一种散囊菌的探针荧光定量PCR快速检测方法与流程

本发明涉及微生物检测
技术领域：
，尤其涉及一种散囊菌的探针荧光定量pcr快速检测方法。
背景技术：
：黑茶为后发酵茶，基本工艺流程是杀青、初揉、渥堆、复揉、烘焙。黑茶包括湖南黑茶、湖北青砖茶、四川藏茶(边茶)、安徽古黟黑茶(安茶)、云南黑茶(普洱茶)、广西六堡茶及陕西黑茶(茯茶)。部分地区黑茶在渥堆发酵过程中会出现“金花”现象，而这“金花”为散囊菌的金黄色孢子。散囊菌属在生长过程中能产生淀粉酶、氧化酶及其他次级代谢产物，能够改善茶的色泽、口感及功能特性。金花(即散囊菌)越多，品质越好。目前关于茶叶中微生物的测定局限于传统的平板计数法和梯度凝胶变性电泳(dgge-pcr)技术。对于茶叶中散囊菌微生物数目的测定，目前有以下几种方法：1.传统的平板计数法该方法操作过程为：①用灭菌水对茶叶表面微生物进行洗脱。②将上述洗脱液置于灭菌平板中恒温培养一段时间。③待微生物长出菌落，数出菌落数量，按公式计算茶叶表面含有微生物数量。该方法操作繁琐、耗时较长、只能计算活菌数，数菌落工程中主观性强。不能准确反应菌株的定值状况。2.梯度凝胶变性电泳(dgge-pcr)技术梯度凝胶变性电泳(dgge-pcr)技术的原理是不同的双链dna片段因其序列组成不一样，所以其解链区域及解链条件变性剂使用浓度也不相同。长度相同、序列不同的dna片段在不同浓度的变性剂条件下不同位置发生部分解链，迁移到胶体的不同位置，从而被区分开来。该方法的操作过程为：微生物总基因的提取—18srrna可变区扩增—梯度变性凝胶电泳—染色成像—切胶回收—转化克隆—测序比对，分析数据可得到每个茶叶样品中菌系组成和显色条带的菌的相对含量。dgce—pcr侧重于茶叶样品中微生物多样性的分析，能够反映茶叶菌群构成与多样性，该方法可准确定性，但其通过对比dna条带的明暗度半定量分析方法不能够达到准确定量的目的。电泳过程涉及剧毒试剂，严重影响实验者身体健康。电泳结束后的数据分析、处理过程复杂，在测序比对这一步会产生大量的费用，不是一种准确快捷的定值能力测定方法。分子生物学技术是一项对微生物免培养检测的新技术，实时定量pcr，是指在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量pcr有如下显著的优点：①特异性好，使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性。同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。②灵敏度高，荧光pcr检测技术是综合了pcr技术、荧光标记技术、激光技术、数码显象技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。③线性关系好、线性范围宽，由于荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应的关系，通过荧光信号的检测可以直接对产物进行定量；定量范围可在0-1010拷贝/毫升。④操作简单、安全、自动化程度高、防污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易污染；同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，不再需要担心放射性污染。在实时定量荧光pcr反应体系中，加入荧光基团或荧光染料，随着反应的进行，pcr反应产物不断累计，荧光信号强度逐渐增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，通过荧光强度的变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数增长阶段和非指数平台阶段。在荧光信号指数增长阶段，pcr产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，qrt-pcr结果是可以准确地反映反应体系中模板的初始量。为了便于对所检测样本进行比较，在荧光信号指数增长阶段，首先需设定一个荧光信号的域值，这个域值(threshold)一般是以pcr反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline)。ct值是扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。