供了用于asr抗性基因座3的一个或多个snp标记基因座，其中所述snp标记选自ns0099746、ns0123747、ns0126598、ns0128378、ns0096829、ns0125408、ns0098902、ns0099529、ns0097798、ns0137477、ns0095322、ns0136101和ns0098982。本发明提供用于asr抗性基因座5、asr抗性基因座6、asr抗性基因座7、asr抗性基因座8和asr抗性基因座9的示例性的snp标记基因座ns0103033。本发明提供用于asr抗性基因座10、asr抗性基因座11、asr抗性基因座12和asr抗性基因座13的另一个示例性snp标记基因座ns0124935。此外，作图在距所述标记分子10厘摩以内的一个或多个标记可用于asr抗性基因座的选择和渐渗。本发明还提供用于大豆asr抗性选择和渐渗的方法，该方法包括：(a)从大量大豆植物中分离出核酸；(b)检测所述分离的核酸中存在的与asr抗性基因座1-13有关的一个或多个标记分子(其中所述标记分子选自seqidno:67-99)，以及作图在距所述标记分子10厘摩以内的任何一种标记分子；和(c)选出包含所述一个或多个标记分子的大豆植物，从而选出asr抗性大豆植物。本发明还提供采用所述方法筛选出来的大豆植物。发明详述本发明提供大豆植物对真菌病的抗性、免疫性或易感性的筛选方法。在一个优选的实施方案中，植物选自大豆属。野生多年生大豆属于大豆亚属(subgenusglycine)，具有广泛的遗传多样性。栽培大豆(glycinemax(l.)merr.)及其野生一年生祖先(野生大豆(glycinesoja(sieb.和zucc.)))属于黄豆亚属(subgenussoja)，含有2n＝40条染色体，是杂交亲和的，通常生长成茁壮可育的f1杂种，携带相似的基因组。栽培大豆品种和野生多年生大豆品种之间可进行杂交，杂交是否成功在各保藏品种之间有所不同。研究表明，若干野生多年生大豆保藏品种具有褐斑病、大豆锈病、根腐病、黄色花叶病毒和白粉病抗性。在全球的保藏种质中，有100,000多个栽培大豆保藏品种，大概不到10,000个野生大豆保藏品种，大约3500个多年生大豆保藏品种。尚不知确切数目。主要的大豆保藏物保存在澳大利亚、巴西、中国、德国、印度、印尼、日本、俄罗斯、南韩和美国。许多其它较少但重要的保藏物遍及亚洲和欧洲。不知道在保藏物中有多少许多保藏品种是重复的。美国农业部大豆种质保藏中心(usdasoybeangermplasmcollection)是亚洲以外最大的保藏中心(verma等，主编，soybean:genetics,molecularbiologyandbiotechnology(1996))。目前保藏了20,765个品种，由19个品种保藏物组成，包括18,680个栽培大豆保藏品种和1,166个野生大豆及多年生大豆保藏品种。在一个优选的实施方案中，对大豆植物对病害的抗性、免疫性或易感性进行了测定，包括：(a)由大豆植物分离出植物组织；(b)将所述组织在培养基中进行培养；(c)将所述组织暴露在植物病原体中；和(d)评价所述组织对该病原体所引起的病害的抗性、免疫性或易感性。此外，可通过以下步骤评价植物对病原体的反应：(e)从所述植物中分离出核酸；(f)测定所述核酸存在的与所述抗性、免疫性或易感性相关的数量性状基因座的一个或多个分子标记；和(g)选出用于育种程序的所述植物。植物对特定病原体的抗性、免疫性或易感性的测定法对本领域任何技术人员而言是显而易见的。植物组织可以是叶、维管组织、花、豆荚、根、茎、种子或它们的组成部分，或者是由组织分离出来的细胞。将所述组织暴露在植物病原体中可通过选自以下的方法来完成：(a)将病原体直接用到组织中；(b)培养基中含有病原体；和(c)将包含被病原体有效污染的物质接种到组织中。植物病原体可以是真菌、病毒、细菌或无脊椎动物。植物病原体暴露可以是病原体大分子、细胞、组织、整个生物或其组合的形式，其中病原体及其组成部分或是有生命的或是死的，只要该材料在宿主组织中介导免疫应答。本发明的相关病原体大分子包括但不限于毒素、细胞壁、细胞膜、抗原和多糖。在一个优选的实施方案中，叶组织可包含子叶、具一小叶的叶片、具三叶的叶片和先出叶。大豆叶有四种类型：1)第一对单片子叶(simplecotyledons或seedleaves)，2)第二对单片初生叶，亦称具一小叶的叶片，3)具三叶的营养叶，和4)先出叶，这是类似叶的植物部分。具一小叶的叶片生长在子叶以上的第一节上。其它所有叶都是具三叶的叶片，其中在具一小叶的叶片之后萌发的第一对便是第一具三叶的叶片，其后则萌发第二具三叶的叶片，然后是第三具三叶的叶片(h.r.boerma和j.e.specht(主编.)soybeanmonograph,第三版,am.soc.agron.,madison,wi(2004))。在一个优选的实施方案中，本发明能够测定大豆植物对真菌病的抗性、免疫性或易感性。由真菌引起的大豆病害包括但不限于豆薯层锈菌、山水蛭层锈菌(亚洲大豆锈病)、平头刺盘孢、束状刺盘孢平头变种、大豆小丛壳(大豆炭疽病)、大豆疫霉菌(疫霉根茎腐病)、核盘菌(核盘菌茎腐病)、大豆腐皮镰孢(猝死综合征)、镰孢(镰孢根腐病)、菜豆壳球孢(炭腐病)、大豆壳针孢(褐斑病)、瓜果腐霉、德巴利腐霉、畸雌腐霉、终极腐霉、群结腐霉、簇囊腐霉(腐霉种子腐病)、菜豆间座壳大豆变种(豆荚枯病)、phomopsislongicola(茎枯病)、拟茎点霉(拟茎点霉种子腐病)、东北霜霉(霜霉病)、立枯丝核菌(丝核菌根茎腐病，丝核菌地上部分枯萎病)、大豆茎褐腐病菌(茎褐腐病)、大豆北方茎溃疡病菌(茎溃疡病)、菊池尾孢(种子紫斑病)、链格孢(黑斑病)、大豆尾孢(蛙眼病)、齐整小核菌(白绢病)、arkoolanigra(黑色叶斑病)、根串珠霉、(黑色根腐病)、漏斗笄霉、三孢笄霉(笄霉叶枯病)、三叶草小光壳(小光壳叶斑病)、mycoleptodiscusterrestris(mycoleptodiscus根腐病)、侵菅新赤壳(新赤壳茎腐病)、大豆生叶点霉(叶点霉叶斑病)、大豆棘壳孢(棘壳孢叶斑病)、cylindrocladiumcrotalariae(红色颈腐病)、dactuliochaetaglycines(红色叶斑枯病)、大豆痂圆孢(疮痂病)、匍柄霉(匍柄霉叶枯病)、山扁豆生棒孢(黑斑病)、榛针孢酵母(酵母斑点病)和多主瘤梗孢(棉根腐病)。在一个优选的实施方案中，本发明能够测定大豆植物对病毒病的抗性、免疫性或易感性。病毒引起的大豆病害包括但不限于苜蓿花叶病毒属(苜蓿花叶病毒，amv)、豇豆花叶病毒属(菜豆荚斑驳病毒，bpmv)、马铃薯y病毒属(菜豆黄色花叶病毒，bymv)、雀麦花叶病毒属(豇豆褪绿斑驳病毒，ccmv)、菜豆金色花叶病毒属(绿豆黄色花叶病毒，mymv)、马铃薯y病毒属(花生斑驳病毒，pemov)、马铃薯y病毒属(花生条纹病毒，pstv)、黄瓜花叶病毒属(花生矮化病毒，psv)、花椰菜花叶病毒属(大豆褪绿斑驳病毒，sbcmv)、菜豆金色花叶病毒属(大豆皱叶病毒，sclv)、黄矮病毒属(大豆矮缩病毒，sbdv)、马铃薯y病毒属(大豆花叶病毒，smv)、线虫传多面体病毒属(大豆极度矮化病毒，sssv)和线虫传多面体病毒属(烟草环斑病毒，trsv)。在一个优选的实施方案中，本发明能够测定大豆植物对细菌病的抗性、免疫性或易感性。由细菌引起的大豆病害包括但不限于枯草芽孢杆菌(芽孢杆菌种子腐病)、萨氏假单胞菌大豆致病变种(细菌疫病)、丁香假单胞菌丁香亚种(细菌皱叶病)、地毯草黄单胞菌大豆致病变种(细菌斑疹病)、萎蔫短小杆菌萎蔫致病变种(细菌褐斑病)、萎蔫短小杆菌萎蔫致病变种、茄科罗尔斯通氏菌(桑青枯病)和丁香假单胞菌烟草致病变种(野火病)。在一个优选的实施方案中，本发明能够测定大豆植物对有害动物病害的抗性、免疫性或易感性。由有害动物引起的大豆病害包括但不限于大豆蚜、大豆胞囊线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫(根结线虫)、哥伦比亚纽带线虫、帽状纽带线虫、大针纽带线虫(纽带线虫)、短体线虫(根斑线虫)、突出针线虫、细尾针线虫(针线虫)、肾形小盘旋线虫(肾形线虫)、装饰小环线虫(环线虫)、鞘线虫、螺旋线虫、细小刺线虫、长尾刺线虫(刺线虫)、五沟线虫、矮化线虫和短小拟毛刺线虫(毛刺线虫)。本发明还提供大豆抗病性的qtl的选择和渐渗的方法，该方法包括：(a)从大量大豆植物中分离出核酸；(b)检测所述分离的核酸中存在的与抗病性qtl有关的一个或多个标记分子；和(c)选出包含所述一个或多个标记分子的大豆植物，从而选出抗病大豆植物。可将本发明的抗病性qtl导入优良的大豆品系。“优良系”是由优良农艺性能育种和选择所产生的任何品系。优良系的实例是农民或大豆育种人员可从商业途径获得的品系，例如hartztm变种h4994、hartztm变种h5218、hartztm变种h5350、hartztm变种h5545、hartztm变种h5050、hartztm变种h5454、hartztm变种h5233、hartztm变种h5488、hartztm变种hla572、hartztm变种h6200、hartztm变种h6104、hartztm变种h6255、hartztm变种h6586、hartztm变种h6191、hartztm变种h7440、hartztm变种h4452roundupreadytm、hartztm变种h4994roundupreadytm、hartztm变种h4988roundupreadytm、hartztm变种h5000roundupreadytm、hartztm变种h5147roundupreadytm、hartztm变种h5247roundupreadytm、hartztm变种h5350roundupreadytm、hartztm变种h5545roundupreadytm、hartztm变种h5855roundupreadytm、hartztm变种h5088roundupreadytm、hartztm变种h5164roundupreadytm、hartztm变种h5361roundupreadytm、hartztm变种h5566roundupreadytm、hartztm变种h5181roundupreadytm、hartztm变种h5889roundupreadytm、hartztm变种h5999roundupreadytm、hartztm变种h6013roundupreadytm、hartztm变种h6255roundupreadytm、hartztm变种h6454roundupreadytm、hartztm变种h6686roundupreadytm、hartztm变种h7152roundupreadytm、hartztm变种h7550roundupreadytm、hartztm变种h8001roundupreadytm(hartzseed,stuttgart,arkansas,usa)；a0868、ag0202、ag0401、ag0803、ag0901、a1553、a1900、ag1502、ag1702、ag1901、a1923、a2069、ag2101、ag2201、ag2205、a2247、ag2301、a2304、a2396、ag2401、ag2501、a2506、a2553、ag2701、ag2702、ag2703、a2704、a2833、a2869、ag2901、ag2902、ag2905、ag3001、ag3002、ag3101、a3204、a3237、a3244、ag3301、ag3302、ag3006、ag3203、a3404、a3469、ag3502、ag3503、ag3505、ag3305、ag3602、ag3802、ag3905、ag3906、ag4102、ag4201、ag4403、ag4502、ag4603、ag4801、ag4902、ag4903、ag5301、ag5501、ag5605、ag5903、ag5905、a3559、ag3601、ag3701、ag3704、ag3750、a3834、ag3901、a3904、a4045ag4301、a4341、ag4401、ag4404、ag4501、ag4503、ag4601、ag4602、a4604、ag