本发明涉及致病性弧菌的快速检测，具体涉及一种基于dna旋转酶gyrb基因的基因测序检测方法，用于同源性高(16srrna序列相似性大于99％)难以鉴定的致病性弧菌的鉴别。
背景技术：
：：弧菌科(vibrionaceae)细菌是海洋环境中最常见的细菌类群之一，广泛分布于半咸水、河口、海洋的水体及海产品中。1995年《美国临床微生物学手册》第六版明确了弧菌属的致病菌种类为12种，包括霍乱弧菌(vibriocholearae)、拟态弧菌(v.mimicus)、河弧菌(v.fluvialis)、副溶血弧菌(v.parahaemolyticus)、霍利斯弧菌(v.hollisae)、溶藻弧菌(v.alginolyticus)、弗尼斯弧菌(v.furnissii)、创伤弧菌(v.vulnificus)、麦氏弧菌(v.metschnikovii)、海鱼弧菌(v.damsela)、辛辛那提菌(v.cincinnatiensis)、鲨鱼弧菌(v.carchariae)。人们通过饮用不清洁的水，食用未加工或未加工熟的带有致病性弧菌的食物(特别是海产品)感染发病。因此，简便、快速、高效地检测致病性弧菌对于监测及检测环境水体及海产品中致病性弧菌，维护人类身体健康有重要的意义。传统的生理生化试验对于致病性弧菌的鉴定相对不稳定，给致病性弧菌的鉴定工作带来了很大的困难和不确定性。随着分子生物学的发展，采用普通pcr法或荧光定量pcr法快速检测致病性弧菌已得到广泛应用，但是这些方法却无法获得分子诊断的“金标准”——基因序列，从而降低了检测结果的准确性。因此，建立基于基因序列的测序技术对于致病性弧菌的检测具有重要意义。作为细菌鉴定的通用序列16srdna，由于其具有高度保守性，对相似率极高的近缘种无法做进一步区分，如副溶血弧菌与溶藻弧菌的16srdna的相似率为99.7％，溶藻弧菌和海鱼弧菌16srdna序列相似度达100％，因此，16srdna测序并不能对同源性高的弧菌进行准确的种间鉴定。近年来研究者发现以编码蛋白的基因作为系统发育鉴定标记可以弥补16srdna的这些缺陷，编码dna旋转酶的gyrb基因正逐渐成为近缘种鉴别的新靶标。venkateswaran等通过对1258bp的gyrb基因序列分析发现，副溶血弧菌与溶藻弧菌的gyrb的相似率仅为86.8％，vuddhakul等通过对霍利斯弧菌部分gyrb基因序列分析发现，霍利斯弧菌与副溶血弧菌的相似率为80％，可见gyrb基因可用于致病性弧菌的鉴别。技术实现要素：为解决以上技术问题，本发明提供了一种基于gyrb基因测序鉴定致病性弧菌的检测方法，以提高致病性弧菌检测的准确率。为实现上述目的，本发明首先提供一种基于gyrb基因的用于致病性弧菌检测的通用引物对，该引物对的正向/反向引物为：正向引物(seqidno.1)：5′-aarcarggncgtaaccgtaa-3′，反向引物(seqidno.2)：5′-hgggtadcgrcgrctcat-3′。另一方面，本发明提供一种致病性弧菌检测用试剂盒，所述试剂盒是基因测序检测试剂盒，其中包括碱基序列为seqidno.1/2的引物对。本发明的另一目的在于提供一种致病性弧菌的检测方法，所述方法为基因测序检测方法，其包括以seqidno.1/2引物对对致病性弧菌进行pcr扩增、pcr扩增产物测序分析及结果判定。本发明所提供的基于gyrb基因的致病性弧菌检测用通用引物对及检测方法可对同源性高(16srrna序列相似性大于99％)的致病性弧菌进行检测，简单快速，正确率高，克服了目前16srrna测序鉴定正确率低的问题。附图说明本发明附图5幅：图1所示为通用引物对1对应的保守区域，其中两个方框分别为引物对1的正向引物和反向引物的对应保守区，以星号“*”对应一致性位点。图2所示为引物对1的扩增结果，其中：1：markerdl2000；2：副溶血弧菌(atcc17802)pcr产物条带；3：霍乱弧菌(nctc11218)pcr产物条带；4：拟态弧菌(iqcc12304)pcr产物条带；5：河弧菌(iqcc12303)pcr产物条带；6：弗尼斯弧菌(atcc35016)pcr产物条带；7：霍利斯弧菌(atcc33564)pcr产物条带；8：溶藻弧菌(1.1833)pcr产物条带；9、10：阴性对照。