本发明涉及动物源性食品检测领域的一种猪源性成分快速检测方法及试剂盒。
背景技术：
：：肉类食品是人类膳食结构的重要组成部分，由于市场上不同来源的肉类价格差距较大，为谋取暴利，部分不法企业和商户通过在价格较低的猪肉中添加牛、羊油等方式生产各种假牛肉、羊肉制品。上述行为不仅损害了消费者的利益，严重扰乱了市场秩序，而且可能带来宗教和民族纠纷，影响民族团结与和谐。因此，亟需建立科学、准确快速的检测方法，鉴别牛、羊肉制品中掺杂的猪肉成分。20世纪80年代以来，国内外开始对肉的种属鉴定进行研究主要有色谱法，电泳法、酶联免疫分析法等，由于食物成分的复杂性及加工方式的多样性，这些传统的方法对一些深加工及热处理的食物无法准确检测。dna具有热稳定性和种属特异性的特点，近年来一些基于dna水平的检测技术，如dna杂交、pcr测序、物种特异pcr被用于动物物种鉴定的研究。其中物种特异pcr，由于检测快速、具有较高的特异性和灵敏性，已逐渐成为食品中肉类成分鉴别的主流方法。但同时pcr技术有一定的局限性，常规pcr-凝胶电泳技术在检测中要经过制胶、电泳、成像等多个步骤，且应用溴化乙锭(eb)等核酸染色剂容易造成对环境的污染；尽管实时荧光定量pcr(qpcr)技术克服了上述缺陷，但qpcr需要较高的技术要求及昂贵仪器，尚不能广泛应用。因此，建立简单、快速、准确的动物源性食品检测技术，并广泛应用于发展中国家及基层实验室，仍然是摆在科研工作者面前的重大课题。胶体金免疫层析法是胶体金标记技术和免疫层析技术相结合的产物，基本原理是利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用，使抗原抗体发生反应，在检测线位置，阳性反应在侧向流层析试纸条上出现红色条带，阴性反应无条带。本发明建立了猪源性成分快速检测方法及试剂盒。根据猪线粒体cytb基因设计特异引物进行pcr扩增，扩增物与一条修饰的特异性探针杂交，最后通过侧向流层析试纸条检测。pcr结束后的杂交和检测时间只需5分钟，且结果肉眼即可判读。本发明建立的猪源性成分快速检测方法及试剂盒能为发展中国家、基层实验室及商场自检机构进行猪源性成分的定性检测提供新思路。技术实现要素：本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简便、快速、灵敏度高、特异性强，效果佳，应用价值高的食品中猪源性成分快速检测方法；并提供其检测试剂盒。本发明的目的是由以下技术方案来实现的：1.一种食品中猪源性成分快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1)设计并优化猪源性成分快速检测的特异性引物和探针，其序列如下：正向引物(pf)：5’-ctatactacggatcctatatattcctag-3’(28bp,tm:61.7℃)；下游引物:5’-fam-ctacgaggtctgttccgatataagg-3’(25bp,tm:64.6℃)，引物的5’端经fam修饰；寡核苷酸探针(p):5’-atcacaaatctactatca-biotin-3’(18bp,tm:48.5℃)，探针的3’端经biotin修饰；2)样本dna的提取：将猪肉样品和被检测的猪肉、羊肉、牛肉、鸡肉、鹅肉、鸭肉、兔肉中任意一种及其所述肉的制品剪碎，分别准确称取各肉样0.1g，液氮研磨后转移至1.5ml离心管中；加入800μl裂解液，65℃孵育30min，期间振荡混匀3-4次，12000×g离心5min；上清液移入一洁净离心管中，加入400μl三氯甲烷：异戊醇(24:1)混合萃取液，振荡混匀后12000×g离心5min；取上清液于另一洁净离心管中，加入320μl异丙醇，室温沉淀30min；12000×g离心5min，弃上清液，向沉淀中加入500μl70％乙醇漂洗，12000×g离心5min；弃上清液，室温晾干沉淀，用20μlte缓冲液溶解，测定od值后-20℃保存；3)pcr扩增反应：pcr反应体系:其中pcrmastermix5.2μl,10μmol/l引物各0.8μl,模板dna1μl,ddh2o17.2μl，总体积25μl；pcr反应条件如下:95℃预变性5min,95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