4702、ag4703、ag4901、a4922、ag5401、a5547、ag5602、ag5702、a5704、ag5801、ag5901、a5944、a5959、ag6101、ajw2600c0r、fpg26932、qr4459和qp4544(asgrowseeds,desmoines,iowa,usa)；dkb26-52、dkb28-51、dkb32-52、dkb08-51、dkb09-53、dkb10-52、dkb18-51、dkb26-53、dkb29-51、dkb42-51、dkb35-51dkb34-51、dkb36-52、dkb37-51、dkb38-52、dkb46-51、dkb54-52和dekalb变种cx445(dekalb,illinois,usa)；91b91、92b24、92b37、92b63、92b71、92b74、92b75、92b91、93b01、93b11、93b26、93b34、93b35、93b41、93b45、93b51、93b53、93b66、93b81、93b82、93b84、94b01、94b32、94b53、94m80rr、94m50rr、95b71、95b95、95m81rr、95m50rr、95m30rr、9306、9294、93m50、93m93、94b73、94b74、94m41、94m70、94m90、95b32、95b42、95b43和9344(pioneerhi-bredinternational,johnston,iowa,usa)；ssc-251rr、ssc-273cnrr、agra5429rr、ssc-314rr、ssc-315rr、ssc-311sts、s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ssouri,usa)；1493rr、1991nrr、2217rr、2301nrr、2319rr、2321nrr、2341nrr、2531nrr、2541nrr、2574rr、2659rr、2663rr、2665nrr、2671nrr、2678rr、2685rr、2765nrr、2782nrr、2788nrr、2791nrr、3410rr、3411nrr、3419nrr、3421nrr、3425nrr、3453nrr、3461nrr、3470crr、3471nrr、3473nrr、3475rr、3479nrr、3491nrr、3499nrr、wx134、wx137、wx177和wx300(wilkenseeds,pontiac,illinois,usa)。优良植物是来自优良系的代表性植物。本发明的抗病性qtl还可被导入含有以下一个或多个基因的优良大豆转基因植物中：除草剂耐受性、增产、昆虫防治、真菌病抗性、病毒抗性、线虫抗性、细菌病抗性、支原体病抗性、改进油产量、高产油、高产蛋白质、萌发和幼苗生长控制、增加动物和人类营养、低棉子糖、环境胁迫抗性、提高可消化性、工业用酶、药物蛋白、肽和小分子、改进加工性状、改善口味、固氮作用、杂种制种、降低变应原性、生物聚合物和生物燃料，等等。可通过植物生物工程学的方法作为大豆的转基因来提供这些农艺性状。还要了解的是，本发明的大豆植物可具有任何成熟群体的特性。选定大豆植物的花粉可深低温冷藏，用于与其它成熟群体的优良系杂交以将抗真菌病基因座渐渗入天然杂交不可能正常获得的品系中。花粉深低温冷藏技术是本领域众所周知的(tyagi等，cryoletters，24：119-124(2003)，liang等，actabotanicasinica，35：733-738(1993)和honda等，euphytica126：315-320(2002))。qtl的抗病作用可根据亲本基因型和测定抗病作用的环境条件而改变。这都在植物育种领域技术人员掌握之中，并且无需过多实验即可采用本文所述方法，从植物种群或者从亲本基因型保藏物中选出当含有病害基因座时能导致相对于亲本基因型抗病性提高的基因型的植物。本文中，植物病害可由真菌、病毒、细菌或无脊椎动物引起。已经报道了大豆的多种分子遗传学图(mansur等，cropsci.36:1327-1336(1996)；shoemaker等，genetics144:329-338(1996)；shoemaker等，cropscience32:1091-1098(1992)；shoemaker等，cropscience35:436-446(1995)；tinley等，j.cellbiochem.增刊14e:291(1990)；cregan等，cropscience39:1464-1490(1999))。栽培大豆、野生大豆和栽培大豆x.野生大豆共享连锁群(shoemaker等，genetics144:329-338(1996))。如本文所用，当提及栽培大豆的连锁群g、c2、j和n时是指对应于栽培大豆的遗传学图连锁群g、c2、j和n的连锁群(mansur等，cropscience.36:1327-1336(1996)；cregan等，cropscience39:1464-1490(1999)和美国农业部农业研究服务机构(agriculturalresearchservice,unitedstatesdepartmentofagriculture)的大豆数据库)。qtl的等位基因当然可包含多基因或者甚至在邻接基因组区(contiguousgenomicregion)或连锁群内的其它遗传因子，例如单元型。因此，本文所使用的qtl的等位基因可包含不止一个基因或其它遗传因子，其中各个单独的基因或遗传成分能够显示出等位变异，且其中每个基因或遗传因子还能够引起所述数量性状的表型效应。在本发明的一个实施方案中，qtl的等位基因包含也能够表现出等位变异的一个或多个基因或其它遗传因子。因此，所用术语“qtl的等位基因”并不排除包含不止一个基因或其它遗传因子的qtl。准确地讲，本发明的“qtl的等位基因”可指其中表型可以是抗病性的单元型窗(haplotypewindow)的单元型。单元型窗是可界定范围并可被追踪到的邻接基因组区，具有一组一个或多个多态性标记，其中所述多态性通过世代表明特性。所述单元型窗内的单元型可通过每个标记等位基因的独特指纹来限定。本文所使用的等位基因是占据染色体指定基因座的若干可选择形式的基因。如果在染色体指定基因座上存在的所有等位基因都相同，则植物在该基因座上是纯合的。如果在染色体指定基因座上存在的等位基因不相同，则该植物在该基因座上是杂合的。本发明的植物可以是育种程序的一部分或由育种程序产生。育种方法的选择取决于植物繁殖的方式、待改进性状的遗传力和商用栽培种的类型(例如f1杂种栽培种、纯系栽培种等)。栽培种是有意产生或选出的并且通过栽培维持的植物的小种或变种。用于本发明植物育种的精选的非限制性方法参见下文。可采用任何杂交子代的标记辅助选择(mas)来改进育种程序。还要了解的是，任何商业化和非商业化栽培种都可用于育种程序。例如，苗势、营养生长势(vegetativevigor)、胁迫耐受性、抗病性、抽条、开花、结实、种子大小、种子容重、抗倒伏性(standability)和脱粒性等因素通常决定了选择。对于高度可遗传性状，在单一地点评出的备选的优良个体植物可能是有效的，然而对于遗传力低的性状，应根据从有关植物家系重复评价所得到的平均值来进行选择。通行的选择方法常常包括系谱选择、改进的系谱选择、混合选择和轮回选择。在一个优选的实施方案中，采取回交或轮回育种程序。遗传的复杂性影响育种方法的选择。回交育种可用于将一个或少数几个高度可遗传性状的有利基因转移到所需要的栽培种内。这一方法已被广泛用于培育抗病栽培种。各种轮回选择技术被用来改进由多个基因控制的数量遗传性状。自花传粉农作物中轮回选择的应用取决于是否易于传粉、每个传粉事件成功杂交的频率和每个成功杂交的杂种子代数。可对育种系进行两代或更多代的检验，并在代表商业化目标区域的环境中与适当标准进行比较。最佳品系是用于新的商业化栽培种的候选品系；性状上仍有缺陷的品系则可用作亲本以产生用于进一步选择的新种群。鉴定优良植物的一种方法是观察该植物相对于其它实验植物和广泛栽培的标准栽培种的特性。如果单次观察没有结果，则重复观察可更好地估计其遗传价值。育种人员可以选择两个或多个亲本系并使之杂交，随后进行重复自交和选择，以产生多种新的遗传组合。新的大豆栽培种的开发需要开发和选择大豆变种，使这些变种杂交并选出优良杂种进行杂交。通过所选出的雄性可育亲本之间的手工杂交或采用雄性不育系统来产生杂交种子。选出杂种的某些表明种子的确是杂种的单一基因性状，例如豆荚色、花色、种子产量、茸毛色或除草剂抗性。亲本系的其它数据以及杂种表型都影响育种人员决定是否继续特定的杂种杂交。可以采用系谱育种和轮回选择育种方法来开发育种群体的栽培种。育种程序将得自两个或多个栽培种或者各种广泛来源的所需性状合并到育种库(breedingpool)，从中通过自交并选出所需表型从而开发出栽培种。可对新的栽培种进行评价以确定哪一个具有商业潜力。通常采用系谱育种以改进自花传粉农作物。使具有有利互补性状的两个亲本杂交以产生f1。f2种群通过一个或数个f1自交而产生。选出最佳家系中的最佳个体进行选择。可从f4代开始对家系进行重复检验以改进具有低遗传力的性状的选择效率。在育种的深入阶段(即f6和f7)，检验最佳品系或表型上相似的品系的混合品系作为新的栽培种予以推广的可能性。回交育种已被用来将简单遗传的高度可遗传性状的基因转移至所需要的纯合栽培种或是回交亲本的近交系。将待转移的性状来源称为供方亲本。预期所得植物具有回交亲本(例如栽培种)的特性，所需性状转移自供方亲本。在最初的杂交后，选出具有供方亲本表型的个体并与回交亲本重复杂交(回交)。预期所得亲本具有回交亲本(例如栽培种)的特性，所需性状转移自供方亲本。单粒种子世代方法(single-seeddescentprocedure)从严格意义上来说是指种植分离的种群，每株植物收获一粒种子样品，用一粒种子样品种植出下一代。当种群从f2继续种植到所需的近交水平时，可以分别追踪植物(从中衍生出品系)到不同的f2个体。由于一些种子不萌发或者一些植物无法产生至少一粒种子而使种群的植物数各代都减少。因此，当各代继续生长完成时，种群中不是所有最初采样的f2植物都可用子代表示。多粒种子方法(multiple-seedprocedure)中，大豆育种人员常常从种群中的每株植物收获一个或多个豆荚，使它们混在一起脱粒以形成批量。采用部分批量种植下一代，部分保存备用。该方法被称为改进的单粒种子世代技术或豆荚批量技术(pod-bulktechnique)。多粒种子方法已被用在收获时节省人力。用机器为豆荚脱粒比在单粒种子方法中用手从每一豆荚中取出一粒种子要快得多。多粒种子方法还使种植近交各代种群相同数目的种子成为可能。常用于不同性状和农作物的其它育种方法的内容可参见几本参考书之一(例如fehr，principlesofcultivardevelopment第1卷,第2-3页(1987))。本发明还提供本发明的植物部分。植物部分包括但不限于种子、胚乳、胚珠和花粉。在本发明一个特别优选的实施方案中，植物部分是种子。本发明的植物或其部分可以在培养物中培育并再生。从各种组织类型再生出大豆植物的方法和大豆的组织培养方法是本领域已知的(参见例如widholm等，invitroselectionandculture-inducedvariationinsoybean(大豆的体外选择和培养诱导型变异)，载于soybean:genetics,molecularbiologyandbiotechnology,verma和shoemaker主编,cabinternational,wallingford,oxon,england(1996))。植物(例如大豆)的再生技术可使用各种组织或细胞类型作为起始材料。特别对于大豆，已经研发出始于某些分化组织类型的再生方法，例如分生组织(cartha等，can.j.bot.59:1671-1679(1981))、下胚轴切片(cameya等，plantscienceletters21:289-294(1981))和茎节节段(saka等，plantscienceletters,19:193-201(1980)；cheng等，plantscienceletters,19:91-99(1980))。