图3所示为引物对2、引物对3、codehop组合1引物对扩增结果，其中：1、markerdl2000；2-9依次为引物对2扩增的副溶血弧菌(atcc17802)、霍乱弧菌(nctc11218)、拟态弧菌(iqcc12304)、河弧菌(iqcc12303)、弗尼斯弧菌(atcc35016)、霍利斯弧菌(atcc33564)、溶藻弧菌(1.1833)、阴性对照pcr产物条带；10-17依次为引物对3扩增的副溶血弧菌(atcc17802)、霍乱弧菌(nctc11218)、拟态弧菌(iqcc12304)、河弧菌(iqcc12303)、弗尼斯弧菌(atcc35016)、霍利斯弧菌(atcc33564)、溶藻弧菌(1.1833)、阴性对照pcr产物条带；18-25依次为codehop组合1引物对副溶血弧菌(atcc17802)、霍乱弧菌(nctc11218)、拟态弧菌(iqcc12304)、河弧菌(iqcc12303)、弗尼斯弧菌(atcc35016)、霍利斯弧菌(atcc33564)、溶藻弧菌(1.1833)、阴性对照pcr产物条带。图4所示为codehop组合2、3、4的扩增结果，其中，1、markerdl2000；2-9依次为codehop组合2副溶血弧菌(atcc17802)、霍乱弧菌(nctc11218)、拟态弧菌(iqcc12304)、河弧菌(iqcc12303)、弗尼斯弧菌(atcc35016)、霍利斯弧菌(atcc33564)、溶藻弧菌(1.1833)、阴性对照pcr产物条带；10-17依次为codehop组合4副溶血弧菌(atcc17802)、霍乱弧菌(nctc11218)、拟态弧菌(iqcc12304)、河弧菌(iqcc12303)、弗尼斯弧菌(atcc35016)、霍利斯弧菌(atcc33564)、溶藻弧菌(1.1833)、阴性对照pcr产物条带；18-25依次为codehop组合3副溶血弧菌(atcc17802)、霍乱弧菌(nctc11218)、拟态弧菌(iqcc12304)、河弧菌(iqcc12303)、弗尼斯弧菌(atcc35016)、霍利斯弧菌(atcc33564)、溶藻弧菌(1.1833)、阴性对照pcr产物条带。图5所示为致病性弧菌标准菌株特异性检验结果，其中：1、22：markerdl2000；2：弗尼斯弧菌(atcc35016)pcr产物条带、3：副溶血弧菌(atcc17802)pcr产物条带、4：哈氏弧菌(atcc35084)pcr产物条带、5：海鱼弧菌(atcc33539)pcr产物条带、6：霍利斯弧菌(atcc33564)pcr产物条带、7：弗尼斯弧菌(iqcc12301)pcr产物条带、8：拟态弧菌(iqcc12304)pcr产物条带、9：弗尼斯弧菌(iqcc12329)pcr产物条带、10：创伤弧菌(iqcc12306)pcr产物条带、11：拟态弧菌(iqcc12318)pcr产物条带、12：河弧菌(iqcc12303)pcr产物条带、13：霍乱弧菌(nctc11218)pcr产物条带、14：溶藻弧菌(1.1833)pcr产物条带、15：坎氏弧菌(1.1597)pcr产物条带、16：河弧菌(cicc21612)pcr产物条带、17：大肠杆菌、18：金黄色葡萄球菌、19：志贺氏菌、20：沙门氏菌、21、阴性对照。具体实施方式本发明的详细技术方案为：(1)提取待测样品dna，得到模板溶液；具体实施方式中，可采用但不限制于该方法制备模板液：将待测样品以3％氯化钠碱性蛋白胨水增菌培养，培养至菌浓度约0.5麦氏浊度时，取1.0ml培养液于离心管中并于13000rpm离心5min，弃上清液，用dna提取试剂盒处理得到模板液。(2)pcr扩增反应体系：模板液2μl、10×pcr缓冲液2.5μl、dntp2μl、taq酶0.125μl、浓度为10μm的引物对seqidno.1/21μl、补充灭菌双蒸水至总体积为25μl；以上各组分加入至0.2mlpcr反应管中，混匀，5000r/min离心10s；反应条件：94℃预变性4min，然后94℃1min、60℃1min、72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存；所得pcr扩增产物以2％琼脂糖凝胶电泳检测，3～5v/cm恒压电泳20～40min，510bp左右出现gyrb基因的条带为阳性结果；具体实施方式中，可以采用但不限于下述方法检测pcr产物：用电泳缓冲液制备2％琼脂糖凝胶，取pcr扩增产物5μl，与1μl上样缓冲液混合后点样，用dna分子量标记物做参照；3v/cm～5v/cm恒压电泳，电泳20min～40min，将电泳后的凝胶于紫外线下观察；gyrb基因的条带位于510bp左右，取阳性结果pcr产物进行进一步测序鉴定；(3)pcr扩增产物测序分析；具体实