ct值主要由扩增反应体系中模板的初始浓度决定的。通常用不同浓度的标准样品的ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。方程式的斜度可以用来检查pcr的效率。实时荧光定量pcr仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。国外学者应用多重荧光定量pcr法对空气中的微生物的多样性及所占比率进行，发现空气中微生物很多，其中包括散囊菌属。目前尚未发现应用探针法实时荧光定量pcr技术对茶叶中散囊菌属进行计数的相应研究或报道。技术实现要素：本发明的目的在于：针对上述存在的问题，提供一种散囊菌的探针荧光定量pcr快速检测方法，本发明方法克服了传统平板培养法的局限性和耗时长，dgce-pcr法的操作繁琐和工作量大、费用高等缺陷，具有快速、准确、高通量、灵敏度高且特异性强的特点。为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种散囊菌的探针荧光定量pcr快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)菌株dna提取纯种培养散囊菌属微生物，收集其菌丝，进行散囊菌属基因组dna的提取，得到dna溶液；(2)特异性引物及荧光探针设计正向引物forwardprimereamstf1：5'-gtggcggcaccatgtct反向引物reverseprimereamstr1：5'-ctggttaaaaagattggttgcga荧光探针的序列probeeamstp1：5’-cagctggacctacgggagcggg探针修饰：6-fam\eclipse(3)引物特异性检测用步骤(1)提取得到的dna溶液，以ddh2o为阴性对照，检测步骤(2)的特异性引物的特异性；(4)标准曲线的建立将已知浓度的质粒标准品进行10倍梯度稀释，即稀释浓度分别为2.0×107，2.0×106，2.0×105，2.0×104，2.0×103，2.0×102，2.0×101copies/μl；每个稀释度平行三次，同时以无菌水为模板作为阴性对照；通过实时荧光定量pcr扩增，检测引物灵敏度，并以拷贝数对数值为x轴，以ct值为y轴，构建实时荧光定量pcr标准曲线，并确定其灵敏度；(5)茶样dna提取(a)将茶样预处理，得到菌丝体，备用；(b)将上述菌丝体加入装有1ml裂解液的离心管中，静置5min；然后震荡混匀，在90～100℃恒温水浴8-15min；(c)水浴后，将上述混合液在4℃，12000rpm的条件下离心2min；然后取上清液，得到茶样dna提取液，在-20℃条件下保存备用；(6)茶样中散囊菌的数目检测将步骤(5)得到的茶样dna提取液中真菌菌丝基因组dna为模板，采用步骤(3)中的特异性引物进行荧光定量pcr扩增，得到不同样品荧光定量pcr的ct值，带入步骤(4)中标准曲线方程中，计算出拷贝数，通过换算，即可得到茶样中散囊菌属的数目。较佳地，在步骤(1)，所述菌株dna提取，包括如下步骤：(a)往经高温灭菌、预冷的研钵中倒入液氮，再加入0.05～0.15g散囊菌菌丝样品，待液氮完全挥发后，快速研磨样品至粉末状，得到菌丝粉末；(b)将菌丝粉末放于离心管中，加入150～250μlbufferdigestion、1～3μlβ-巯基乙醇和10～30μlproteinasek溶液，震荡混匀后，50～60℃恒温水浴0.5～1.5h；(c)往上述水浴后的离心管中加入80～120μlbufferpf，混匀后于-15～-25℃的条件下静置3-6min；然后室温10000rpm离心5min，取上清液；(d)往取出的上清液中加入150～250μlbufferbd混匀后，再加入150～250μl无水乙醇，混匀后，将溶液和半透明纤维状悬浮物全部移至收集管的吸附柱内，静置1-5min，然后10000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液；(e)将吸附柱放回收集管，加入400～600μlpwsolution，10000rpm离心30s倒掉收集管中的废液；再加入400～600μlwashsolution，10000rpm离心30s倒掉收集管中的废液，然后于室温12000rpm离心2min，离去残留的washsolution，擦净管口；(f)取出上述吸附柱，放入新的离心管中，加入40-60μltebuffer静置3min，12000rpm室温离心2min，然后收集dna溶液，在-20℃条件下保存备用。