据报道，由未成熟大豆胚外植体产生的体细胞胚再生出完全性成熟的大豆植物(ranch等，invitrocellular&developmentalbiology21:653-658(1985))。另据报道，通过器官发生和胚胎发生从组织培养物中再生出成熟的大豆植物(barwale等，planta167:473-481(1986)；wright等，plantcellreports5:150-154(1986))。本发明还提供通过筛选大豆植物对病害的抗性、免疫性或易感性来选出抗病大豆植物，所述选择包括测定大豆植物的基因组核酸中存在的在遗传上与抗病性相关qtl的等位基因连锁的标记分子，其中qtl的等位基因也位于与抗病大豆有关的连锁群上。所述病害可由真菌、病毒、细菌或无脊椎动物引起。本发明还提供赋予亚洲大豆锈病抗性的qtl，包括asr抗性基因座1、asr抗性基因座2、asr抗性基因座3、asr抗性基因座4、asr抗性基因座5、asr抗性基因座6、asr抗性基因座7、asr抗性基因座8、asr抗性基因座9、asr抗性基因座10、asr抗性基因座11、asr抗性基因座12和asr抗性基因座13。已经分别在pi200492、pi230970、pi462312(ankur)和pi459025b中鉴定出4个显性和独立遗传的豆薯层锈菌抗性基因座(本文标注为asr抗性基因座1-4)。在本发明中，asr抗性基因座1位于大豆g连锁群上。监测asr抗性基因座1渐渗所用的snp标记选自ns0093250、ns0119710、ns0103004、ns0099454、ns0102630、ns0102915、ns0102913、ns0123728、ns0129943、ns0102168、ns0092723、ns0098177、ns0127343和ns0101121。asr抗性基因座1snp标记dna序列(表示为seqidno:67-80)可用标注为seqidno:1-28的引物扩增，并且用标注为seqidno:100-127的探针检测。在本发明中，asr抗性基因座2最有可能位于j连锁群上，接近或在含有褐茎腐病(brownstemrot)抗性、大豆胞囊线虫抗性和蛙眼病抗性的抗病基因簇内，或者位于n连锁群上。在本发明中，asr抗性基因座3位于c2连锁群上。监测asr抗性基因座3渐渗所用的snp标记选自ns0099746、ns0123747、ns0126598、ns0128378、ns0096829、ns0125408、ns0098902、ns0099529、ns0097798、ns0137477、ns0095322、ns0136101、ns0098982、ns0103749、ns0118897、ns0119715和ns0130920。这些标记dna序列(表示为seqidno:81-97)可用标注为seqidno:29-62的引物扩增，并且用标注为seqidno:128-161的探针检测。在本发明中，asr抗性基因座4很可能位于n连锁群上。本发明还提供在相关研究中鉴定赋予asr抗性的单元型。这些全基因组测量表明与asr抗性相关的2个snp标记位于13号染色体的2个不同的窗内。在第一单元型窗内，监测asr抗性基因座5、asr抗性基因座6、asr抗性基因座7、asr抗性基因座8和asr抗性基因座9渐渗所用的snp标记是ns0103033。这个snp标记dna序列(表示为seqidno:98)可用标注为seqidno:63-64的引物扩增，并且用标注为seqidno:162-163的探针检测。在第二单元型窗内，监测抗性基因座10、asr抗性基因座11、asr抗性基因座12和asr抗性基因座13渐渗所用的snp标记是ns0124935。这个snp标记dna序列(表示为seqidno:99)可用标注为seqidno:65-66的引物扩增，并且用标注为seqidno:164-165的探针检测。还要了解的是，作图在距所述标记分子10厘摩以内的一个或多个标记可用于asr抗性基因座的选择和渐渗。还要了解的是，本发明提供包含本发明分子(agent)的细菌、病毒、微生物、昆虫、哺乳动物和植物细胞。核酸分子或其片段在某些环境下能够与其它核酸分子特异性杂交。如本文所使用的一样，如果两个核酸分子能够形成反向平行的双链核酸结构，则这两个分子能够彼此特异性地杂交。一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补分子”，只要它们具有完全互补性。如本文所使用的一样，当一个核酸分子的每个核苷酸与另一个核酸分子的核苷酸都互补时，则分子间表现出“完全互补性”。如果两个分子可以彼此杂交，具有足够的稳定性使得其在至少常规“低严格性”条件下彼此保持退火，则这两个分子是“最低限度互补的”。同样地，如果分子可以彼此杂交，具有足够的稳定性使得其在常规“高严格性”条件下彼此保持退火，则它们是“互补的”。常规严格性条件可参见sambrook等，载于molecularcloning,alaboratorymanual(分子克隆实验室指南),第二版,coldspringharborpress,coldspringharbor,newyork(1989)和haymes等，载于nucleicacidhybridization,apracticalapproach(核酸杂交实用方法),irlpress,washington,dc(1985)。因此，偏离完全互补性是允许的，只要这种偏离不会完全排除分子形成双链结构的能力。为了将核酸分子用作引物或探针，只需要在所采用的特定溶剂和盐浓度下，在序列上充分互补以便能够形成稳定的双链结构。本文所使用的基本同源序列是与在高严格性条件下比较起来是与互补的核酸序列特异性杂交的核酸序列。本发明的核酸探针和引物可在严格性条件下与靶dna序列杂交。术语“严格性杂交条件”的定义是探针或引物与靶序列特异性杂交而不与非靶序列杂交的条件，可凭经验确定。术语“严格性条件”通过具体杂交方法(sambrook等，1989，于9.52-9.55)，在功能上限定了有关核酸探针与靶核酸(即特定的目标核酸序列)的杂交。还可参见sambrook等(1989)于9.47-9.52、9.56-9.58；kanehisanucl.acidsres.12:203-213(1984)和wetmur等,j.mol.biol.31:349-370(1968)。促进dna杂交合适的严格性条件为本领域技术人员所知，例如约45℃下6.0x氯化钠/柠檬酸钠(ssc)，随后50℃下2.0xssc洗涤，或者可参见currentprotocolsinmolecularbiology(最新分子生物学实验指南),johnwiley&sons,n.y.,1989,6.3.1-6.3.6。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以从低严格性的50℃下大约2.0xssc至高严格性的50℃下大约0.2xssc中选择。此外，洗涤步骤中的温度可从室温约22℃的低严格性条件向约65℃的高严格性条件升高。温度和盐两者均可改变，或者将温度或盐浓度之一保持恒定，而另一个则可以变化。例如，使用dna或rna探针或引物的杂交可以如下进行：对于高严格性，65℃下，6xssc，0.5％sds，5xdenhardt’s，100μg/ml非特异性dna(例如经超声处理的鲑精dna)，洗涤为65℃下0.5xssc，0.5％sds。预期如果探针或引物与靶序列结合的特异性受到保护，则较低严格性杂交条件(例如较低杂交和/或洗涤温度)可用来鉴定具有较低序列相似性程度的有关序列。因此，由于其与dna、rna或cdna片段的互补序列段选择性形成双链体分子的能力，所以可以使用本发明的核苷酸序列。通过杂交来检测dna区段的方法为本领域技术人员所熟知，因此根据应用前景，我们可以展望采用不同的杂交条件以获得探针对靶序列的不同程度的选择性，并且方法的选择将取决于所需要的结果。本文所使用的分子(agent)，是天然存在的分子，或者如有需要则可是“基本纯的”，它指的是基本上从与其天然状态正常缔合的所有其它分子中分离出来的分子。更优选基本纯的分子是制备物中存在的主要类型。基本纯的分子可以是除去天然混合物中存在的其它分子(溶剂除外)后大于60％，优选大于75％，更优选大于90％，更优选大于95％。术语“基本纯的”往往不包括其天然状态中存在的分子。对于结构特征例如一核酸与另一核酸分子杂交的能力，或者对于蛋白质与抗体结合的能力(或者与其它分子竞争以结合)，本发明的分子(agent)优选为“生物活性的”。或者，这类特征可以是催化性的，因此涉及分子(agent)介导化学反应的能力。本发明的分子(agent)还可以是重组分子。本文所使用的术语重组分子是指任何分子(agent)(例如dna、肽等)，也就是说人为操纵的核酸分子，或者不论是否是间接的，都由人为操纵的核酸分子产生。本发明的分子(agent)可用以下成分标记：有助于检测分子(agent)的试剂(例如荧光标记(prober等，science238:336-340(1987)；欧洲专利144914)、化学标记(美国专利4,582,789、美国专利4,563,417)、修饰碱基(欧洲专利119448)，所有这些文献都通过引用全部结合到本文中)。在一个优选的实施方案中，本发明的核酸可在中等严格性条件下(例如大约2.0xssc，大约65℃)与seqidno:67至seqidno:99中所列的一个或多个核酸分子或其互补序列或者两者之一的片段特异性杂交。在一个特别优选的实施方案中，本发明的核酸可在高严格性条件下与seqidno:67至seqidno:99中所列的一个或多个核酸分子或其互补序列或者两者之一的片段特异性杂交。在本发明的一个方面，本发明优选的标记核酸分子具有seqidno:67至seqidno:99中所列的核酸序列或其互补序列或者两者之一的片段。在本发明的另一方面，本发明优选的标记核酸分子与seqidno:67至seqidno:99中所列的核酸序列或其互补序列或者两者之一的片段共享介于80％和100％之间或者介于90％和100％之间的序列同一性。在本发明又一个方面，本发明优选的标记核酸分子与seqidno:67至seqidno:99中所列的序列或其互补序列或者两者之一的片段共享介于95％和100％之间的序列同一性。在本发明一个更优选的方面，本发明优选的标记核酸分子与seqidno:67至seqidno:99中所列的核酸序列或其互补序列或者两者之一的片段共享介于98％和100％之间的序列同一性。可以采用额外的遗传标记来选择具有本发明大豆真菌病抗性相关qtl的等位基因的植物。公共标记数据库的实例包括例如美国农业部农业研究服务机构的大豆数据库。本发明的遗传标记包括“显性”或“共显性”标记。“共显性标记”表示存在两个或多个等位基因(每二倍体个体有两个)。“显性标记”表示只存在单个等位基因。存在显性标记表型(例如dna条带)表示以纯合状态或杂合状态存在的一个等位基因。缺乏显性标记表型(例如dna条带不存在)仅仅只是“某些其它”未确定的等位基因存在的证据。在其中个体主要是纯合的且基因座主要是二态的种群的情况下，显性和共显性标记可能有相同价值。因为种群杂合性变得更高，并且等位基因变得更多，因此比起显性标记，共显性标记基因型的信息量常常更大。可以采用与本发明qtl的等位基因在遗传上连锁或相关联的标记，例如简单序列重复标记(ssr)、aflp标记、rflp标记、rapd标记、表型标记、snp、同工酶标记、微阵列转录谱(walton，seedworld22-29(1993年7月)；burow等,moleculardissectionofcomplextraits(复杂性状的分子剖析),13-29,paterson主编,crcpress,newyork(1988)。这类标记的分离方法为本领域所知。例如，通过筛选基因组文库的微卫星重复序列(microsatelliterepeat)，对“阳性”克隆进行测序，设计出邻接重复序列的引物，并用这些引物使基因组dna扩增，从而可获得基因座专一性ssr标记。所得到的扩增产物的大小可按基本重复单元的整数发生变化。为了检测多态性，pcr产物可经放射性标记，用变性聚丙烯酰胺凝胶分离，并通过放射自显影检测。大小差异>4bp的片段还可用琼脂糖凝胶分离，从而避免了放射性。通过使用核酸扩增方法，可有利于dna、rna或cdna样品中多态性位点的检测。