一种快速鉴定埃博霉素基因簇阳性菌株的方法与流程

本发明涉及一种用于快速鉴定阳性菌株的方法，尤其涉及一种用于快速鉴定纤维堆囊菌中埃博霉素基因簇阳性菌株的分子生物学方法，属于生物技术领域。

背景技术：

纤维堆囊菌(sorangiumcellulosum)是粘球菌3个亚目之一，类属于堆囊菌亚目、多囊菌科、堆囊菌属，是一类能够以纤维素作为唯一碳源进行生长繁殖的革兰氏阴性滑动细菌。其细胞形态一般呈现为长度3-8μm、直径0.8-1.2μm的短杆状(brenner等,2006)。纤维堆囊菌的子实体一般为橙红色、褐色或者黑色。纤维堆囊菌的基因组十分庞大，约为大肠杆菌基因组的2倍，gc含量高达69～72％。纤维堆囊菌对多种抗生素具有抗性，例如氨苄青霉素、卡那霉素、头孢菌素c等，因此通过向富集培养基中添加上述几种抗生素以及放线菌酮、制霉菌素等真菌抑制剂可以在一定程度上抑制纤维堆囊菌富集过程中其他杂菌的生长。

纤维堆囊菌能够产生多样的次级代谢产物，例如芳香族类、醌类、多烯类、大环内脂类等，是继放线菌之后又一类重要的药源菌类群(gerth等，2003；shimkets等，2006)。其中引起人们广泛关注的是一类16元大环内脂类化合物——埃博霉素。埃博霉素具有与抗肿瘤药物紫杉醇类似的生物活性，能够促微管的聚合，使细胞周期被阻碍在g2-m期，从而抑制肿瘤细胞的无限增殖(bollag等，1995；pronzato，2008)。埃博霉素除了具有抗肿瘤活性外，还具有化学结构简单、水溶性高、副作用小以及对具有抗药性的肿瘤细胞具有更强的活性等优点，被认为是紫杉醇的更新替代品(service，1996)。目前，埃博霉素氮杂修饰物ixabepilone已作为一线抗癌药物商品化上市(pronzato，2008)。然而，埃博霉素在产量上目前正遭受极大的挑战，首先，并不是所有的纤维堆囊菌都能够产生埃博霉素，据文献报道，在筛选的1600株菌株中，只有2.5％的菌株能够产生埃博霉素(gerth等，2003)；其次纤维堆囊菌代时长、生长过程中对于细胞密度的依赖性强、遗传体系难以构建等也严重限制了纤维堆囊菌的应用。

目前，用于鉴定产埃博霉素的纤维堆囊菌主要依赖于发酵的传统方法。由于纤维堆囊菌的代时较长(约16小时)、生长缓慢，整个发酵周期长达数周，因此给鉴定工作带来了巨大的时间成本。通过不依赖于传统发酵的分子生物学手段快速鉴定产埃博霉素的纤维堆囊菌目前尚未见文献报道。

参考文献

1.bollagdm,mcqueneypa,zhuj,etal.epothilones,anewclassofmicrotubule-stabilizingagentswithataxol-likemechanismofaction.cancerresearch,1995,55(11):2325.

2.gerthk,pradellas,perlovao,etal.myxobacteria:proficientproducersofnovelnaturalproductswithvariousbiologicalactivities—pastandfuturebiotechnologicalaspectswiththefocusonthegenussorangium.journalofbiotechnology,2003,106(2–3):233-253.

3.pronzatop.newtherapeuticoptionsforchemotherapy-resistantmetastaticbreastcancer:theepothilones.drugs,2008,68(2):139-146.

4.shimketsl,dworkinm&reichenbachh(2006)themyxobacteria.(dworkinm,ed)theprokaryotes3rded.berlin:springer,2006:31-115.

5.brennerd,kriegn&staleyj(2006)theproteobacteria(partc)：thealpha-,beta-,delta-,andepsilonproteobacteria.garritygm(ed),bergeysmanualofsystematicbacteriology2nded.newyork:springer,2005:1059-1144.