较佳地，在步骤(3)，所述引物特异性检测的反应体系和反应条件为：(a)反应体系：使用eppendorf荧光定量pcr仪器进行，每个样品取1μl作为模板；25μl的荧光定量pcr反应体系含有成分如下：premiextaqtm，12.5μl；引物f，0.5μl；引物r，0.5μl；dna模板，2μl；6-fam修饰探针，0.1μl；dh2o，25μl；(b)反应条件：95℃预变性30s，1个循环：95℃变性5s、55℃退火10s、72℃延伸20s，45个循环。较佳地，在步骤(4)，所述质粒标准品的制备方法为：采用上述散囊菌属基因组为模板，采用步骤(3)中特异性引物，进行普通pcr，得到产物进行切胶回收，将切胶回收的目的dna片段经过转导转化，制备成质粒标准品，并测定质粒浓度，计算出质粒标准品拷贝数。较佳地，所述质粒标准品拷贝数的计算公式为：拷贝数＝6.02×1023×浓度×10-9/(扩增碱基数×660)。较佳地，在步骤(5)，所述茶样预处理由以下步骤组成：称取茶叶样品各20g倒入经灭菌的锥形瓶中，室温下150rpm振荡30min，将液体转移至50mi离心管中，在4℃条件下，10000r/min离心10min，去除上清液，收集沉淀，用灭菌生理盐水冲洗锥形瓶中茶叶；重复上述步骤4次，将得到的沉淀物用1.0ml灭菌生理盐水悬浮，得到菌丝体，备用。较佳地，所述灭菌为往锥形瓶中加入生理盐水和玻璃珠后，进行高压蒸汽灭菌。较佳地，所述茶样为茯茶、千两茶、黑砖茶、青砖茶、边茶、安茶、普洱茶或六堡茶。本发明是申请人在前期研究基础上，从广西壮族自治区梧州市的六堡茶中鉴定了多株“金花”菌，证明其都同属散囊菌属，而非单一的冠突散囊菌，从而建立依据金花六堡茶中的散囊菌属为特征指标的实时荧光定量pcr的定量方法，进而也建立金花黑茶中散囊菌数目的快速定量方法。综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：本发明方法改善了传统定量pcr劳动强度大、定量不准确、重复性差的缺点，也克服了传统平板培养法的局限性和耗时长，dgce-pcr法的操作繁琐和工作量大、费用高等缺陷，其应用特异性引物，通过一次荧光定量pcr将模板中的对应种属的菌株绝对定量，具有特异性强、耗时短、操作方便、定量准确的特点，能很好的应用于茶叶中菌株的定量测定。进而通过茶叶中散囊菌数量的测定，快速确定该黑茶是否为金花黑茶，从而建立对金花黑茶的快速鉴伪方法。附图说明图1梯度稀释质粒标准品扩增曲线图；图2散囊菌荧光定量pcr检测方法的标准曲线图；图3荧光定量法灵敏度检测图；图4荧光定量法特异性检测图；图5六堡茶样品荧光定量pcr扩增曲线图；图6六堡茶样品初始散囊菌数目图。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下参考附图，并举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。本发明所选用的原料均可以在市面上购买；其中：裂解液即为dna提取液，该试剂盒由宝生物工程有限公司生产，试剂盒英文全称：mightyprepreagentfordna宝生物公司生产，产品编号：9182。premiextaqtm即探针法荧光定量pcr反应专用试剂，购自宝生物工程有限公司，产品编号：rr390q。rnase，即rna酶。购自索莱宝生物公司，产品编号：r1030。proteinasek，即蛋白酶k，购自索莱宝生物公司，产品编号：p1120。bufferdigestion(缓冲消化液)，bufferpf(缓冲液pf)，bufferbd(缓冲液bd)，pwsolution(溶液pw)，washsolution(洗液)及tebuffer(te缓冲液)均购自ezup柱式真菌基因组dna抽提试剂盒，产品编号：b518259-0050生产厂家：生工生物工程(上海)股份有限公司。solutioni*，pmd19-t载体、controlinsertdna*2均来自厂家宝生物工程有限公司，试剂盒名称：pmd19-tsimplevector，产品编号：d104a。jm-109感受态细胞，soc培养基，均购自宝生物大肠杆菌(jm109)感受态细胞试剂盒，产品编号：9052，厂家：宝生物工程有限公司。