这类方法尤其增加跨多态性位点或包括该位点以及位于其远端或近端的序列的多核苷酸的浓度。这类扩增分子可容易地通过凝胶电泳或其它方法检测出来。实现这种扩增最优选的方法采用使用引物对的聚合酶链式反应(pcr)(mullis等，coldspringharborsymp.quant.biol.51:263-273(1986)、欧洲专利申请50,424、欧洲专利84,796、欧洲专利258,017、欧洲专利237,362、欧洲专利201,184、美国专利4,683,202、美国专利4,582,788、美国专利4,683,194)，所述引物对能够与界定其双链形式的多态性的近端序列杂交。除了pcr外，还可采用替代方法，例如“连接酶链式反应”(lcr)(barany，proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)88:189-193(1991)，该文献的全部内容通过引用结合到本文中)。lcr使用两对寡核苷酸探针按指数级来扩增特异性靶。选择每对寡核苷酸的序列，以便该对序列与所述靶同一链的邻接序列杂交。这类杂交形成模板依赖性连接酶的底物。如同pcr一样，所得产物进而用作随后循环的模板，获得所需序列的指数扩增。或者，可以应用“寡核苷酸连接测定法”(ola)(landegren等，science241:1077-1080(1988)，该文献的全部内容通过引用结合到本文中)。ola方案使用经设计能够与靶单链的邻接序列杂交的两个寡核苷酸。ola同lcr一样，特别适于检测点突变。然而，与lcr不同，ola引起靶序列“线性”扩增而不是指数扩增。基于在具有所得到的“二寡核苷酸”序列的核酸存在下连接两个(或多个)寡核苷酸，从而扩增该二寡核苷酸的方案也是已知的(wu等，genomics4:560-569(1989)，该文献的全部内容通过引用结合到本文中)，可容易地进行调整以适于本发明的目的。还可采用其它已知的核酸扩增方法，例如等位基因特异性寡聚体、分支dan技术、基于转录的扩增系统或者等温扩增方法，来进行扩增并分析这类多态性(美国专利5,130,238，欧洲专利329,822，美国专利5,169,766，欧洲专利359,789，kwoh等，proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)86:1173-1177(1989)，欧洲专利368,906，walker等，proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)89:392-396(1992)，所有这些文献都通过引用全部结合到本文中)。多态性还可通过单链构象多态性(sscp)分析来鉴定。sscp是能够在通常长度介于150个和250个核苷酸之间的单链dna中鉴定出最多序列变异的方法(elles，methodsinmolecularmedicine:moleculardiagnosisofgeneticdiseases(分子医学方法：遗传疾病的分子诊断),humanapress(1996)；orita等,genomics5:874-879(1989))。在变性条件下，单链dna可呈独特的依赖于其序列构象的构象。这种构象通常不同，即使仅单个碱基发生变化。据报道，大多数构象改变的物理构型或大小足以用电泳检测出。snp的一个主要特征是多态性的位点在单个核苷酸上。snp比其它类别的多态性更稳定。其自发突变率大约为10-9(kornberg，dnareplication(dna复制),w.h.freeman&co.,sanfrancisco(1980))。因为snp由序列变异产生，所以新的多态性可通过对基因组或cdna分子进行随机测序来鉴定。snp还可由缺失、点突变和插入产生。这就是说，snp作为标记也是有利的，因为由于它们几乎不会从独立起源产生，因此它们通常能诊断出“世代身份(identitybydescent)”。无论什么起因，任何单个碱基改变都可以是snp。snp发生的频率比其它类别的多态性高，可更容易地鉴定出来。在本发明中，snp可代表单一插入/缺失事件，它可由一个或多个碱基对或单核苷酸多态性组成。snp可用多种方法的任一种表征。这类方法包括对位点进行直接或间接测序、采用其中相应的等位基因位点产生或破坏限制位点的限制性内切酶、采用等位基因特异性杂交探针、采用对由多态性不同等位基因编码的蛋白质是特异性的抗体或者其它生化分析。snp可用链终止方法的变通法(sanger等，proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)74:5463-5467(1977))进行测序，其中放射性同位素的使用被荧光标记的二脱氧核苷酸替换，并进行毛细管型自动测序(美国专利5,332,666，该专利的全部内容通过引用结合到本文中；美国专利5,821,058，该专利的全部内容通过引用结合到本文中)。自动测序仪可获自例如appliedbiosystems,fostercity,ca(3730xldna分析仪)；beckmancoulter,fullerton,ca(ceqtm8000遗传分析系统)和li-cor,inc.,lincoln,ne(4300dna分析系统)。snp的分析方法可以分成两组。第一组基于引物延伸测定法，例如固相微测序(solid-phaseminisequencing)或焦磷酸测序(pyrosequencing)。固相微测序法中，dna聚合酶尤其用来延伸使紧接变异核苷酸退火的引物。与变异位点上的核苷酸互补的单一标记的核苷三磷酸被用于延伸反应。仅在含有变异位点上的核苷酸的序列可通过聚合酶延伸。可将引物阵列固定在固相支持体上，其中各引物被装在4个小孔中，各孔分别用于dna中存在的4种核苷三磷酸之一。将各试验生物的模板dna或rna加到各孔中，使之退火至引物。然后，用聚合酶和标记的二脱氧核苷酸三磷酸，使引物延伸一个核苷酸。反应完成时可用能够检测可能是放射性或荧光的标记的装置成像。采用这种方法，可观察和检测若干不同的snp(等，hum.mutat.13:1-10(1999))。焦磷酸测序技术基于dna链延长时从每个dntp释放的焦磷酸(ppi)的间接生物发光测定法。在klenow聚合酶介导的碱基掺入后，释放出ppi，并与腺苷5-酰硫酸(aps)一起用作导致atp形成的atp硫酸化酶的底物。随后，通过萤光素酶的作用，atp完成了使萤光素转化成其氧化衍生物。随之产生的光输出量与所添加的碱基数(最多约4个碱基)成比例。为便于该方法的持续合成能力，dntp过量通过腺苷三磷酸双磷酸酶降解，起始反应混合物中也存在该酶，以便在测序过程中仅dntp被加到模板上(alderborn等，genomeres.10:1249-1258(2000))。设计来检测和分析焦磷酸测序反应的仪器的一个实例可获自biotage，charlottesville，va(pyromarkmd)。基于引物延伸测定的最新snp检测方法是good测定法。good测定法(sauer等，nucleicacidsres.28:e100(2000))是利用maldi-tof(基质辅助激光解吸/电离飞行时间)质谱法的等位基因特异性引物延伸方案。含有snp的dna区先通过pcr扩增法进行扩增。残余dntp用碱性磷酸酶破坏。在引物延伸反应中，再用特异性引物(一组预处理的a-s-dntp和a-s-ddntp)及新鲜dna聚合酶产生等位基因特异性产物。通过5’-磷酸二酯酶消化脱去未修饰的dna，修饰产物是甲基化的以提高质谱分析的检测灵敏度。所有步骤以最小实际样品体积在单个小瓶中进行，不需要纯化。延伸反应可产生正电荷或负电荷，用质谱法进行检测(sauer等，nucleicacidsres.28:e13(2000))。其中进行good测定法分析的仪器为例如得自brukerdaltonics(billerica，ma)的maldi-tof系统。第二组基于异源双链体dna分子的识别，包括寡核苷酸杂交、taq-man测定法、分子信标、电子斑点印迹测定法(electronicdotblotassay)和变性高效液相色谱法。寡核苷酸杂交可用微阵列整体进行(southern，trendsgenet.12:110-115(1996))。测定法或实时pcr通过在扩增反应期间双标记的荧光探针的杂交和切割，来检测特异性pcr产物的累积。taq-man测定法包括4种寡核苷酸，其中两种用作pcr引物并产生包括待检测多态性的pcr产物。其余两种是等位基因特异性的荧光共振能量转移(fret)探针。fret探针掺入紧密相邻的荧光团和猝灭剂分子间，以便使荧光团的荧光猝灭。fret探针的信号由fret寡核苷酸降解产生，使得荧光团在猝灭剂附近释放出来，因此当适当波长激发时能够发光。在本测定中，采用带有不同荧光报道染料的两个fret探针，其中单一染料被掺到能够只与两个等位基因的一个高特异性退火的寡核苷酸中。可用的报道染料包括6-羧基-4,7,2’,7’-四氯荧光素(tet)、2'-氯-7'-苯基-1,4-二氯-6-羧基荧光素(vic)和6-羧基荧光素氨基磷酸(fam)。一个可用的猝灭剂为6-羧基-n,n,n’,n’-四甲基罗丹明(tamra)。当taqdna聚合酶遇到退火探针的5’端时，退火(但不是非退火)fret探针被该酶降解，从而从其猝灭剂附近释放出荧光团。在pcr反应后，两种荧光剂各自的荧光，以及钝态参比(passivereference)的荧光用荧光测定法测定。两种染料各自的归一化荧光强度可与样品中最初存在的各等位基因的量成比例，因此可推断出样品的基因型。测定法或实时pcr中检测荧光信号所使用的仪器的实例为7500实时pcr系统(appliedbiosystems,fostercity,ca)。分子信标是形成茎－环结构并具有内部猝灭的荧光团的寡核苷酸探针。当它们与互补靶结合时，经历开启其荧光的构象转换。这些探针识别它们的靶，比线性探针具有较高特异性，并且可容易地区分由单个核苷酸而彼此不同的靶。分子的环部分用作与靶核酸互补的探针序列。茎通过使探针序列任一侧的两条互补臂序列退火而形成。荧光部分附在一个臂的末端上，非荧光的猝灭部分附在另一臂的末端上。该茎杂交使得荧光团和猝灭剂彼此接近以致于不发出荧光。当分子信标遇到靶序列时，就形成了比茎杂交更强更稳定的探针－靶杂交体。探针经历促使臂序列分开的自发构象改组，将荧光团与猝灭剂分隔开，允许荧光团发出荧光(bonnet等，1999)。分子信标的功率取决于仅与探针序列极佳互补的靶序列杂交的能力，因此允许检测单个碱基差异(kota等，plantmol.biol.rep.17:363-370(1999))。可以在例如得自stratagene(lajolla，ca)的multiplexquantitativepcr系统上进行分子信标检测。电子斑点印迹测定法(electronicdotblotassay)采用半导体微芯片，该芯片由被含有链霉抗生物素的琼脂糖渗透层覆盖的微电极的阵列组成。将生物素化扩增子涂在芯片上，通过正偏压直流电电泳到所选择的垫片上，通过与渗透层中的链霉抗生物素的相互作用而被包埋在其中。然后，各垫片上的dna与荧光标记的等位基因特异性寡核苷酸的混合物杂交。之后，可通过增加安培数使各个垫片上的电荷极性逆转，从而使单个碱基对错配的探针优先变性。随着安培数递增至完成，用数码照相机对阵列进行拍照，并使荧光量化。然后，通过对目标区域的像素统计值取平均来确定荧光强度(gilles等，naturebiotech.17:365-370(1999))。基于识别异源双链dna分子的最新应用是采用变性高效液相色谱法(dhplc)。这一技术代表高灵敏全自动化测定法，它结合了用于高通量snp分析的peltier冷却的96孔自动进样器。这是基于离子对的反相高效液相色谱方法。该分析法的核心是聚苯乙烯－二乙烯基苯共聚物，它起着固定相的作用。流动相由离子配对剂三乙基乙酸铵(teaa)缓冲液和有机试剂乙腈(acn)组成，它介导dna与固定相结合，以便实现dna随后从柱上分离出来。can的线性梯度便于根据存在的异源双链体来进行片段分离。因此，dhplc识别引起双链pcr扩增dna中错配核苷酸之间形成异源双链体的突变和多态性。在一个典型的测定法中，在野生型和突变型dna重退火期间，序列变异产生异源双链和同源双链的混合群体。