施方式中，pcr扩增产物测序可以采用但不限于下述方法：①测序pcr：测序反应体系：10μm引物(seqidno.1/2)0.5μl，bigdye1μl，bigdyeseqbuffer3.5μl，超纯水14μl，模板1μl；测序反应条件为：94℃2min；(94℃30sec，50℃30sec，72℃2min)40个循环；4℃保温；②测序pcr产物纯化：采用centri-sepspin-columns(货号：cs-901)进行pcr产物纯化；③上机检测：在待检测孔中加入10μl的hi-di甲酰胺后，依次加入10μl纯化后测序产物，混匀并尽量避免气泡产生，不加样的孔中加入10μl的超纯水；④测序结果质量判定：测序结果用测序分析软件进行处理，选取测序结果质量分数较高的序列作为结果。(4)结果判定将测序所得序列提交至ncbi数据库，进行blast序列分析。在blast结果中，当一致性大于等于99％时，可认为该菌与目标菌株(亦即“description”中提供的相应菌株名称)相符。下面为本发明的具体实施例，它对本发明技术方案的建立及其应用作进一步的说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。若无特殊说明，本部分试验所用生物样品来自丹东出入境检验检疫局微生物实验室。dna提取试剂盒：takaraminibestbacteriagenomicdnaextractionkitver.3.0(货号9763)购于宝生物工程(大连)有限公司；pcr扩增酶试剂：takaraextaq(货号rr001a)购于宝生物工程(大连)有限公司；测序试剂盒：terminatorv3.1试剂盒(货号：4336915)购于美国abi公司；测序产物纯化试剂盒：centri-sepspin-columns纯化柱(货号：cs-901)购于美国abi公司；abiveritipcr仪(abi公司，美国)；abi3500基因分析仪(abi公司，美国)。实施例1：引物的设计分别在核苷酸水平和氨基酸水平上设计。(1)依据弧菌gyrb基因核苷酸序列设计通用引物对从ncbi数据库中导出31种已知的弧菌gyrb基因核苷酸序列(见表1)，利用生物学软件geneious中的子模块alignorassemblesequence进行序列比对，获得gyrb基因保守区域，根据保守区域利用ncbiprimerblast设计并筛选引物，对于非一致性位点进行简并性修饰(修饰规则为r＝a/g，y＝c/t，s＝c/g，w＝a/c/t，h＝a/c/t，v＝a/c/g，d＝a/g/t，n＝a/c/g/t)，根据简并度≤128、简并性碱基不能位于引物3'末端的原则选出3对引物，引物编号与序列如表2所示。表1：31种已知的弧菌gyrb基因信息a：半滑舌鳎病原菌轮虫弧菌a表2：使用ncbiprimerblast设计的通用引物序列(2)依据氨基酸序列设计通用引物对从ncbi中导出31种已知的弧菌gyrb基因氨基酸序列提交至codehop在线软件的blockmaker模块，进行保守区(block)的查找，之后将得到的4个保守区提交至codehop服务器进行引物的设计，引物的筛选主要依据如下条件：简并度(degeneracy)≤128，退火温度(temperature)为60.0℃–70.0℃，遗传密码(geneticcode)：standard，密码子选用框(codonusagetable)：vibriocholearaeo1biovareltorstr.n16961，从中选择评分较高的(＞75分)引物。最终筛选出5条codehop引物，组成4个引物对。引物对组成方式、引物序列及扩增产物大小如表3所示。表3codehop引物对组合方式、序列及产物大小选取7株常见弧菌的标准菌株作为模板进行预实验，评价引物的通用性及扩增效率。模板菌株包括副溶血弧菌(atcc17802)、霍乱弧菌(nctc11218)、拟态弧菌(iqcc12304)、河弧菌(iqcc12303)、弗尼斯弧菌(atcc35016)、霍利斯弧菌(atcc33564)、溶藻弧菌(1.1833)。检测方法如下：(1)提取待测样品dna，得到模板溶液将待测样品以3％氯化钠碱性蛋白胨水增菌培养，培养至菌浓度约0.5麦氏浊度时，取1.0ml培养液于离心管中并于13000rpm离心5min，弃上清液，用dna提取试剂盒处理得到模板液。