x-gal，即用型溶液，厂家：生工生物工程(上海)股份有限公司，规格编号：b541006-0001。iptg即用型溶液，厂家：生工生物工程(上海)股份有限公司，规格编号：b541007-0001。amp灭菌氨苄青霉素钠溶液，产品编号：b540722-0010厂家：生工生物工程(上海)股份有限公司。solutioni，solutionii，solutioniii，spincolumn：核酸纯化柱，bufferwa，bufferwb均购自takara质粒dna小量纯化试剂盒产品编号：9760厂家：宝生物工程有限公司。本发明所选用的特异性引物及荧光探针序列，为参考期刊《epatechnologyformoldidentificationandenumeration》，第7-8页所述的特异性引物和探针序列，内容为：eurotium(aspergillus)amstelodami/chevalieri/herbariorum/rubrum/repens(assayname：eamst)forwardprimereamstf1：5'-gtggcggcaccatgtctreverseprimereamstr1：5'-ctggttaaaaagattggttgcgaprobeeamstp1：5’-cagctggacctacgggagcggg一、实施方法(1)菌株dna提取进行散囊菌属基因组dna的提取，得到dna溶液；具体步骤如下：(a)纯种培养散囊菌属微生物，收集其菌丝；(b)将洁净且干燥的研钵、研磨棒及钥匙用锡箔纸包裹严实，进行高温灭菌，研磨前，先倒适量液氮于研钵中，对研钵和研磨棒进行预冷；(c)待液氮挥发干，再倒适量液氮于研钵中，称取0.10g菌丝样品，加入研钵中，待液氮完全挥发，快速研磨样品至粉末状，得到菌丝粉末；(d)用钥匙刮取菌丝粉末于1.5ml离心管中，于离心管底部正上方加入200μlbufferdigestion和2μlβ-巯基乙醇，再加入20μlproteinasek溶液，震荡混匀后，56℃恒温水浴1h至细胞完全裂解；水浴过程中，每10min混匀一次离心管，混匀方法：用手指弹拨离心管底端至液体为均一液体；(c)往上述水浴后的离心管中加入100μlbufferpf，混匀后于-20℃的条件下静置5min；然后室温10000rpm离心5min，取上清液，将其转移到新的1.5ml离心管中；(d)往取出的上清液中加入200μlbufferbd混匀后，再加入200μl的无水乙醇，充分混匀后，将溶液和半透明纤维状悬浮物全部移至收集管的吸附柱内，静置2min，然后10000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液，用洁净纸片擦干收集管口的废液；(e)将吸附柱放回收集管，加入500μlpwsolution，10000rpm离心30s倒掉收集管中的废液，擦净管口；将吸附柱放回收集管，加入500μlwashsolution，10000rpm离心30s倒掉收集管中的废液，擦净管口；然后将吸附柱重新放回收集管中，于室温12000rpm离心2min，离去残留的washsolution，擦净管口；(f)取出上述吸附柱，放入新的1.5ml离心管中，加入50μltebuffer静置3min，12000rpm室温离心2min，然后收集dna溶液，在-20℃条件下保存备用。(2)特异性引物及荧光探针设计本发明所选用的特异性引物及荧光探针序列，为参考期刊《epatechnologyformoldidentificationandenumeration》，第7-8页所述的特异性引物和探针序列。正向引物forwardprimereamstf1：5'-gtggcggcaccatgtct反向引物reverseprimereamstr1：5'-ctggttaaaaagattggttgcga荧光探针的序列probeeamstp1：5’-cagctggacctacgggagcggg探针修饰：6-fam\eclipse(3)引物特异性检测用步骤(1)提取方法得到的dna溶液，以ddh2o为阴性对照，检测步骤(2)的特异性引物的特异性；实时荧光定量pcr反应体系：使用eppendorf荧光定量pcr仪器进行，每个样品取1μl作为模板。反应体系及反应条件如下：(a)反应体系：使用eppendorf荧光定量pcr仪器进行，每个样品取1μl作为模板；25μl的荧光定量pcr反应体系含有成分如下：premiextaqtm，12.5μl；引物f，0.5μl；引物r，0.5μl；dna模板，2μl；6-fam修饰探针，0.1μl；dh2o，25μl；(b)反应条件：95℃预变性30s，1个循环：95℃变性5s、55℃退火10s、72℃延伸20s，45个循环。