当该混合群体在部分变性温度下用dhplc进行分析时，异源双链分子由于其解链温度低而在同源双链分子之前从柱上洗脱出来(kota等，genome44:523-528(2001))。通过dhplc分析snp所使用的仪器的实例是得自transgenomic,inc.(omaha,ne)的hs系统。用于高通量监测植物基因表达的基于微阵列的方法可用作遗传标记系统。这一基于“芯片”的方法包括将核酸分子微阵列用作基因特异性杂交靶，以定量或定性测定植物基因的表达(schena等，science270:467-470(1995)，该文献的全部内容通过引用结合到本文中；shalon，博士论文，stanforduniversity(1996)，该论文的全部内容通过引用结合到本文中)。可同时查找大段序列上的每个核苷酸。可利用杂交来有效地对核苷酸序列进行分析。这类微阵列可用核酸分子的任何组合进行探测。特别优选的用作探针的核酸分子组合包括得自已知组织类型或已知发育阶段或者遭受已知胁迫(环境或人造胁迫)或其任何组合的植物的mrna分子群(例如从两叶期水分胁迫叶片中制备的mrna)。通过该方法产生的表达谱可以用作标记。为了qtl作图，所包括的标记必须可诊断出起源以便对随后的种群作出推测。snp标记对于作图是理想的，因为在特定种尚存的种群中，从独立起源得出特定snp等位基因的可能性非常低。因此，snp标记可用于跟踪和辅助qtl的渐渗，特别在单元型的情况下。另外的标记分子的遗传连锁可通过基因作图模型和运行软件包mapmaker/qtl(lincoln和lander，mappinggenescontrollingquantitativetraitsusingmapmaker/qtl(运用mapmaker/qtl对控制数量性状的基因作图),whiteheadinstituteforbiomedicalresearch,massachusetts,(1990)来确立，所述基因作图模型例如但不限于lander和botstein报道的侧翼标记模型(lander和botstein,genetics,121:185-199(1989))以及lander和botstein描述的基于最大似然法的区间作图法(lander和botstein,genetics,121:185-199(1989))。另外的软件包括qgene，2.23版(1996)，康乃尔大学植物育种和生物统计学系，266emersonhall，cornelluniversity，ithaca，ny，该软件的手册通过引用全部结合到本文中)。采用qgene软件是特别优选的方法。计算最大似然估计(mle)看标记是否存在，连同假定无qtl效应的mle一起以避免假阳性。如下计算优势比的log10(lod)：lod＝log10(存在qtl/mle但假定无连锁qtl的mle)。lod分值主要表明假定qtl存在相对于qtl不存时，数据更可能增至多大。在给定置信度(例如95％)时，为避免假阳性的lod阈值取决于标记的数目和基因组的长度。表明lod阈值的图表可参见lander和botstein，genetics,121:185-199(1989)，另可参见arús和moreno-gonzález，plantbreeding,hayward,bosemark,romagosa(主编)chapman&hall,london,第314-331页(1993)。还可以使用另外的模型。已经报道了区间作图法的许多修改和替代方法，包括非参数方法的使用(kruglyak和lander，genetics,139:1421-1428(1995)，该文献的全部内容通过引用结合到本文中)。也可采用多元回归方法或模型，其中性状用多个标记进行回归分析(jansen，biometricsinplantbreed,vanoijen,jansen(主编)，第九届欧洲植物育种学会生物统计学分会植物育种大会会议录(proceedingsoftheninthmeetingoftheeucarpiasectionbiometricsinplantbreeding),thenetherlands,第116-124页(1994)；weber和wricke,advancesinplantbreeding,blackwell,berlin,16(1994)。有研究报道了区间作图法与回归分析结合的方法，其中表型在假定标记间隔回归到单一推定qtl，并且同时回归到用作“余因子(cofactor)”的多个标记(jansen和stam，genetics,136:1447-1455(1994)和zeng,genetics,136:1457-1468(1994)。一般来讲，使用余因子降低了qtl估计位置的偏倚和采样误差(utz和melchinger，biometricsinplantbreeding,vanoijen,jansen(主编)第九届欧洲植物育种学会生物统计学分会植物育种大会会议录，thenetherlands，第195-204页(1994)，从而改进qtl作图的精度和效率(zeng，genetics,136:1457-1468(1994))。可将这些模型推广到多环境实验中以分析基因型－环境的相互作用(jansen等，theo.appl.genet.91:33-37(1995)。选择合适的作图种群对制图十分重要。合适的作图种群的选择取决于所采用的标记系统类型(tanksley等，molecularmappingofplantchromosomes.chromosomestructureandfunction:impactofnewconcepts(植物染色体的分子作图、染色体结构和功能：新构思的影响)j.p.gustafson和r.appels(主编),plenumpress,newyork,第157-173页(1988)，该文献的全部内容通过引用结合到本文中)。必须考虑用于作图种群的亲本来源(适应性亲本对外来亲本)。在远缘杂交(适应性亲本x外来亲本)中，染色体配对率和重组率可能受到严重干扰(被抑制)，通常产生的连锁距离极大地被缩短。当与近缘杂交(适应性亲本x适应性亲本)的子代相比时，远缘杂交通常可提供具有量相对大的多态性的分离种群。f2种群是杂交种子产生后自交的第一代。通常单一f1植物自交对于所有基因而言均以孟德尔(1:2:1)模式产生分离的种群。采用共显性标记系统，从完全分类的f2种群(completelyclassifiedf2population)中获得最大遗传信息(mather，measurementoflinkageinheredity:methuenandco.,(1938)，该文献的全部内容通过引用结合到本文中)。在显性标记的情况下，需要子代检验(例如f3、bcf2)来鉴定杂合子，因此使之等同于完全分类的f2种群。然而，该方法由于涉及子代检验成本和时间而常常令人望而却步。f2个体的子代检验常用于其中表型不是始终反映基因型(例如抗病性)，或者其中性状表达受qtl调控的制图。得自子代检验种群(例如f3或bcf2)的分离数据可用于制图。标记辅助选择因而可根据标记性状图联合分析应用于子代杂交(f2、f3)，其中连锁群未被重组事件完全分离(即最大不平衡)。重组近交系(ril)(遗传相关品系；通常>f5，由连续自交f2系开发出来趋于纯合)可以用作作图种群。通过采用ril，可使从显性标记获得的信息最大化，因为所有基因座都是纯合的或几乎纯合。在紧密连锁(即重组约<10％)的条件下，在ril种群中经评价的显性和共显性标记提供的每个体的信息比回交种群的任一标记类型的信息都多(reiter等，proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)89:1477-1481(1992))。然而，由于标记之间的距离变得较大(即基因座变得更加独立)，因此当与共显性标记相比时，ril种群中的信息急剧减少。回交种群(例如通过成功的变种(回交亲本)和携带前者不存在的性状的另一变种(供方亲本)之间杂交产生的种群)可用作作图种群。与回交亲本的一系列回交可恢复其大多数所需要的性状。因此，产生出包括几乎与回交亲本相同但每个个体携带来自供方亲本的不同含量或不同嵌合的基因组区的个体的种群。如果回交亲本的所有基因座是纯合的且供方亲本和回交亲本具有明显差别的多态性标记等位基因，则回交种群可用于显性标记作图(reiter等，proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)89:1477-1481(1992))。采用共显性标记或显性标记，从回交种群获得的信息少于从f2种群获得的信息，因为从每株植物采样的是一个而不是两个重组配子。然而，回交种群当与ril相比时信息量更大(在标记饱和度低时)，因为ril种群中连锁基因座之间的距离增加(即重组约为.15％)。重组增加可有益于紧密连锁的清晰度，但是可能在低标记饱和度制图时是不适合的。由产生除所研究的性状或基因组区之外遗传组成几乎相同的一系列个体的多次回交所产生的近等基因系(nil)可用作作图种群。在用nil作图时，预期仅部分多态基因座可作图至选定区域。混合分离子分析法(bulksegregantanalysis，bsa)是开发用于快速鉴定标记和目标性状之间连锁的方法(michelmore等，proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)88:9828-9832(1991))。在bsa中，从单次杂交所产生的分离种群中提取两批dna样品。这些批次含有特定性状(对特定病害的抗性或易感)或基因组区相同但任意在不连锁区(即杂合)的个体。在bsa中，与靶区不连锁的区在混合样品的多个个体之间没有不同。传统qtl作图的一个替代方法包括对单元型与个体标记作图而达到更高清晰度(fan等2006genetics)。这一方法跟踪称为单元型的dna区组，如多态性标记所限定的一样，在作图种群中就世代来说，它被认为是相同的。这个假设导致较大的有效样品大小，提供了更高清晰度的qtl。表型和基因型(在这种情况下为单元型)之间关联统计显著性的测定方法，可通过本领域已知任何统计检验和所需统计显著性的任何可接受的阈值来确定。具体方法的应用和显著性阈值都在本领域普通技术人员掌握之中。本发明的snp标记可用来分离或基本纯化同样位于与以下基因座相关的连锁群上的qtl的等位基因：asr抗性基因座1、asr抗性基因座2、asr抗性基因座3、asr抗性基因座4、asr抗性基因座5、asr抗性基因座6、asr抗性基因座7、asr抗性基因座8、asr抗性基因座9、asr抗性基因座10、asr抗性基因座11、asr抗性基因座12和asr抗性基因座13。构建跨区的一系列重叠克隆(克隆重叠群)可为包括位于与以下基因座有关的连锁群上的真菌病抗性qtl的等位基因的物理图谱提供了基础：asr抗性基因座1、asr抗性基因座2、asr抗性基因座3、asr抗性基因座4、asr抗性基因座5、asr抗性基因座6、asr抗性基因座7、asr抗性基因座8、asr抗性基因座9、asr抗性基因座10、asr抗性基因座11、asr抗性基因座12和asr抗性基因座13。酵母人工染色体(yac)克隆系统促进了染色体步查和大型克隆策略。利用本发明标记的序列标签位点(sequencetagsite，sts)含量方法可用于构建跨染色体区的yac克隆。这类构建yac图的sts含量方法可提供任何染色体区的详细有序的基于sts的图谱，包括包含同样位于与以下基因座有关的连锁群上的qtl的等位基因的区域：asr抗性基因座1、asr抗性基因座2、asr抗性基因座3、asr抗性基因座4、asr抗性基因座5、asr抗性基因座6、asr抗性基因座7、asr抗性基因座8、asr抗性基因座9、asr抗性基因座10、asr抗性基因座11、asr抗性基因座12和asr抗性基因座13。可用通过使用bac、pac或含有大小范围为70kb至数百个千碱基的插入序列的噬菌体p1克隆来跨区绘制的详细的物理图谱补充yac图(cregan，theor.appl.gen.78:919-928(1999)；sternberg,proc.natl.acad.sci.87:103-107(1990)；sternberg,trendsgenet.8:11-16(1992)；sternberg等，newbiol.2:151-162(1990)；ioannou等，nat.genet.6:84-89(1994)；shizuya等，proc.natl.acad.sci.89:8794-8797(1992)，所有这些文献都通过引用全部结合到本文中)。