6.servicerf.tumor-killermade；howdoesitwork？science,1996,274(5295):2009.

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种不依赖于传统发酵的、用于快速鉴定纤维堆囊菌中埃博霉素基因簇阳性菌株的分子生物学方法。

本发明所述用于快速鉴定纤维堆囊菌中埃博霉素基因簇阳性菌株的分子生物学方法是通过选择性培养基对土壤中纤维堆囊菌进行富集和分离纯化、设计特异性点杂交分子探针并通过点杂交实验检测埃博霉素基因簇；设计特异性引物对检测埃博霉素基因簇中关键基因的转录水平；根据如下标准进行判定：当点杂交实验能够检测到明显的信号斑，同时荧光定量pcr实验检测到的埃博霉素基因簇中关键功能基因的ct值低于32时，则表明被检测菌株为埃博霉素基因簇阳性菌株，反之则为阴性菌株；其中，所述选择性培养基为cnst滤纸片培养基，配方为：硝酸钾0.5g/l，磷酸氢二钠0.63g/l，硫酸镁1.0g/l，氯化铁1mg/l，微量元素液1ml/l，琼脂粉15g/l，ph7.5±0.2，在cnst的固体平板上铺加灭菌处理的滤纸片作为唯一碳源，用于从中挑选能够降解滤纸片的菌株；其中，所述微量元素液配方为：mncl2·4h2o0.1g/l，cocl20.02g/l，cuso40.01g/l，na2moo4·2h2o0.01g/l，zncl20.02g/l，zncl20.02g/l，licl0.005g/l，sncl2·2h2o0.005g/l，h3bo30.01g/l，kbr0.02g/l，ki0.02g/l；

其特征在于：

所述特异性点杂交分子探针选用的是：埃博霉素基因簇中两段保守区域，即：nonribosomalpeptidesynthetase模块的peptidylcarrierprotein结构域，简称“nrps-pcp”；module8模块的te结构域，简称为“m8-te”；其中“nrps-pcp”探针长度为305bp，其核苷酸序列如seqidno.1所示，其上游引物序列为cggcaaacccgtctcgtg，其下游引物序列为ggcagccattgctccgtg；m8-te”探针长度为551bp，其核苷酸序列如seqidno.2所示，其上游引物序列为gcaccgtttgcgttagtagg，其下游引物序列为ggaggctgccatcattttg；

所述特异性引物对，是根据埃博霉素基因簇中8个保守区段的碱基序列而设计的8个特异性引物对，编号为s1～8，用于荧光定量pcr实验检测埃博霉素基因簇中关键基因的转录水平；其中：

所述s1引物对，上游引物序列为ggatccagcggctgctcgtg，下游引物序列为acgcgagatccgaaggtgtctga；

所述s2引物对，上游引物序列为gatcgcgcaagacctccggg，下游引物序列为gctggcaggggtcgaggcta；

所述s3引物对，上游引物序列为cggcaaacccgtctcgtg，下游引物序列为cttgcgagactccagcgcga；

所述s4引物对，上游引物序列为ttgctgctcgaccagacggc，下游引物序列为caccagctccccggcgctat；

所述s5引物对，上游引物序列为catccgctcctgcctgctcg，下游引物序列为caggcggctcctgctatgcc；

所述s6引物对，上游引物序列为ttcttcctccgcgggggctt，下游引物序列为agccatctgactgcgccgga；

所述s7引物对，上游引物序列为gcaccgtttgcgttagtagg，下游引物序列为tcggtctccatctccggggc；

所述s8引物对，上游引物序列为gctggataactcgcgggggc，下游引物序列为ggctcgccatcggggtcttc。

本发明公开了一种用于快速鉴定纤维堆囊菌中埃博霉素基因簇阳性菌株的分子生物学方法，相比于长达数周的传统鉴定方法，本发明提供的鉴定方法无需发酵，即能够实现快速、敏感、准确地鉴定纤维堆囊菌中埃博霉素基因簇阳性菌株，并且重复性好，大大降低了时间成本，应用前景广阔。