(4)标准曲线的建立(a)质粒标准品的制备采用上述散囊菌属基因组为模板，采用步骤(3)中的特异性引物，进行普通pcr，得到产物进行纯化回收，纯化回收具体步骤参照试剂盒天根通用型dna纯化回收试剂盒(离心柱型)操作步骤；将纯化回收的目的dna片段经过转导转化，制备成质粒标准品，并测定质粒浓度，计算出质粒标准品拷贝数。具体步骤如下：1)pmd载体连接将散囊菌基因组连接入pmd载体中，在微量离心管中加入表1所示物质，全量为5μl；然后加入5ul的solutioni*；16℃反应30min。表1试剂使用量pmd19-t载体1ulcontrolinsertdna*21uldh2oupto5ul2)导入jm-109感受态细胞a)将感受态细胞使用前在冰上融化，轻微混合，取100μl上述jm109感受态细胞于4ml离心管中；b)将10ul上述连接载体加入到100uljm109感受态细胞中，冰中放置30min，用无菌水设置阴性对照；c)42℃加热60s后，再在冰上放置1min，加入890ulsoc培养基，37℃条件下振荡培养60min，振荡频率：180rpm；d)然后在含有x-gal、ipgt、amp的lb-琼脂平板培养剂上培养，形成单菌落，37℃过夜培养；在超净工作台中，从长有菌落的lb平板上挑取3个白色阳性菌落和1个蓝色阴性菌落，分别接种于装有4mllb氨苄培养液的a、b、c和d试管内，于37℃震荡15h；e)配制25μl上述步骤(3)的反应体系，进行pcr，其条件及体系与普通pcr一致，电泳及凝胶成像，再进行阳性重组质粒测序。3)质粒提取及浓度检测a)将上述a、b、c及d试管的菌落培养液进行过夜培养15h，并取出菌落长势较好的2种菌落培养液，再从该2种菌落培养液中分别取出1.5ml的菌落培养液，12000rpm离心2min，以沉淀菌种，弃上清；b)用250ul的solutioni(含rnasea)充分悬浮细菌沉淀，加入250ul的solutionii用手指弹动离心管底端，使菌体充分裂解，形成透明溶液，加入350ul的4℃的预冷的solutioniii，用手指弹动离心管底端，使菌体充分裂解，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2min；c)室温12000rpm离心10min，取上清液，将试剂盒中的spincolumn安置于离心管中，然后将上清液转移至spincolumn中，12000rpm离心1min，弃滤液；d)将500ul的bufferwa加入spincolumn中，12000rpm离心30s，弃滤液；e)将700ul的bufferwb加入spinculumn中，12000rpm离心30s，弃滤液，重复一次；f)重新将spinculumn安置于收集管上，12000rpm，离心1min。除尽残留洗液，将spinculumn安置于新的1.5mld的离心管上，在spinculumn膜的中央处加入30ul灭菌蒸馏水，室温静置1min，12000rpm离心1min洗脱dna，-20℃保存，备用；g)用nanodrop(超微量紫外分光光度计)检测质粒原液的浓度及纯度，计算其拷贝数(copies/ml)，计算公式：拷贝数＝6.02×1023×浓度×10-9/(扩增碱基数×660)4)标准曲线绘制将上述已知浓度的质粒标准品进行10倍梯度稀释，即稀释浓度分别为2.0×107，2.0×106，2.0×105，2.0×104，2.0×103，2.0×102，2.0×101copies/μl；每个稀释度平行三次，同时以无菌水为模板作为阴性对照；通过实时荧光定量pcr扩增，检测引物灵敏度，并以拷贝数对数值为x轴，以ct值为y轴，构建实时荧光定量pcr标准曲线，并确定其灵敏度。(5)茶样dna提取(a)将茶样预处理，得到菌丝体，备用；茶样预处理的具体步骤为：取500ml锥形瓶装100ml生理盐水(质量分数为0.85％naci)和少量玻璃珠，高压蒸汽灭菌；称取茶叶样品各20g倒入经灭菌的锥形瓶中，室温下150rpm振荡30min，将液体转移至50mi离心管中，在4℃条件下，10000r/min离心10min，去除上清液，收集沉淀，用灭菌生理盐水冲洗锥形瓶中茶叶；并重复振荡、离心、收集沉淀及生理盐水冲洗茶叶的上述步骤4次，将得到的沉淀物用1.0ml灭菌生理盐水悬浮，得到菌丝体，备用；(b)将上述菌丝体加入装有1ml裂解液的离心管中，静置5min；然后震荡混匀，在95℃恒温水浴10min；(c)水浴后，将上述混合液在4℃，12000rpm的条件下离心2min；然后取上清液，得到茶样dna提取液，在-20℃条件下保存备用。