采用本发明的可用标记得到多套克隆重叠以筛选bac、pac、噬菌体p1或黏粒文库。此外，可应用杂交方法将yac图转化成bac、pac、噬菌体p1或黏粒重叠群图。完整的yac和inter-alu-pcr的产物以及合适sts的引物序列可用来筛选bac、pac、噬菌体p1或黏粒文库。使用sts含量信息和指纹法，可将分离用于任何区的克隆装配成重叠群(sulston等，comput.appl.biosci.4:125-132(1988))。允许不同核酸序列编码同一蛋白质或肽的遗传密码的简并性在文献中有记载。当核酸分子编码同一氨基酸序列但却包含不同核苷酸序列时，则本文所使用的核酸分子是另一核酸分子的简并核酸分子。本发明的一个方面是，本发明的核酸分子包括与编码数量性状等位基因蛋白质的核酸分子是简并的核酸分子。本发明的另一方面是，本发明的核酸分子包括与编码qtl相关的一个或多个蛋白质的核酸分子同源的核酸分子。可使用设计用于转化目的的dna植物转化载体或构建体，将外源遗传物质转移到植物中。一个特别优选的细分的外源材料包含本发明的核酸分子。这类载体的设计一般为本领域技术人员所掌握(参见plantmolecularbiology:alaboratorymanual(植物分子生物学实验室指南)，clark主编，springer，newyork(1997)，这类植物的实例包括但不限于苜蓿、拟南芥属(arabidopsis)、大麦、芸苔属(brassica)、青花椰菜、卷心菜、柑桔、棉花、大蒜、燕麦、油料种子油菜、洋葱、欧洲油菜、亚麻、玉米、观赏植物、豌豆、花生、胡椒、马铃薯、水稻、黑麦、高粱、大豆、草莓、甘蔗、甜菜、番茄、小麦、杨树、松树、冷杉、桉树、苹果、莴苣、兵豆、葡萄、香蕉、茶树、草坪草、向日葵、油椰、菜豆属(phaseolus)等。构建体或载体可包括本发明的真菌病抗性qtl的内源启动子。真菌病抗性的特征最好通过表达已鉴定出的具有内源启动子的qtl蛋白来实现。或者，可以选择异源启动子来表达精选的蛋白质或蛋白质片段。这些启动子可与编码与真菌抗性qtl对应的蛋白质的多核苷酸序列有效连接。异源启动子可以是根据成熟期或开花期选出的异源启动子，因为所需蛋白质表达的时间选择可能对影响真菌病抗性性状的参数十分关键。真菌病抗性qtl的有效表达可能还需要在特定组织类型中表达的启动子。或者，启动子可与其它核酸序列(例如编码转运肽、选择标记蛋白的核酸序列或反义序列)有效连接。可以在载体将插入的细胞类型的基础上或者在其调节特征的基础上，对启动子进行选择。这种特征的实例包括转录活性的提高、可诱导性、组织特异性和发育阶段特异性。植物中，已经披露了病毒或合成来源的诱导型启动子、组成型活性启动子、时序调节启动子和空间调节启动子(poszkowski等，emboj.,3:2719,1989；odell等，nature,313:810,1985；chau等，science,244:174-181.1989)。常用的组成型启动子包括camv35s启动子(odell等，nature，313：810，1985)、增强型camv35s启动子、玄参花叶病毒(fmv)启动子(richins等，nucleicacidsres.20:8451,1987)、胭脂碱合酶(nos)启动子(shaw等nucleicacidsres.12:7831-7846(1984))和章鱼碱合酶(ocs)启动子。可用的诱导型启动子包括水杨酸或聚丙烯酸诱导的启动子(pr-1；williams等，biotechnology10:540-543,1992)、施用安全剂诱导的启动子(取代的苯磺酰胺除草剂；hershey和stoner，plantmol.biol.17:679-690,1991)、热激启动子(ou-lee等，proc.natl.acad.sciu.s.a.83:6815,1986；ainley等，plantmol.biol.14:949,1990)、从菠菜亚硝酸还原酶可转录多核苷酸序列得到的硝酸诱导型启动子(back等，plantmol.biol.17:9,1991)、激素诱导型启动子(yamaguchi-shinozaki等，plantmol.biol.15:905,1990)和与rubp羧化酶小亚基和lhcp家族有关的光诱导型启动子(kuhlemeier等，plantcell1:471,1989；feinbaum等，mol.gen.genet.226:449-456,1991；weisshaar等，emboj.10:1777-1786,1991；lam和chua,j.biol.chem.266:17131-17135,1990；castresana等，emboj.7:1929-1936,1988；schulze-lefert等，emboj.8:651,1989)。重组载体中特别优选的启动子包括胭脂碱合酶(nos)启动子(ebert等，1987)、章鱼碱合酶(ocs)启动子(它被携带在根癌土壤杆菌(agrobacteriumtumefaciens)的根瘤诱导质粒上)、花椰菜花叶病毒启动子例如花椰菜花叶病毒(camv)19s启动子(lawton等，1987)、camv35s启动子(odell等，1985)、玄参花叶病毒35s-启动子(walker等，1987)；得自核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基(ssrubisco)的光诱导型启动子；得自烟草的eif-4a启动子(mandel等，plantmol.biol,29:995-1004,1995)；得自拟南芥的几丁质酶启动子(samac等，plantcell,3:1063-1072,1991)；得自青花椰菜的ltp(脂质转运蛋白)启动子(pyee等，plantj.,7:49-59,1995)；矮牵牛查耳酮异构酶启动子(vantunen等，emboj.7:1257,1988)；菜豆富含甘氨酸蛋白1启动子(keller等，embol.,8:1309-1314,1989)；马铃薯patatin启动子(wenzler等，plantmol.biol.,12:41-50,1989)；拟南芥肌动蛋白7启动子(genbank检索号u27811.1gi:1002528、17-apr-1997和pct申请wo0144457a2；该文献的全部内容通过引用结合到本文中)；拟南芥肌动蛋白8启动子(an等，plantj.10:107-121(1996)和pct申请wo0144457a2)；拟南芥核酮糖二磷酸羧化酶－加氧酶小亚基4启动子(krebbers等，plantmol.biol.11:745-759(1988))；芸苔油菜籽蛋白基因启动子(美国专利5,420,034，该专利的全部内容通过引用结合到本文中)；拟南芥suc2启动子(truernit等，planta196:564-570(1995))；拟南芥延伸因子ef-1α启动子(axelos等，mol.gen.genet.219:106-112(1989))和大豆7sαβ伴大豆球蛋白(conglycin)启动子，即sphas(doyle等，j.biol.chem.261:9228-9238(1986))。本发明的构建体还可包括另外的mrna多核苷酸分子的5’非翻译区(5’utr)或前导区或者可能在翻译起始中起重要作用的基因。某些5’utr可起翻译增强子的作用，并且还可整合成为重组载体的组成部分。例如，已经证实，得自热激蛋白基因的非翻译5’前导多核苷酸分子提高基因在植物中的表达(参见例如美国专利5,659,122(该专利的全部内容通过引用结合到本文中)以及美国专利5,362,865(该专利的全部内容通过引用结合到本文中))。因此，重组载体可优选含有用来提高核酸序列表达的一个或多个5’非翻译前导序列。这类增强子序列可能是提高或改变所得mrna的翻译效率所需要的。优选的5’核酸序列包括拟南芥肌动蛋白7前导序列(genbank检索号u27811.1gi:1002528、17-apr-1997和pct申请wo0144457a2；该申请的全部内容通过引用结合到本文中)；拟南芥肌动蛋白8前导序列(an等，plantj.10:107-121(1996)和pct申请wo0144457a2)；拟南芥核酮糖二磷酸羧化酶－加氧酶小亚基4前导序列(krebbers等，plantmol.biol.11:745-759(1988))；芸苔油菜籽蛋白基因前导序列(美国专利5,420,034，该专利的全部内容通过引用结合到本文中)；拟南芥suc2前导序列(truernit等，planta196:564-570(1995))；矮牵牛(petuniahybrida)hsp70基因前导序列(winter等，mol.gen.genet.211:315-319(1988))：拟南芥epsps基因前导序列(klee等，mol.gen.genet.210:437-442(1987))；拟南芥延伸因子ef-1α前导序列(axelos等，mol.gen.genet.219:106-112(1989))和大豆7sαβ伴大豆球蛋白前导序列(doyle等，j.biol.chem.261:9228-9238(1986))。另外这些上游调节的多核苷酸分子可得自相对于构建体上存在的其它元件是天然或异源的来源。此外，构建体可包括得自植物基因3’非翻译区(3’utr)的另外的调节多核苷酸分子。3’utr或终止子通常提供转录终止信号和聚腺苷酸化信号，聚腺苷酸化信号的作用是在植物中使腺苷酸核苷酸加到mrna的3’端。位于聚腺苷酸化位点下游几百个碱基对的核酸序列通常用来终止转录。此外，某些3’utr提供额外的性质，例如提高mrna的稳定性，如马铃薯蛋白酶抑制剂ii基因的3’utr(an等，theplantcell1:115-122(1989))。其它3’utr可提供增强mrna降解的序列，例如在动物细胞中显示是引起rna信息稳定性较低的5’-uuauuuauu-3’基序(zubiaga等，mol.cellbiol.15:2219-2230(1995))。这些额外的下游调节多核苷酸分子可得自相对于构建体上存在的其它元件是天然或异源的来源。优选的3’utr或终止子是马铃薯蛋白酶抑制剂ii基因3’utr(an等，theplantcell1:115-122(1989))；豌豆核酮糖二磷酸羧化酶－加氧酶小亚基e9终止子(coruzzi等，emboj.3:1671-1679(1984))；花椰菜花叶病毒35s终止子；芸苔油菜籽蛋白基因终止子(美国专利5,420,034)；大豆7sαβ伴大豆球蛋白基因终止子(doyle等，j.biol.chem.261:9228-9238(1986))；菜豆(phaseoulusvulgaris)arc5终止子(goossens等，eur.j.biochem.225:787-795(1994))；根癌土壤杆菌胭脂碱合酶终止子(rojiyaa等，1987，genbank检索号e01312和美国专利申请us20020192813a1，这些文献的全部内容通过引用结合到本文中)和大豆adr12基因终止子(datta等，plantmol.biol.21:859-869(1993))。载体或构建体还可包括得自某些基因的内含子的调节元件。其实例包括adh内含子1(callis等，genesanddevelop.1:1183-1200(1987)；蔗糖合酶内含子(vasil等，plantphysiol.91:1575-1579(1989)和tmvω元件(gallie等，theplantcell1:301-311(1989))。优选的内含子是拟南芥肌动蛋白7内含子(genbank检索号u27811.1gi:1002528、17-apr-1997和pct申请wo200144457a2；这些文献的全部内容通过引用结合到本文中)；拟南芥肌动蛋白8内含子(an等，plantj.10:107-121(1996)和pct申请wo200144457a2)及拟南芥延伸因子ef-1α内含子(axelos等，mol.gen.genet.219:106-112(1989))。