附图说明

图1.部分纤维堆囊菌形态照片。

其中：a6为分离自湖底泥样品的6号菌株，b1为分离自土壤样品的1号菌株，b4为分离自土壤样品的4号菌株，b6为分离自土壤样品的6号菌株。

图2.埃博霉素基因簇点杂交实验图。

其中：a1-6为分离自湖底泥样品的1-6号菌株，b1-6为分离自土壤样品的1-6号菌株，mx为阴性对照组，h2o为空白对照组。

图3.埃博霉素基因簇转录水平分析。

具体实施方式

下面结合本发明提供的用于快速鉴定纤维堆囊菌中埃博霉素基因簇阳性菌株的分子生物学方法，进一步描述其在用于鉴定能够代谢产生埃博霉素的纤维堆囊菌阳性菌株中的应用。所述内容是对本发明的解释而不是限定。

实施例1：纤维堆囊菌的富集及分离纯化

(1)称取0.1g左右的风干土壤样品，用称量纸包好后将样品敲碎。

(2)取少量样品粉末，将其均匀的洒在cnst滤纸片固体平板上(硝酸钾0.5g/l，磷酸氢二钠0.63g/l，硫酸镁1.0g/l，氯化铁1mg/l，微量元素液1ml/l，琼脂粉15g/l，ph7.5±0.2，121℃灭菌30min。在cnst的固体平板上铺加灭菌处理的滤纸片作为碳源)上，在不同温度(25℃、30℃、37℃)下进行培养，其中，微量元素液配方为：mncl2·4h2o0.1g/l，cocl20.02g/l，cuso40.01g/l，na2moo4·2h2o0.01g/l，zncl20.02g/l，zncl20.02g/l，licl0.005g/l，sncl2·2h2o0.005g/l，h3bo30.01g/l，kbr0.02g/l，ki0.02g/l。

(3)培养10-14天，当出现纤维堆囊菌生长的迹象后，挑取被降解的滤纸纤维转接到新的cnst滤纸片固体平板上。

(4)继续培养7-10天，在体视镜下观察，当观察到子实体以及菌膜扩展等现象后，用无菌接种针挑取菌膜部分转接至新的cnst滤纸固体平板上进行传代。

(5)由于纤维堆囊菌无法在lb固体培养基上生长，因此可以将纯化的纤维堆囊菌接种到lb固体平板上，30℃培养1-2天，若无杂菌生长则表明该菌株已纯化好；若lb固体平板上有杂菌生长，则表明该菌株仍然需要进一步纯化。

(6)消除细菌污染：将带有纤维堆囊菌的部分降解的滤纸片接入lb液体培养基中，200rpm、30℃培养过夜；取出滤纸用无菌水轻微冲洗2～3次，再将其放入含有氨苄青霉素(终浓度100ppm)的lb液体培养基中，200rpm、30℃培养过夜；最后取出滤纸转接至新的cnst滤纸固体平板上。

(7)消除具有孢子的杂菌：将纤维堆囊菌培养至子实体阶段，用无菌接种铲刮取少量子实体至1.5ml无菌离心管中，加入500μl的无菌水重悬，60℃水浴处理10～20min，10,000rpm离心后选择底部的菌体沉淀转接至新的cnst滤纸固体平板上。

(8)将分离得到的纤维堆囊菌在体视镜下观察，记录菌膜扩展，子实体形态、颜色等特征。

纤维堆囊菌的子实体和菌膜扩展形态在cnst滤纸固体平板上呈现出明显的菌株特异性。部分纤维堆囊菌形态照片见图1。

实施例2：点杂交实验检测埃博霉素基因簇

(1)利用细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取纤维堆囊菌的基因组dna。

(2)分子探针的获取

在埃博霉素基因簇中选择两端保守区域作为探针识别区域，分别是：nonribosomalpeptidesynthetase模块的peptidylcarrierprotein结构域，简称“nrps-pcp”；module8模块的te结构域，简称为“m8-te”。扩增探针的引物对序列信息如表1所示。

