本发明属于法医遗传学领域，涉及检测人类基因组中具有良好法医学应用价值的snp遗传标记，具体涉及一种基于高通量并行测序技术的273个snp位点的检测试剂盒及其应用和检测方法。
背景技术：
基于毛细管电泳技术(capillaryelectrophoresis,ce)的pcr-str复合荧光扩增检测是目前采用的主要技术手段。其中，str基因座由于多态性高、检测技术均一等优点被认为是法医dna鉴定中通用性最高的遗传标记。目前，法医学dna数据库大部分均围绕str基因座展开。但是，随着str基因座在法医dna分析中的广泛应用，其缺陷也日益受到学界关注。如str基因座的高突变率不利于亲权鉴定的结果解释；pcr扩增子较长不易实现对降解检材的dna分型；str基因座的数量有限不利于复杂亲缘关系的鉴定等；ce技术中目前可供选择的荧光素数量有限，无法实现大量str基因座的并行检测。
snp(singlenucleotidepolymorphism,单核苷酸多态性)作为第三代遗传标记，应用于法医学实践的优越性已越发显著。与str(自发突变率为10-3～10-5)相比，snp具有相对较低的自发突变率(10-8)；而单个的snp位点扩增产物可以控制在200bp以下，容易实现多个位点的复合扩增，并有利于降解检材的分型；二等位基因的特性也使其分型结果的分析简便易行，更加容易完成向自动化的转变。然而snp分型采用的技术平台无论是minisequencing(核心是单碱基延伸)、连接反应还是质谱分析，均最多只能完成几十个遗传标记的并行检测，获取有效信息的能力受限。
高通量并行测序技术(massivelyparallelsequencing,mps)，为解决这一科学问题提供了方法学上的前景：与传统的ce技术相比，mps技术可以对多达几千个snp进行并行检测，节约检测样本量及检测时间；与barcode技术相结合，可以对多样本并行检测；文库构建时依赖pcr技术，但无需电泳及荧光标记，可将引物设计的尽可能短，进一步提高降解检材的分型成功率；对序列内部碱基的深度读取，可提高法医学混合样本的分析能力。美国thermofisherscientific公司在iontorrentpgmtm测序平台已推出两款商业化snp检测试剂盒，一是用于个体识别的“precisionididentitypanel”，试剂盒中共含有124个snp位点，主要针对欧洲人群，部分位点在中国人群中多态性差；另一个是用于族源信息推断的“precisionidancestrypanel”，不适用于个体识别和亲缘鉴定。美国illumina公司在miseq平台上推出可同时检测str和snp遗传标记的检测试剂盒forenseqdnasignature，其中含有95个用于个体识别的snp位点，24个用于表型鉴定的位点，56个先祖snp位点。上述snp位点的筛选基于欧洲人群，在中国人群中检测效能受限，同样无法满足法医学个体识别和亲缘鉴定的需求。另外，以往针对法医学snp位点的研究及相关专利申请，均集中于最多几十个snp的检测体系构建，且集中针对一类染色体进行标记的检测(常染色体，x染色体或者y染色体)。
因此，建立一套针对中国人群并覆盖人类全基因组的高多态性snp检测体系，用于满足个体识别及亲权鉴定的需求，并为复杂疑难案件的解决提供更多的技术检测手段具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种基于高通量测序平台的可同时检测273个覆盖人类基因组snp遗传标记的检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一方面，本发明提供一种基于高通量测序的snp位点的检测试剂盒，该检测试剂盒用于检测273个snp位点，其中所述273个snp位点中的234个位于常染色体上、9个位于y染色体上、30个位于x染色体上。
为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
优选地，所述273个snp位点信息如表1所示。
优选地，该检测试剂盒包含由273个snp位点的引物对的引物组合物，所述引物组合物的序列如seqidno：1-seqidno：546所示。该snp位点的扩增引物序列如表2所示。
表1：本试剂盒中所包含的snp位点信息
表2：本试剂盒中273个snp位点的扩增引物序列
优选地，该检测试剂盒还包括自行编写的bed文件，所述bed文件用于snp位点的结果分析；该bed文件可用于高通量测序仪测序软件(或插件)使用，或采用自行编写插件进行273个snp位点的分型。该bed文件如下：
另一方面，本发明提供一种上述snp位点的检测试剂盒在三联体亲子鉴定、二联体亲子鉴定、祖孙鉴定、同胞鉴定以及个体识别司法鉴定领域中的应用。
最后，本发明还提供一种上述snp位点的检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
步骤1)取样本dna于pcr扩增体系中，采用聚合酶链式反应进行文库的构建；