适当时可包括这些元件和其它调节元件。载体或构建体还可包括选择标记(selectablemarker)。还可以采用选择标记来选择含有外源遗传物质的植物或植物细胞。这些选择标记的实例包括但不限于neo基因(potrykus等，mol.gen.genet.199:183-188(1985))，它编码卡那霉素抗性并可用卡那霉素、g418等来选择；编码双丙氨膦(bialaphos)抗性的bar基因；突变型epsp合酶基因(hinchee等，bio/technology6:915-922(1988))，它编码草甘膦抗性；赋予溴苯腈抗性的腈水解酶基因(stalker等，j.biol.chem.263:6310-6314(1988))；赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性的突变型乙酰乳酸合酶基因(als)(例如美国专利6,222,100，该专利的全部内容通过引用结合到本文中)；甲氨蝶呤抗性dhfr基因(thillet等，j.biol.chem.263:12500-12508(1988))；由例如嗜麦芽假单胞菌(pseudomonasmaltophilia)的麦草畏单加氧酶(dmo)基因赋予的麦草畏耐受性(美国专利申请20030135879，该专利的全部内容通过引用结合到本文中)。载体或构建体还可包括筛选标记(screenablemarker)。筛选标记可用来监测表达。示例性的筛选标记包括β-葡糖醛酸糖苷酶基因或编码已知的各种显色底物的酶的uida基因(gus)(jefferson，plantmol.biol,rep.5:387-405(1987)，该文献的全部内容通过引用结合到本文中；jefferson等，emboj.6:3901-3907(1987)，该文献的全部内容通过引用结合到本文中)；r-基因座基因，它编码的产物调节植物组织中花色素苷色素(红色)的产生(dellaporta等，stadlersymposium11:263-282(1988)，该文献的全部内容通过引用结合到本文中)；β-内酰胺酶基因(sutcliffe等，proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)75:3737-3741(1978)，该文献的全部内容通过引用结合到本文中)，编码各种显色底物是已知的酶的基因(例如padac、显色头孢菌素)；萤光素酶基因(ow等，science234:856-859(1986)，该文献的全部内容通过引用结合到本文中)；xyle基因(zukowsky等，proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)80:1101-1105(1983)，该文献的全部内容通过引用结合到本文中)，它编码可以转化显色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶；α-淀粉酶基因(ikatu等，bio/technol.8:241-242(1990)，该文献的全部内容通过引用结合到本文中)；酪氨酸酶基因(katz等，j.gen.microbiol.129:2703-2714(1983)，该文献的全部内容通过引用结合到本文中)，它编码能够使酪氨酸氧化成dopa且多巴醌进而缩合成黑色素的酶和α-半乳糖苷酶。可以采用本领域已知的将转基因导入植物中的任何技术来制备本发明的真菌病抗性植物。一般认为植物转化的合适方法实际上包括可将dna导入细胞的任何方法，例如通过电穿孔，参见美国专利号5,384,253；微弹轰击，参见美国专利号5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861和6,403,865；土壤杆菌介导的转化，参见美国专利号5,635,055、5,824,877、5,591,616、5,981,840和6,384,301以及原生质体转化，参见美国专利号5,508,184。通过例如这些技术的应用，实际上任何植物品种的细胞都可被稳定转化，并且这些细胞可发育成转基因植物。用于棉花转化方面的技术参见美国专利号5,846,797、5,159,135、5,004,863和6,624,344；芸苔属植物的转化技术特别参见例如美国专利5,750,871；大豆转化技术参见例如zhang等(plantcelltissueorgancult56:37-46(1999)和美国专利6,384,301。既然我们已对本发明进行了一般性描述，通过参考下面以示例方式提供的实施例就能更容易地理解本发明，实施例并不是对本发明的限制，除非另有说明。实施例实施例1：含有asr抗性基因座的近等基因系的育种1400个单核苷酸多态性(snp)标记，随机分布在大豆遗传连锁图的20个连锁群中，被用来鉴定与asr抗性基因座1基因座紧密连锁的snp标记。从williams82与asr抗性基因座1供体pi200492杂交培育出由近等基因系(nil)组成的一组大豆品系。采用了pi200492的衍生系来鉴定在williams82和pi200492之间为多态的snp标记。然后使用这些多态性snp标记，利用分离的回交种群l85-2378来鉴定asr抗性基因座1的图位。通过将williams82与pi200492杂交培育出l85-2378，进行5轮回交循环或者基本上6轮williams82回交以恢复大多williams82的良性性状。因此，产生了由几乎同回交亲本williams82、但nil的每个个体携带得自供方亲本pi200492的不同数量或嵌合的基因组区的个体组成的l85-2378。用上述鉴定出的多态性snp标记对整个种群进行了基因型分析，随后采用温室实验法对大豆锈病抗性进行了评价。对snp标记基因型与大豆锈病抗性表型间的关联性进行了评价。发现与asr抗性基因座1病害表型反应高度连锁不平衡的snp标记为ns0093250、ns0119710、ns0103004、ns0099454、ns0102630、ns0102915、ns0102913、ns0123728、ns0129943、ns0102168、ns0092723、ns0098177、ns0127343和ns0101121，参见表1，并被标注为seqidno:67-80。所有这些snp标记都作图在通用大豆遗传连锁图的g连锁群的区域上。表1列出了标注为seqidno:1-28的pcr扩增引物序列和对应于这些snp标记的标注为seqidno:100-127的探针。鉴定出两个snp标记用于监测asr抗性基因座1的阳性渐渗，并分别对应于snp标记nso102913和nso129943以及对应于seqidno:73和seqidno:75。还在下列f2:3种群中，对asr抗性基因座1针对得自美国阿拉巴马州大豆锈病分离菌种的功效进行了评价：ag4403xpi200492、ag3302xpi200492、ag3201xpi200492、ag26932xpi200492、ag2402xpi200492。在所述各种群中，观测到3:1分离比率，这表明了单显性基因遗传模式。根据所述用于asr抗性基因座1的方法，由williams82与供方亲本pi462312杂交，接着进行5轮回交循环，或基本上6轮williams82回交以恢复大多williams82的良性性状，用由此产生的nil对asr抗性基因座3基因座作图。因此，产生了由几乎同回交亲本williams82、但是近等基因系的每个个体携带了得自供方亲本pi200492的不同数量或嵌合的基因组区的个体组成的l85-2378。用上述鉴定出的一套多态性snp标记，对整个种群进行了基因型分析，并且采用温室实验法，随后对大豆锈病抗性进行了评价。对snp标记基因型与大豆锈病抗性表型之间的关联性进行了评价。发现与asr抗性基因座3高度连锁不平衡的snp标记为ns0099746、ns0123747、ns0126598、ns0128378、ns0096829、ns0125408、ns0098902、ns0099529、ns0097798、ns0137477、ns0095322、ns0136101和ns0098992，参见表1，并被标注为seqidno:81-93。这些标记都作图在通用大豆遗传学图的lgc2连锁群上。表1列出了标注为seqidno:29-54的pcr扩增引物序列和对应于这些snp标记的标注为seqidno:128-153的探针。监测asr抗性基因座3渐渗所用的标记对应于snp标记nso137477，被标为seqidno:90。为了证实asr抗性基因座3的推定位置，在avrdc-8和ag4403之间培育出分离的f3:4种群。avrdc-8是由台湾亚洲蔬菜研究开发中心通过ankur(含有asr抗性基因座3的品系)与pi230970(asr抗性基因座2供体)杂交培育出的品系。目前正在对这个种群的snp标记进行基因型分析，并对针对得自loxley，al的大豆锈病分离菌株的抗性反应进行评价，以证实asr抗性基因座3的位置。随后在基于一组pi系和文献已报道含有任一qtl的其它系之间多态性的研究中确定了asr抗性基因座2和asr抗性基因座4的大致位置，所述pi系是已知分别含有asr抗性基因座2或asr抗性基因座4，即是asr抗性基因座2供体和asr抗性基因座4供体的pi230970和pi459025b。根据多态性研究，任何多态性snp标记都是接近asr抗性基因座的候选区。对于asr抗性基因座2，鉴定出两个候选区，该基因座很可能位于j连锁群，接近或在褐茎腐病、大豆胞囊线虫抗性和蛙眼病抗病性簇内，或者在n连锁群内。asr抗性基因座4很可能位于n连锁群内。表1.用于asr抗性基因座1和asr抗性基因座3鉴定和选择的snp标记实施例2：孢子的收集和繁殖从monsantoloxleyagronomystation(loxley，al)的受感染植物中收集豆薯层锈菌的亚洲大豆锈病夏孢子，本文称为loxley菌株。将悬浮于含有0.01％吐温20(tween-20)的水中的孢子喷撒在叶背面而接种到大豆植物中。感染后7-10天左右无需放大便可目测到病斑发生，感染后12-14天则形成孢子。收集受感染植物的孢子，将其重悬浮于含有0.01％吐温20的无菌去离子水中。孢子浓度用血细胞计数器测定。实施例3：亚洲大豆锈病抗性的离脱叶实验对两种类型的叶组织进行了评价以进行asr病害表型分析。对出苗后7-10天具一小叶的叶片或出苗后21-28天具三叶的叶片v3进行了评价。从土壤中出苗后2天左右，大豆植物长出一对具一小叶的叶片，5天左右完全展开，构成第一“真叶”。出苗后7天左右，出现具三叶的叶片(在一个叶柄末端包含3片叶)。依次出现三组叶片，第一具三叶的叶片被称为v1期，在出苗后10天完全伸展。接下来的两个v期相隔一周发生。值得注意的是，在叶片展开和硬化后，即不是新叶和嫩叶，才给叶片接种病害。具一小叶的叶片往往硬化得非常快，在出苗后8-10天左右，而v2和v3具三叶的叶片可能直到出苗后24-28天才完全展开。将3张直径3.2cm的watmann#1滤纸各放入6孔组织培养板(孔容积为15.5毫升)的6孔各孔中。将叶片切成3厘米x3厘米的小块，将叶片背面(气孔面)向上放在watmann滤纸上面。将大约2.0毫升无菌去离子水加到6孔组织培养板各孔中。将得自豆薯层锈菌的亚洲大豆锈病夏孢子悬浮于含有0.01％吐温20的无菌去离子水中，浓度为1x105个夏孢子/毫升。用喷枪(badger155anthem型，badgerair-brushco.，franklinpark，il)与设置为1千克/平方厘米的压缩机(tc-20型，airbrushdepot，sandiego，ca)，将约50微升孢子悬液喷洒到各叶片上至湿润。然后将6孔板用石蜡膜密封，并放到设置为22摄氏度的生长室内，光周期为12小时/昼长。每2天或每3天监测板中病害的进展，并确保各孔不变干。需要时加入去离子水补充至最初的孔容积，或者调整培育箱相对湿度至大约80％。接种后3-5天左右，发生病斑的早期症状在解剖显微镜下应是明显的。接种后9-14天形成孢子的病斑应是明显的。由多次试验计算出平均大豆锈病严重程度分值。锈病严重程度分值使用1-5的评价等级；1－是免疫的，2－在50％以下的叶片区域显示红色/棕色病斑，3－在50％以上的叶片区域显示红色/棕色病斑，4－在50％以下的叶片区域显示黄褐色病斑和5－在50％以上的叶片区域显示黄褐色病斑。