(2)pcr扩增反应体系：模板液2μl、10×pcr缓冲液2.5μl、dntp2μl、taq酶0.125μl、浓度为10μm的引物对1μl、补充灭菌双蒸水至总体积为25μl；以上各组分加入至0.2mlpcr反应管中，混匀，5000r/min离心10s；引物对1的反应条件为：94℃预变性4min，然后94℃1min、60℃1min、72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存；引物对2、引物对3、codehop组合1引物对反应条件为：94℃预变性4min，然后94℃1min、56℃1min、72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存；codehop组合2、3、4引物对反应条件为：94℃预变性4min，然后94℃1min、54℃1min、72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。pcr扩增产物电泳检测：用电泳缓冲液制备2％琼脂糖凝胶，取pcr扩增产物5μl，与1μl上样缓冲液混合后点样，用dna分子量标记物做参照；3v/cm～5v/cm恒压电泳，电泳20min～40min，将电泳后的凝胶于紫外线下观察，不同引物对gyrb基因的条带大小见表2、表3中扩增产物大小。对比电泳结果，引物对1能完全扩增出7株弧菌菌株，且扩增特异性、效率较高；引物对2扩增特异性、效率较高，但有2株弧菌无法扩增出，通用性不及引物对1；引物对3及codehop组合4引物对扩增特异性、通用性差；codehop组合1、2、3引物对扩增效率、通用性差。因此，选用引物对1作为通用引物对进行后续实验，引物对1对应的保守区域如附图1所示。结果如附图2～4所示。实施例2：检测方法的建立一、引物选用实施例1设计筛选的通用引物对1：正向引物：5′-aarcarggncgtaaccgtaa-3′，反向引物：5′-hgggtadcgrcgrctcat-3′。二、检测方法的建立：(1)提取待测样品dna，得到模板溶液将待测样品以3％氯化钠碱性蛋白胨水增菌培养，培养至菌浓度约0.5麦氏浊度时，取1.0ml培养液于离心管中并于13000rpm离心5min，弃上清液，用dna提取试剂盒处理得到模板液。(2)pcr扩增反应体系：模板液2μl、10×pcr缓冲液2.5μl、dntp2μl、taq酶0.125μl、浓度为10μm的引物对1μl、补充灭菌双蒸水至总体积为25μl；以上各组分加入至0.2mlpcr反应管中，混匀，5000r/min离心10s；反应条件为：94℃预变性4min，然后94℃1min、60℃1min、72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存；pcr扩增产物电泳检测：用电泳缓冲液制备2％琼脂糖凝胶，取pcr扩增产物5μl，与1μl上样缓冲液混合后点样，用dna分子量标记物做参照；3v/cm～5v/cm恒压电泳，电泳20min～40min，将电泳后的凝胶于紫外线下观察，gyrb基因的条带位于510bp左右。取阳性结果pcr产物进行进一步测序鉴定。(3)pcr扩增产物测序分析1)测序pcr：测序反应体系：引物(10μm)0.5μl，bigdye1μl，bigdyeseqbuffer3.5μl，超纯水14μl，模板1μl。测序反应条件为：94℃2min；(94℃30sec，50℃30sec，72℃2min)，40个循环；4℃保温。2)测序pcr产物纯化：采用centri-sepspin-columns(货号：cs-901)进行pcr产物纯化。3)上机检测：在待检测孔中加入10μl的hi-di甲酰胺后，依次加入10μl纯化后测序产物，混匀并尽量避免气泡产生，不加样的孔中加入10μl的超纯水。4)测序结果质量判定：测序结果用测序分析软件进行处理。选取测序结果质量分数较高的序列作为结果。(4)结果判定将测序所得序列提交至ncbi数据库，进行blast序列分析。选择nucleotideblast模块，将测序结果复制于enterquerysequence对话框中，比对参数设置(choosesearchset)选择nucleotidecollection(nr/nt)数据库，比对程序(programselection)选择highlysimilarsequences(megablast)。在blast结果中，当一致性(ident)大于等于99％时，可认为该菌与“description”中提供的相应菌株名称相符。