步骤2)对步骤1)中构建的文库进行纯化和定量；
步骤3)对步骤2)定量后的文库进行接头和测序引物的连接；
步骤4)对步骤3)制备的文库在高通量测序平台完成测序；
步骤5)采集测序信号，采用自行编写的bed文件对步骤4)获取的测序文件进行质控及结果分析。
为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
优选地，所述样本dna采集于血液(斑)、唾液(斑)、精液(斑)、毛发、组织等人类生物检材；或者，可选的，所述样本dna为标准品，如女性标准品dna9947a，男性标准品9948等。
优选地，所述步骤1)中pcr扩增体系包括pcr反应缓冲液、如seqidno：1-seqidno：546所示序列的引物组合物、taq聚合酶以及去离子水。
优选地，所述步骤1)中聚合酶链式反应的扩增程序为：95℃预变性11min；94℃30s，60℃60s，70℃60s，22个循环；60℃延伸30min。
优选地，所述步骤2)中的纯化采用ampure磁珠完成，所述步骤2)中的定量可采用qubit或qpcr方式。
优选地，所述步骤4)中的高通量测序平台包括iontorrent或者miseq。
优选地，所述步骤5)中的结果分析为针对fasta格式测序信息采用自行编写插件进行273个snp位点的结果分型。
本发明所述试剂盒包含的273个snp位点分别位于常染色体(234个)、y染色体(9个)、x染色体(30个)，在中国主要人群中均具有良好的遗传多态性和个体识别能力，其中常染色体snp位点在各染色体上平均分配，位点之间的平均物理距离约为10mb。灵敏度检测显示，10-1ngdna进行文库构建时，分型成功率为100％。试剂盒中含有的234个常染色体snp位点组成的检测系统用于个体识别的累积个体识别率为1-1.49e-62，用于二联体亲权鉴定的累积非父排除率为1-2.98e-12，用于三联体亲权鉴定的累积非父排除率为1-3.51e-23，非常适合在法医学个体识别和亲缘鉴定中应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
(一)试剂盒中snp位点的选择原则
(1)筛选snp数据库：hapmap(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)、1000genomes(http://www.1000genomes.org/home)、dbsnp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)、snpforid52-plex在线数据库(http://spsmart.cesga.es/snpforid.php)；司法鉴定技术规范《法医snp分型与应用规范sf/zjd0105003-2015》、已发表的关于亚洲或者中国汉族人群的snp研究文献；
(2)根据hapmap数据库(#28，phases2&3)筛选在北京汉族人群(chb)中maf>0.3，位于内含子区域的常染色体snp位点；要求snp符合hardy-weinberg平衡定量；与数据库中其它10个人群(asw、ceu、chd、gih、jpt、lwk、mex、mkk、tsi和yri)的遗传差异小(fst<0.06)；
(3)候选snp位点间物理距离>5mb；与目前中国市场已有商业化试剂盒中包含的str基因座之间物理距离>5mb；位点不落在拷贝数变异区域(copynumbervariants,cnv)；位点侧翼序列(±120bp)的gc含量在30-60％之间；侧翼序列(±15bp)不含有多聚碱基及插入缺失遗传标记(insertion/deletion,indel)。
(二)文库构建
各snp位点的文库构建引物序列见表2。文库的构建采用聚合酶链式反应，反应体系为20μl。文库构建条件：95℃预变性11min；94℃30s，60℃60s，70℃60s，22个循环；60℃延伸30min。
(三)测序及数据分析
构建文库完成纯化和定量后，连接接头及测序引物，根据检测样本量选择在高通量测序平台(美国thermofisherscientific公司的iontorrent或者美国illumina公司的miseq)完成测序；
采用自行编写的bed文件进行质控及结果分析。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种基于高通量测序技术对人类基因组273个snp位点进行并行检测的试剂盒，包括文库构建、测序质控及结果分析等。本发明利用了高通量测序技术对snp位点进行并行测序，在读取位点信息的同时可以获取侧翼序列变异信息；单次测序可以获取多达384个样本在273个snp位点的序列信息，节约dna样本量及检测时间；片段文库集中于200bp以下，适用于法医学降解检材。
附图说明
图1为编写插件对高通量测序snp位点的分析结果。
具体实施方式