本测定法的叶切片可保持存活长达2个月。采用易感亚洲大豆锈病的大豆lee74的实验，对于每次进行的测定都始终显示感染程度高。评价推定的抗性种质的进一步实验能够区分表2中所示的易感保藏品种的耐受性。保藏品种pi200487表现出迟发锈病(slowrust)抗性表型。我们正在尝试以期鉴定出可用于把在pi200487中鉴定出的抗性基因座渐渗到优良种质中的标记。此外，具一小叶的叶片组织与具三叶的叶片组织的asr评价的比较显示，对于具三叶的叶片组织，由种子到数据点需要45天左右，对于具一小叶的叶片组织则23天左右。实验时间缩减了一半，这显然节省了确定抗病性评级所需要的离脱叶实验和时间。由于节省3周时间，植物可以更快的时标繁殖，易感植物可越早剔出，因此节省了田间和温室空间。表2.用具一小叶的叶片组织和具三叶的叶片组织测定的抗性和易感保藏品种(accession)的平均锈病分值；“-”表示未进行实验。实施例4：对于具有渐渗的asr抗性基因座1、asr抗性基因座2和asr抗性基因座3的豆薯层锈菌抗性的优良杂交品种的试验将含有asr抗性基因座1的供方抗性亲本系pi200492与不同大豆优良系进行杂交，以监测asr抗性基因座1的阳性渐渗。用从抗性亲本系保藏品种pi200492(asr抗性基因座1)以及已知的抗性保藏品种(pi230970(asr抗性基因座2)和pi462312(asr抗性基因座3))与易感优良系杂交得到的品系进行了loxley菌株抗性的叶片实验。所有试验品系的抗性分值见表3。平均锈病严重程度分值得自4株植物，每株4次重复，并在不同的4天中进行了评分(10dai、17dai、24dai、32dai)。表3.asr回交事件和优良系的平均锈病严重程度分值含有asr抗性基因座1基因座的品系具有最大loxley菌株抗性。通过mas证实了asr抗性基因座1的渐渗。实施例5：采用离脱叶实验测定大豆保藏品种的asr抗性基于温室实验法，采用外部起源的asr分离菌种的混合种群，鉴定出700个推定的asr抗性保藏品种。按照实施例3所述方法，用700个usda推定的抗性保藏品种中的250个的一小组进行了asr抗性的叶片实验。选出得自usda的一组补充的250个asr易感保藏品种，用于在叶实验中根据使成熟和地理起源相对应而与250个抗性保藏品种进行比较。大多数抗性保藏品种(这些品种的平均锈病严重程度分值为1-2)的平均锈病严重程度分值见下表4。1400个snp标记，每隔5厘摩分布在大豆遗传连锁图20个连锁群中，可用来鉴定用于在下列抗性保藏品种所具有的asr抗性基因座渐渗到优良种质的标记。表4.asr抗性保藏品种的平均锈病严重程度分值此外，对于一组89个抗性保藏品种，对分布在asr抗性基因座3近端和远端的snp标记进行了基因型分析。发现4个额外的snp标记(ns0103749、ns0118897、ns0119715和ns0130920)与asr抗性基因座3有关并列于表中，标注为seqidno:94-97。表5列出了标注为seqidno:55-62的pcr扩增引物序列和对应于这些snp标记的标注为seqidno:154-161的探针。该信息将用来鉴定使asr和其它病原体抗性基因座渐渗以优先顺序排列的新的抗性来源。表5.用于asr抗性基因座3鉴定和选择的snp标记实施例6.应用相关研究来鉴定赋予真菌病抗性的qtl为了鉴定与病害有关的区或基因，第一步是培育抗性变种。之前已鉴定出4个锈病抗性的基因座(asr抗性基因座1、asr抗性基因座2、asr抗性基因座3、asr抗性基因座4)。在这个实施例中，连锁不平衡和单元型关联作图被应用于大豆种质的病例对照数据样品中。用797个snp，对492个大豆品系(246个抗性易感对)的锈病抗性进行评分并进行指纹分析。对豆薯层锈菌分离菌种混合物的抗病性按1-5分进行评分，小于3为抗性，大于4为易感。准确地讲，对3、5和9个连续snp的窗大小进行了病例对照测定、费希尔精确检验(fishers'exacttest)、单标记f检验和单元型趋势回归研究。多项检验结果明显将2个单独的单元型窗的2个snp标记与真菌病抗性联系在一起，所述单元型窗本文称为真菌病抗性单元型窗1和2，位于具有真菌病抗性的13号染色体24-45cm。snp标记ns0103033和ns0124935分别位于真菌病抗性单元型窗1和2上。ns0103033(seqidno:98)的引物用seqidno:63和64标注，探针用seqidno:162和163标注。ns0124935(seqidno:99)的引物用seqidno:65和66标注，探针用seqidno:164和165标注。每个单元型的抗性分值和每个单元型的标记等位基因见表5。指定每个窗5个snp标记，且每个的等位基因用单元型序列表示。单元型窗1中ns0103033的等位基因和单元型窗2中ns0124935的等位基因用黑体字表示。至于ns0103033，snp实际为9-bp插入/缺失，其中“z”表示缺失(*********)，“w”表示插入(gaagtggat)。含有得自单元型窗1和/或单元型窗2的抗性单元型的变化见表6。这个作图成就除了上述asr抗性基因座以外，还鉴定出额外的asr抗病性qtl。表5.asr抗性单元型窗1和2中含有抗性单元型品系的评分一览表。抗性分值0表示有抗性的品系，分值1表示称为易感的品系。表6.13号染色体上asr抗性窗1和/或2中含有单元型的抗性种质病害评级。虽然已经说明和描述了本发明的原理，但是对本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的原理的情况下，可在安排和细节方面对本发明作出修改。我们要求落入所附权利要求书精神和范围内的所有修改的权益。本说明书所引用的所有出版物和专利文件都通过引用结合到本文中，如果各个出版物或专利申请具体和个别规定了通过引用结合的程度，则引用程度与之相同。<110>孟山都技术有限公司(monsantotechnologyllc.)baley,georgejamesbutruille,davidconcibido,vergelceathington,samuelrhaverdink,michaeldkruger,warrenmledeaux,johnrnarvel,jamespitkin,johnwtamulonis,johnpxie,chongqing<120>大豆抗病性数量性状基因座及其组成的鉴定方法<130>38-21(53517)<140>60/808430<141>2006-05-25<160>165<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>1cacctgttgcttctccaccat21<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>2gggtggtgctcttggaggta20<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>3taaagcaaaaggacgttacgacaa24<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>4gcattgatttgtccacgaagaac23<210>5<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>5ttgcaattttttatatcttgatttcacat29<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>6gcgaagaatcaaaactggtcaaa23<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>7aagtggaggaggaaatgatgga22<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>8caagggccctgattatgtgaa21<210>9<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>9acaaggacaaggctatgagaagtaaga27<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>10ggccatgaatcaagccactt20<210>11<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>11gagttagatttatccggcaacga23<210>12<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>12cccgaagagatgtcatgttaacaa24<210>13<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>13gggttaccttcatagctgctattttc26<210>14<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>14gggcacaacacctgaatgg19<210>15<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>15ccgcagtgaatcaagtaattagttaataa29<210>16<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>16aaggtttagttcgatcagtgattttga27<210>17<211>32<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>17ggtttcagatattttgataagctaattagatg32<210>18<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>18caagaactcacattcctcagatgaag26<210>19<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>19agggcctattgtgatgattaagga24<210>20<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>20aaatctgaaaaagcatcccaaaag24<210>21<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>21gtaataatcccaaacatttttcttcga27<210>22<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>22gggatgagttgaattaattttcaaagta28<210>23<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>23gcatgctgcttttaactatgaaacat26<210>24<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>24gttgatgaagtatacaatttcatttgca28<210>25<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>25aaaccaagtgaggagacattaattca26<210>26<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>26ggctgagttgggttaatatcacatt25<210>27<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>人工的<400>27aaa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