表1探针引物对序列信息

pcr扩增体系如表2所示，扩增条件如表3所示：

表2pcr扩增体系

表3pcr扩增条件

(3)pcr产物采用1.0％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，并送往青岛擎科梓熙生物技术有限公司进行测序验证。“nrps-pcp”探针长度为305bp，其核苷酸序列如seqidno.1所示，“m8-te”探针长度为551bp，其核苷酸序列如seqidno.2。

(4)探针的标记

取1μg探针加入pcr管中，用无菌去离子水补至16μl，将探针置于沸水浴中10min进行变性，然后置于冰上备用。将dig-highprime混合均匀，取4μl加入变性后的探针中，37℃孵育过夜。用65℃孵育10min终止反应。

(5)点杂交及显色反应

1)根据公式tm＝49.82+0.41×(％g+c)-(600/l)确定杂交的温度，其中l为能够杂交上的片段长度。

2)取合适大小的杂交膜，在上面点上1μl基因组dna，用uvp组合型hl-2000hybridizer分子杂交仪紫外交联30秒。

3)取适量digeasyhyb缓冲液(10ml/100cm²)置于杂交管中，预热到杂交温度，将已完成固定基因组的膜放入缓冲液中，温和震荡30秒。进行杂交。

4)取地高辛标记的探针放入沸水浴中5min，变性后立即置于冰上。

5)将变性的探针加入到预热的digeasyhyb缓冲液中，充分混匀，避免产生气泡。

6)弃去预杂交液，在膜上加入探针与digeasyhyb缓冲液混合物，震荡孵育12h。

7)使用2×ssc、0.1％sds在室温下连续震荡洗膜两次，每次5min。用预热到68℃的0.5×ssc、0.1％sds震荡洗膜两次，每次15min。

8)用洗涤缓冲液洗膜5min。

9)在100ml封闭液中孵育30min。

10)在20ml抗体溶液中孵育30min。

11)用100ml洗涤缓冲液洗涤2次，每次15min。

12)在20ml检测缓冲液中平衡5min。

13)在暗室里将膜避光置于底物显色液中，静置孵育至有明显目的条带出现，用去离子水洗膜5min停止反应。

用探针“m8-te”和“nrps-pcp”对12株纤维堆囊菌分离株的基因组dna进行dna点杂交分析。选用不含埃博霉素基因簇的黄色粘球菌作为阴性对照组，选用去离子h2o作为空白对照组。如果该菌株为埃博霉素基因簇阳性菌株，那么在杂交膜上能够观测到明显的信号斑，反之则为阴性菌株(图2)。

实施例3：埃博霉素基因簇转录水平检测

(1)纤维堆囊菌rna的提取

将纤维堆囊菌菌液用8000rpm离心5min回收菌体细胞，先后用depc水、5×buffer(95％的乙醇和5％的酸酚，ph4.5)洗涤。取50mg洗涤后的菌体细胞，加入50μl溶菌酶溶液(3mg/ml)，37℃水浴10min，每隔2～3min振荡混匀1次。后续按照svtotalrnaisolationsystem(promega)试剂盒提取纤维堆囊菌rna。

(2)引物设计

根据埃博霉素基因簇中8个保守区段的碱基序列而设计的8个特异性引物对，编号为s1～8，用于荧光定量pcr实验检测埃博霉素基因簇中关键基因的转录水平。特异性引物对序列信息如表4所示。选用16srrna基因作为内参基因。