,40个循环；95℃变性2分钟，置于冰上；4)侧向流层析试纸条的制备胶体金颗粒-链霉亲和素(aunps-sa)复合物制备：调整胶体金(aunps)溶液ph至7.0，18μg链酶亲和素(sa)为稳定1ml30nm胶体金的蛋白量，在该条件下将aunps与sa偶联,铺于金标垫上；将1.2mg/ml的鼠抗fam抗体和1.2mg/ml的bsa-生物素偶联物划在尼龙膜表面，形成检测线为t线和控制线为c线；侧向流层析试纸条的结构组成：从下至上依次为下部吸水垫、样品区、金标垫、nc膜、t线、c线及上部吸水垫；5)pcr产物与探针的杂交：取10μl经步骤3)变性的pcr产物和1μl寡核苷酸探针10mmol/l于50μl杂交缓冲液1g/lpeg4000,1.5mmgcl2，ph7.0中，混匀；随后35℃温育1min，进行核酸的液相杂交；6)杂交产物的侧向流层析试纸条检测：取10μl杂交混合物上样于侧向流层析试纸条的样品垫；将样品垫下端浸入90μl展开液，0.01mol/lpbs，ph7.4中，5分钟内肉眼读取结果。2.一种食品中猪源性成分快速检测试剂盒，其特征是，它包括如下体系：1)猪线粒体cytb基因的pcr扩增反应体系，具体包括以下组分：(a)pcr模板dna制备溶液样品裂解液：含ctab1g、edta0.3722g、tris-hcl0.7882g、nacl4.09g,调至ph8.0,高温高压灭菌，100ml；萃取液：三氯甲烷与异戊醇容积为24:1的混合液，60ml；异丙醇：50ml；70％乙醇：200ml；te缓冲液：10mmol/ltris-hcl、1mmol/l的edta(ph8.0)，10ml；(b)猪线粒体cytb基因的一对特异性引物经优化设计并人工合成的引物如下：正向引物(pf)：5’-ctatactacggatcctatatattcctag-3’(28bp,tm:61.7℃)；下游引物:5’-fam-ctacgaggtctgttccgatataagg-3’(25bp,tm:64.6℃)，引物的5’端经fam修饰；引物和探针由上海生物工程有限公司合成；(c)pcr反应溶液pcrmastermix：美国abi公司pcrmastermix试剂盒，2ml；ddh2o：5ml；2)猪线粒体cytb基因的检测体系，具体包括以下组分：(a)猪线粒体cytb基因检测的特异性探针寡核苷酸探针(p):5’-atcacaaatctactatca-biotin-3’(18bp,tm:48.5℃)，探针的3’端经biotin修饰；(b)单链扩增子与探针的杂交及检测溶液杂交缓冲液：1g/lpeg4000,1.5mmgcl2，ph7.0，100ml；展开液：0.01mol/lpbs，ph7.4，200ml。本发明的一种食品中猪源性成分快速检测方法及试剂盒，根据猪线粒体cytb基因设计一对特异性引物，通过pcr扩增及液相杂交，结果通过试纸条检测，可猪源性成分的快速检测。与现有核酸等技术相比，本发明的有益效果在于：1.简单快速、易于推广，5分钟内肉眼即可判读结果；2.精确度高，特异性强，其既避开了常规pcr-凝胶电泳法的复杂检测步骤，又克服了实时荧光定量pcr(qpcr)需要较高的技术要求及昂贵仪器的缺陷；3.灵敏度高，重复性好，效果佳，应用价值高，优化后引物和探针检测猪源性成分的灵敏度较常规电泳法显著提高且重复性更好，可广泛应用于发展中国家及基层实验室及商场自检机构进行猪源性成分的定性检测。附图说明图1实验原理图；图2特异性实验结果图；图3灵敏性实验结果图。具体实施方式下面利用实施例对本发明作进一步描述。1、一种食品中猪源性成分快速检测检测方法，包含下述步骤：(1)改良方法制备肉样品及肉制品模板dna将市场购买的猪肉、羊肉、牛肉、鸡肉、鹅肉、鸭肉、兔肉经形态鉴定；将猪肉样品和市场购买所述肉及其肉制品剪碎，分别准确称取各肉样0.1g，液氮研磨后转移至1.5ml离心管中，加入800μl裂解液，65℃孵育30min，期间振荡混匀3-4次，12000×g离心5min；上清液移入一洁净离心管中，加入400μl三氯甲烷：异戊醇(24:1)混合液，振荡混匀后12000×g离心5min；取上清液于另一洁净离心管中，加入320μl异丙醇，室温沉淀30min；12000×g离心5min，弃上清液，向沉淀中加入500μl70％乙醇漂洗，12000×g离心5min