(6)茶样中散囊菌的数目检测将步骤(5)得到的茶样dna提取液中真菌菌丝基因组dna为模板，采用步骤(3)中的特异性引物进行荧光定量pcr扩增，得到不同样品荧光定量pcr的ct值，带入步骤(4)中标准曲线方程中，计算出拷贝数，通过换算，即可得到茶样中散囊菌属的数目。二、测试结果(1)标准曲线用dh2o按10倍梯度稀释的质粒标准品，取拷贝数为2.0×107-2.0×102copies/ul的6个梯度的标准品进行荧光定量pcr反应，得到相应梯度的扩增曲线，如图1所示为梯度稀释质粒标准品扩增曲线图。系统根据各个梯度的ct值自动拟合出标准曲线，以ct值为纵坐标，起始拷贝数为横坐标做回归曲线，即为散囊菌荧光定量pcr检测方法的标准曲线，如图2所示。本发明所指系统为takaratp800宝生物荧光定量检测仪内部自带系统。所得的标准曲线为：y＝-3.683×log(x)+42.39。该曲线斜率为-3.683，纵坐标截距为42.39，相关系数r2＝0.999，扩增效率为86.1％，cq值和浓度之间呈现良好的线性关系。(2)引物及探针的灵敏性检测用10×倍稀释的标准质粒(2.0×101copies/ul和2.0×100copies/ul)为模板，按照上述荧光定量反应条件进行灵敏性检测。如图3所示为荧光定量法灵敏度检测图，由图可知最低检测限为2.0×100copies/ul，即每个反应需要2个拷贝，检测以上的浓度均出现良好的扩增信号，空白对照没有扩增信号。(3)荧光定量pcr特异性分析选取10种真菌，包括4中散囊菌及6种非散囊菌，以赤散囊菌(eurotiumrubrum)，匍匐散囊菌(eurotiumrepens)，雪黄散囊菌(eurotiumniveoglaucum)，阿姆斯特丹散囊菌(eurotiumamstelodami)dna为模板，以ddh2o为阴性对照，同上条件进行实时荧光定量pcr反应，分析该方法的特异性；如图4所示为荧光定量法特异性检测图，经检测，雪黄散囊菌、阿姆斯特丹散囊囊菌、赤散囊囊菌、匍匐散囊菌通过菌株扩增为阳性，而黑曲霉菌、米曲霉菌、塔宾曲霉菌、产黄曲霉菌、桔青霉菌、溜曲霉菌均未出现荧光信号，扩增结果为阴性，空白对照ntc为阴性，说明该引物及探针对散囊菌属的检测具有良好的特异性。(4)荧光定量法重现性检测分别取2μl上述系列稀释后的标准质粒作为模板，同上条件进行探针法实时荧光定量pcr反应，每个稀释梯度标准质粒做3个复孔。如表2所示为taqman探针实时荧光定量pcr检测散囊菌的重现性检测结果。表2上表中x为平均值，sd为标准差，cv为变异系数。由表2可知，该方法的cv值在0.10％～0.98％之间，小于1％。(5)茶叶中散囊菌检测结果参照实施方法中的步骤(5)对茶叶(以六堡茶为例)进行预处理及dna提取，同上条件进行探针法实时荧光定量pcr反应，如图5所示为六堡茶样品荧光定量pcr扩增曲线图，图6为六堡茶样品初始散囊菌数目。表3为六堡茶样品初始样品散囊菌数目。表3茶样名称拷贝数copies/2l初始数目(cfu/g)苍顺六堡茶333174.509229210金花黑茶六堡茶331741.509189515梧州六堡茶(1910#)231841.706422207三鹤六堡茶(锡箔装)172813.404787074三鹤六堡茶071213652.61378188梧州六堡茶(1916#)14263.07395098中茶六堡茶11972.82331657三鹤六堡茶1709151.464195六堡茶成品茶(篓)108.062993由图5、图6及表3可知，本发明的方法能准确、快速测定茶叶中散囊菌的数目，本发明方法检测特异性强、灵敏性高，能在较短的时间内得出实验结果，大大减少工作量和工作时间，值得推广应用。本发明的散囊菌的探针荧光定量pcr快速检测方法，可应用于所有的黑茶，包括但不限于湖南黑茶(茯茶、千两茶、黑砖茶、三尖)、湖北青砖茶、四川藏茶(边茶)、安徽古黟黑茶(安茶)、云南黑茶(普洱茶)、广西六堡茶及陕西黑茶(茯茶)。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12