实施例3:特异性实验本实施例以引物对1及实施例2所建立的检测方法测试实验室保存的15株弧菌标准菌株及4株非弧菌标准菌株(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌)，以验证所建立检测方法的特异性。具体信息及检测结果见表4。表4：特异性实验所选用菌株信息及检测结果注：①atcc菌株购自美国菌种保藏中心；iqcc菌株购自检验检疫微生物菌种保藏管理中心；cicc菌株购自中国工业微生物菌种保藏中心；nctc菌株购自国家标准菌库；1.1833、1.1597菌株购自中科院微生物所。②pcr扩增结果无条带将不再进行测序分析。pcr扩增产物电泳结果如附图5所示，显示：所选致病性弧菌均有约510bp大小的目标条带，所选非致病性弧菌及阴性对照无条带，表明pcr反应结果正常，反应体系无污染。对扩增产物进行基因测序检测及blast序列分析，所得比对结果均与菌株信息一致，表明本发明有很好的特异性。详细的检测结果描述如下：(1)弗尼斯弧菌(atcc35016)标准菌株基因测序结果如seqidno.3，序列全长428bp，blast序列比对结果显示：其1-428bp序列溯源至genebank序列号为cp002377.1的弗尼斯弧菌基因序列，一致性为99％。序列比对结果与已知菌株信息一致。(2)副溶血弧菌(atcc17802)标准菌株基因测序结果如seqidno.4，序列全长346bp，blast序列比对结果显示：其1-344bp序列溯源至genebank序列号为cp014046.1的副溶血弧菌基因序列，一致性为100％。序列比对结果与已知菌株信息一致。(3)哈氏弧菌(atcc35084)标准菌株基因测序结果如seqidno.5，序列全长416bp，blast序列比对结果显示：其1-415bp序列溯源至genebank序列号为cp009467.2的哈氏弧菌基因序列，一致性为99％。序列比对结果与已知菌株信息一致。(4)海鱼弧菌(atcc33539)标准菌株基因测序结果如seqidno.6，序列全长379bp，blast序列比对结果显示：其1-379bp序列溯源至genebank序列号为aj249850.1的海鱼弧菌基因序列，一致性为99％。序列比对结果与已知菌株信息一致。(5)霍利斯弧菌(atcc33564)标准菌株基因测序结果如seqidno.7，序列全长432bp，blast序列比对结果显示：其1-432bp序列溯源至genebank序列号为cp014056.1的霍利斯弧菌基因序列，一致性为100％。序列比对结果与已知菌株信息一致。(6)弗尼斯弧菌(iqcc12301)标准菌株基因测序结果如seqidno.8，序列全长431bp，blast序列比对结果显示：其1-431bp序列溯源至genebank序列号为cp002377.1的弗尼斯弧菌基因序列，一致性为99％。序列比对结果与已知菌株信息一致。(7)拟态弧菌(iqcc12304)标准菌株基因测序结果如seqidno.9，序列全长427bp，blast序列比对结果显示：其1-427bp序列溯源至genebank序列号为eu680783.1的拟态弧菌基因序列，一致性为100％。序列比对结果与已知菌株信息一致。(8)弗尼斯弧菌(iqcc12329)标准菌株基因测序结果如seqidno.10，序列全长431bp，blast序列比对结果显示：其1-431bp序列溯源至genebank序列号为cp002377.1的弗尼斯弧菌基因序列，一致性为100％。序列比对结果与已知菌株信息一致。(9)创伤弧菌(iqcc12306)标准菌株基因测序结果如seqidno.11，序列全长302bp，blast序列比对结果显示：其1-302bp序列溯源至genebank序列号为cp009261.1的创伤弧菌基因序列，一致性为99％。序列比对结果与已知菌株信息一致。(10)拟态弧菌(iqcc12318)标准菌株基因测序结果如seqidno.12，序列全长431bp，blast序列比对结果显示：其1-431bp序列溯源至genebank序列号为eu680783.1的拟态弧菌基因序列，一致性为100％。序列比对结果与已知菌株信息一致。(11)河弧菌(cicc21612)标准菌株基因测序结果如seqidno.13，序列全长435bp，blast序列比对结果显示：其1-435bp序列溯源至genebank序列号为cp014035.1的河弧菌基因序列，一致性为100％。序列比对结果与已知菌株信息一致。