本发明所述的snp位点的检测试剂盒的主要成分包括：pcr扩增体系和样本dna(可为标准品dna9947a、标准品dna9948)，pcr扩增体系具体包括2.5×pcr反应缓冲液ⅱ(ris-hcl、kcl、mgcl2、dntp)、5×引物组合物(273个snp位点的文库构建引物对，序列为seqidno：1-seqidno：546所示)、taq聚合酶(具有热稳定性的dna聚合酶)以及去离子水。文库构建体系包含5μl2.5×pcr反应缓冲液ⅱ、2μl5×引物组合物，2utaq聚合酶，10ng-1ng的样本dna(可为1μl标准品dna9947a(10ng/μl)或1μl标准品dna9948(10ng/μl))以及11μl去离子水。其中，273个snp位点的位点信息如上述表1所示，273个snp位点的扩增引物序列如上述表2所示。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例为标准品dna9948的分型结果。
其检测方法如下：
步骤1)取1μl标准品dna9948(10ng/μl)进行文库构建，pcr体系为20μl，其中含5μl2.5×pcr反应缓冲液ⅱ，2μl5×引物混合物，1μltaq聚合酶(2u)，1μl标准品dna9948及11μl去离子水。文库构建pcr条件：95℃预变性11min；94℃30s，60℃60s，70℃60s，22个循环；60℃延伸30min。
步骤2)对步骤1)构建的文库进行纯化和定量。纯化采用ampure磁珠完成，定量可采用qubit或qpcr方式。本次采用qpcr完成文库定量。
步骤3)对步骤2)定量后文库进行接头和测序引物的连接。
步骤4)对步骤3)制备的文库在高通量测序平台(美国thermofisherscientific公司的iontorrent或美国illumina公司的miseq)完成测序。
步骤5)采集测序信号，采用自行编写的bed文件对步骤4)获取的测序文件进行质控及结果分析；其具体为针对fasta格式测序信息采用自行编写插件进行273个snp位点的结果分型。分析插件包含snp测序质控，其结果如图1所示。标准品dna9948分型结果见下表，可用于其它实验室参考。
实施例2
本实施例为本发明所述的snp位点的检测试剂盒在三联体亲缘鉴定疑似突变现象中的应用。
一例三联体亲缘检测案件，涉及生母-孩子(女)-可疑父。采用实施例1所述的检测方法操作。
基于ce技术的str检测结果：采用常规pcr-ce检测试剂盒goldeye20a(北京基点认知生物有限公司)对19个常染色体str基因座进行检测，发现生母与孩子在19个str基因座上完全符合孟德尔遗传定律，可疑父与孩子在2个str基因座(vwa和fga)发生一步突变。通过计算，累积亲权指数cpi为378.361，根据三联体亲子鉴定标准，无法判断可疑父与孩子之间存在亲子关系。补充检测其他3个辅助str检测商业化试剂盒(goldeye18nc检测试剂盒、agcu21+1检测试剂盒、investigatorhdplex检测试剂盒)对28个新增常染色体str基因座进行分型检测，结果发现新增str基因座d3s4529基因座发生一步突变。即共检测47个str基因座中发现3个str基因座(vwa、fga、d3s4529)发生一步突变。
基于mps技术的snp检测结果：采用该试剂盒对上述涉案样本进行及高通量测序检测，结果表明，三个样本在234个常染色体snp位点的分型结果均符合孟德尔遗传定律，孩子(女)与可疑父在30个x-snp位点的结果符合x染色体遗传标记遗传定律，结果见下表。
实施例3
本实施例为本发明所述的snp位点的检测试剂盒在50名无关个体中的法医学检测效能。
采用实施例1所述的检测方法对50名无关个体血液样本进行检测。50名个体为志愿者。
结果：
(1)50名个体在234个常染色体snp位点及30个x-snp位点均得到完整分型，其中25名男性个体在9个y-snp位点得到完整分型。
(2)根据50名无关个体在273个snp位点的频率数据，发现234个常染色体snp位点相互独立，用于个体识别的累积个体识别率为1-1.49e-62，用于二联体亲权鉴定的累积非父排除率为1-2.98e-12，用于三联体亲权鉴定的累积非父排除率为1-3.51e-23，可以满足实际工作需求。30个x-snp位点的检测数据显示，在女性群体中的累积个体识别率为1-1.13738e-12，在男性群体中的累积个体识别率为1-6.23849e-09。9个y-snp在25名男性个体中共发现6种单倍型。以上x-snp和y-snp位点的遗传信息可以亲缘关系的判断提供更丰富的信息。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
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<110>司法部司法鉴定科学技术研究所
<120>一种基于高通量测序的snp位点的检测试剂盒及其检测方法
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