表4引物序列信息

(3)反转录pcr

提取的rna用2％dnasei(fermentas)去除残留的dna。采用primescripttmrt-pcrkit(takara)进行反转录，步骤如下：

1)配置混合液：dntpmixture(10mmeach)1μl；一端的特异引物(2μm)1μl；模板rna(100pg-1μg)+rnasefreeh2o，8μl。pcr仪中65℃反应5min，置于4℃备用。

2)配置反转录反应液：上述反应液10μl；5×primescriptbuffer4μl；rnaseinhibitor(40u/μl)0.5μl；primescriptrtase(for2step)0.5μl；rnasefreeh2o5μl。在pcr仪中42℃反应20min；95℃热处理5min终止反应。

(4)荧光定量pcr

采用takara公司的试剂盒sybr@premixextaqtmii进行荧光定量pcr，利用罗氏荧光定量pcr仪(型号lightcycler480)计算ct值。选用不含埃博霉素基因簇的黄色粘球菌作为阴性对照组，选用去离子h2o作为空白对照组。荧光定量pcr反应体系如表5所示，pcr扩增条件如表6所示：

表5荧光定量pcr反应体系

表6pcr扩增条件

结果显示，阴性对照组的ct值为33.8，空白对照组的ct值未检测到。

上述s1～8区段的ct值分别为：s1＝20.15，s2＝22.11，s3＝21.55，s4＝21.73，s5＝20.55，s6＝20.27，s7＝19.03，s8＝18.75。如果埃博霉素基因簇中8个保守区段的关键功能基因的ct值低于32，则表明该菌株为埃博霉素基因簇阳性菌株，反之则为阴性菌株。利用2^-△△ct公式计算各个关键功能基因的转录差异，其中δδct＝实验组(目的基因ct-内参基因ct)-对照组(目的基因ct-内参基因ct)。结果如图3所示。

根据上述实验结果可以制定如下判定标准：

当点杂交实验能够检测到明显的信号斑，同时荧光定量pcr实验检测到的埃博霉素基因簇中关键功能基因的ct值低于32时，则表明被检测菌株为埃博霉素基因簇阳性菌株，反之则为阴性菌株。

序列表

<110>山东大学

<120>一种快速鉴定埃博霉素基因簇阳性菌株的方法

<141>2017-04-26

<160>2

<210>1

<211>305

<212>dna

<213>人工序列

<221>nrps-pcp

<222>（1）…（305）

<400>1

ggcagccattgctccgtgtgccggaagcggatctccttcagggtagatggatcggccttc60

atcgggagcatcggcggaggtgggagctcggcgatgcgccgcttccagtaatccatcgat120

cgttgatgcgcctcagacttcttgcgagactccagcgcgagtacatagtcgcggtacgag180

agctccaggacagggagagaggtctcgggatcttcgtagaagctgagccagtccttgaag240

atgatggacaggctgcctaggtcaacgttaatgagatcgatgctgagcacgagacgggtt300

tgccg305

<210>2

<211>551

<212>dna

<213>人工序列

<221>m8-te

<222>（1）…（551）

<400>2

ggaggctgccatcattttgcctcgaacgccgggcctgacgacgtcgtcttcgcggcgagc60

agcggattgagatgcgagtcgacgatgtgcatgatctcgcgacttcgatcgacgagaaac120

tcgtgatctccgggaaggagatgcatatagaagcgctccgtggtgcgagattgtagatcc180

tgaacgtcgcttggaggcacgatcacatcgtccgagccggcgatggcgacgatagggacc240

gcgatcttcacgggcggctccttcgagtccccgggggccggagccatcatcgtgtctgtg300

atgaccttgtctgcgcgagcatcggcctgaacttgttgggtggatcgcacgaaacccgcg360

gcatttcggaagaagagcttggctattatgtcggtctccatctccggggtgatctctgaa420

gaagagatcaagctgccgcccaacgtgaaaacggccagcggagccggtgcgccggaacga480

ctggcgagctccacggctgtccccatgacgaaccggacacccaggctgaaccctactaac540

gcaaacggtgc551