(12)霍乱弧菌(nctc11218)标准菌株基因测序结果如seqidno.13，序列全长357bp，blast序列比对结果显示：其1-357bp序列溯源至genebank序列号为cp013014.1的霍乱弧菌基因序列，一致性为100％。序列比对结果与已知菌株信息一致。(13)溶藻弧菌(1.1833)标准菌株基因测序结果如seqidno.15，序列全长4431bp，blast序列比对结果显示：其1-431bp序列溯源至genebank序列号为cp006718.1的溶藻弧菌基因序列，一致性为100％。序列比对结果与已知菌株信息一致。(14)坎氏弧菌(1.1597)标准菌株基因测序结果如seqidno.16，序列全长416bp，blast序列比对结果显示：其1-416bp序列溯源至genebank序列号为eu680782.1的溶藻弧菌基因序列，一致性为100％。序列比对结果与已知菌株信息一致。(15)河弧菌(iqcc12303)标准菌株基因测序结果如seqidno.17，序列全长435bp，blast序列比对结果显示：其1-433bp序列溯源至genebank序列号为cp014035.1的河弧菌基因序列，一致性为100％。序列比对结果与已知菌株信息一致。实施例4：用于实际样品的检测本实施例以实验室保存的经生化实验及特异性pcr确认过的48株分离菌株，以验证所建立检测方法的准确性。本实施例应用本实施例应用实施例2的引物对及检测方法，所选实验菌株信息及检测结果见表5。表5：实际样品检测所选用菌株信息及检测结果对基因测序检测结果进行blast序列分析，所得比对结果均与菌株信息一致，表明本发明有很好的特异性与准确性。sequencelisting<110>丹东出入境检验检疫局综合技术服务中心<120>用于致病性弧菌检测的通用引物对及其应用<130>n/a<160>17<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1aarcarggncgtaaccgtaa20<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<400>2hgggtadcgrcgrctcat18<210>3<211>428<212>dna<213>弗尼斯弧菌<400>3gcacgttttgacaagatgttgtcatcgcaagaagtggccacgctgatcacagcgctgggc60tgcggtatcggccgtgacgaatacaacccagacaaactgcgttaccacaacatcatcatc120atgaccgatgcggacgtcgatggttctcacattcgtacgctgctgctgacgttcttctac180cgtcaaatgccggagctgattgaacgtggctacatctacattgctcagccacctttgtac240aaagtgaagaaaggcaaacaagagcagtacatcaaagatgaagaggcgatgaaccaatac300cagatcgcactggcgatggacaacgcagagctgcacgtgaacgctgacgcaccagcattg360gcgggcgcaccgttggagaaattggttcagcaatacaatgctgccatcaaactgatcgaa420cgcatgag428<210>4<211>346<212>dna<213>副溶血弧菌<400>4ccggacaaactgcgttaccacaacatcatcatcatgaccgatgctgacgtcgatggttcg60cacattcgtacgctactgttgaccttcttctaccgtcaaatgccagagcttatcgagcgt120ggttacgtgtacatcgctcagccaccactatacaaagtgaagaagggcaaacaagagcag180tacatcaaagatgaagaagcgatgaaccaataccaagtatcattggcattggacaacgca240tcactgcacgtaaacgcagaagctccagctctagctggcgaagcactagaaaaactggtt300caacaatacaatgcaggtatcaagcttgctgaccgtatgagccgcc346<210>5<211>416<212>dna<213>哈氏弧菌<400>5gctttcttctcaagaagtagcaacgctgatcactgcactaggctgtggtatcggtcgtga60cgagtacaacccggataaactgcgttaccacaacatcatcatcatgaccgatgctgacgt120cgatggttcgcacatccgtacgctactgttgaccttcttctaccgtcaaatgccagagct180tatcgagcgtggctatgtgtacattgctcagccaccgctttacaaagtgaagaaaggcaa240acaagagcagtacatcaaagacgaagatgcgatgaaccaataccaagttgctttggcact300tgataacgcatcgctacacgtaaacgcagaagcaccagcattggcaggcgaagcgctaga360gaagctagttcagcaatacaacgctggtatcaagctagcggatcgcatgagccgcc416<210>6<211>379<212>dna<213>海鱼弧菌<400>6actgcgatgggttgtggtatcggccgcgatgaatacaacccagataaattacgttatcac60agcatcattattatgaccgatgccgacgtcgatggttcgcacattcgtacgctactgttg120accttcttctatcgtcaaatgccagaattgattgaacgtggtcatatctatattgctcag180ccaccgctttacaaagtgaaaaaaggcaaacaagagcagtacatcaaagatgatgaagat240atgcagcagttccagacttcgcttgcgttagaaaatgctgcgctgttcactactgaaggt300gcgccagcaatggcaggtcttgctcttgagaatctggtaggtcagtacaacagcacaatg360aagttgattgagcgtatga379<210>7<211>432<212>dna<213>霍利斯弧菌<400>7cccgtttcgacaaaatgctgtcttcccaggaagtggcgacgctaatcactgcgctgggtt60gtggtatcggccgcgacgagtacaaccctgacaaactgcgctaccacagcatcatcatca120tgaccgatgctgacgtcgatggctcgcacatccgtacgctgctgttgaccttcttctacc180gtcaaatgcctgaactgatcgaacgaggctacgtttatattgctcagccgccgctttaca240aagtgaagaagggcaagcaagagcaatacatcaaagatgatgaagccatggagcagtatc300aggtttctattgctcttgaaaatgcgtcactgtacgtcaaccaggatgcgccagcgttga360atggccttgcacttgaagagctggtaaaacaatacaatggtgtcatgaagctgattaagc420gcatgagccgcc432<210>8<211>431<212>dna<213>弗尼斯弧菌<400>8gcacgttttgacaagatgttgtcgtcgcaagaagtggccacgctgatcacagcgctgggc60tgcggtatcggccgtgacgaatacaacccagacaaactgcgttaccacaacatcatcatc120atgaccgatgcggacgtcgatggttctcacattcgtacgctgctgctgacgttcttctac180cgtcaaatgccggagctgattgaacgtggctacatctacattgctcagccacctttgtac240aaagtgaagaaaggcaaacaagagcagtacatcaaagatgaagaggcgatgaaccaatat300cagatcgcactggcgatggacaacgcagagctgcacgtgaacgctgacgcaccagcattg360gcgggcgcaccgttggagaaattggttcagcaatacaatgctgccatcaaactgatcgaa420cgcatgagccg431<210>9<211>427<212>dna<213>拟态弧菌<400>9ttttgacaagatgttgtcttcacaagaagtcgcgaccctgatcactgcattaggctgtgg60tatcggccgtgatgaatacaacccagataaactgcgttaccacaacatcatcatcatgac120cgatgcggacgtcgacggctcgcacattcgtactctgctgttgaccttcttctaccgcca180aatgcctgagctgattgagcgtggttacatctacattgctcagccaccactctacaaagt240gaagaaaggcaaacaagagcagtacatcaaagatgaagacgcgatgaaccaataccaagt300ggcactggcgatggatggcgcagagctgcacgtgaatgccgatgctcctgcattggcggg360tgaaccgcttgagaagctggttcagcagtacaacgctgcgatcaaactggttgagcgcat420gagccgc427<210>10<211>431<212>dna<213>弗尼斯弧菌<400>10gcacgttttgacaagatgttgtcgtcgcaagaagtggccacgctgatcacagcgttgggc60tgcggtatcggccgtgacgaatacaacccagacaaactgcgttaccacaacatcatcatc120atgaccgatgcggacgtcgatggttctcacattcgtacgctgctgctaacgttcttctac180cgtcaaatgccggagctgattgaacgtggctacatctacattgctcagccacctttgtac240aaagtgaagaaaggcaaacaagagcagtacatcaaagatgaagaggcgatgaaccaatac300cagatcgcactggcgatggacaacgcagagctgcacgtgaacgctgacgcaccagcattg360gcgggcgcaccgttggagaaattggttcagcaatacaatgctgccatcaaactgatcgaa420cgcatgagccg431<210>11<211>302<212>dna<213>创伤弧菌<400>11gcactaggttgtggtatcggtcgtgacgagtacaacccggacaaactgcgttaccacaac60atcatcatcatgaccgatgcggacgtcgatggttcgcacattcgtacgctactgttgacc120ttcttctaccgtcaaatgccggagcttattgagcgtggctacgtgtatatcgctcagcca180ccactgtacaaagtgaagaaaggcaaacaagagcagtacattaaagatgaagatgcgatg240aaccagtaccaaatttccttggcattggataacgcagcgctgcacgtgaacccagacgca300cc302<210>12<211>431<212>dna<213>拟态弧菌<400>12cacgttttgacaagatgttgtcttcacaagaagtcgcgaccctgatcactgcattaggct60gtggtatcggccgtgatgaatacaacccagataaactgcgttaccacaacatcatcatca120tgaccgatgcggacgtcgacggctcgcacattcgtactctgctgttgaccttcttctacc180gccaaatgcctgagctgattgagcgtggttacatctacattgctcagccaccactctaca240aagtgaagaaaggcaaacaagagcagtacatcaaagatgaagacgcgatgaaccaatacc300aagtggcactggcgatggatggcgcagagctgcacgtgaatgccgatgctcctgcattgg360cgggtgaaccgcttgagaagctggttcagcagtacaacgctgcgatcaaactggttgagc420gcatgagccgc431<210>13<211>435<212>dna<213>河弧菌<400>13aagcgcgttttgacaagatgctgtcttcgcaagaggtggctacgctgatcaccgcactcg60gctgcggcatcggtcgtgacgagtacaacccggataaactgcgttaccacaacatcatca120tcatgaccgatgcggacgtcgatggtt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