；弃上清液，沉淀室温干燥后用20μlte缓冲液溶解，测定od值后-20℃保存；(2)根据genbank中的猪线粒体cytb基因序列，用dnastar软件设计并人工合成猪线粒体cytb基因序列特异引物及寡核苷酸探针，杂交试验中标记的正向引物与标记探针结合，会导致侧向流层析实验中产生假阳性，对检测结果造成影响，因此必须对引物及探针序列进行了优化筛选，经优化筛选并人工合成的引物和探针如下：正向引物(pf)：5’-ctatactacggatcctatatattcctag-3’(28bp,tm:61.7℃)；下游引物(pr)：5’-fam-ctacgaggtctgttccgatataagg-3’(25bp,tm:64.6℃)，引物的5’端经fam修饰；寡核苷酸探针(p):5’-atcacaaatctactatca-biotin-3’(18bp,tm:48.5℃)，探针的3’端经biotin修饰；引物和探针由上海生物工程有限公司合成；(3)pcr反应体系和反应条件pcr反应体系:pcrmastermix，选用美国abi公司pcrmastermix试剂盒5.2μl,10μmol/l引物各0.8μl,模板dna1μl,ddh2o17.2μl，总体积25μl；pcr反应条件:95℃预变性5min,95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,40个循环；95℃变性2分钟，置于冰上；(4)侧向流层析试纸条的制备胶体金颗粒-链霉亲和素(aunps-sa)复合物制备：调整胶体金(aunps)溶液ph至7.0，18μg链酶亲和素(sa)为稳定1ml30nm胶体金的蛋白量，在该条件下将aunps与sa偶联,铺于金标垫上；将1.2mg/ml的鼠抗fam抗体和1.2mg/ml的bsa-生物素偶联物划在尼龙膜表面，形成检测线为t线和控制线为c线；侧向流层析试纸条的结构组成：从下至上依次为下部吸水垫、样品区、金标垫、nc膜、检测线为t线、质控线为c线及上部吸水垫；(5)单链扩增子与探针的杂交及检测参见图1，实验原理：正向引物pf，5’经fam修饰和下游引物pr对目的基因进行pcr扩增，pcr反应结束后，双链扩增子经热变性成单链dna分子，与标记的核酸探针p，3’端经biotin修饰杂交，形生杂交复合物(fam和biotin)标记；将含该复合物的反应液上样于侧向流层析试纸条样品垫，随后将侧向流层析试纸条下部吸水垫浸入展开液中，反应液中的杂交复合物的biotin位点与金标垫中链霉亲和素-纳米金复合物结合并随展开液自下而上层析，到达t线时被包被有鼠抗-fam单克隆抗体所捕获,t线由于纳米金复合物的富集，形成肉眼可见红色条带；过剩的纳米金-链霉亲和素继续层析至c线被包被的biotin捕获，形成红色条带；检测结果为阳性。若只有c线呈红色，检测结果阴性。若t线和c线均无色，试纸条失效；实验过程：取10μl上述变性的pcr产物和1μl寡核苷酸探针(10mmol/l)于50μl杂交缓冲液[(1g/lpeg4000,1.5mmgcl2)，ph7.0]中混匀；35℃温育1分钟后进行核酸液相杂交；取10μl杂交混合物上样于层析试纸条的样品垫，将样品垫的下端浸入90μl展开液(0.01mol/lpbs，ph7.4)中，5分钟内肉眼读取结果。2、本发明的一种食品中猪源性成分快速检测试剂盒，包括如下体系：(1)猪线粒体cytb基因的pcr扩增反应体系，具体包括以下组分：(a)pcr模板dna制备溶液样品裂解液：含ctab1g、edta0.3722g、tris-hcl0.7882g、nacl4.09g,调至ph8.0,高温高压灭菌，100ml；萃取液：三氯甲烷:异戊醇(24:1)混合液，60ml；异丙醇：50ml；70％乙醇：200ml；te缓冲液：10mmol/ltris-hcl、1mmol/l的edta(ph8.0)，10ml；(b)猪线粒体cytb基因的一对特异性引物经优化设计并人工合成的引物如下：正向引物：5’-ctatactacggatcctatatattcctag-3’(28bp,tm:61.7℃)；下游引物:5’-fam-ctacgaggtctgttccgatataagg-3’(25bp,tm:64.6℃)，引物的5’端经fam修饰；引物和探针由上海生物工程有限公司合成；(c)pcr反应溶液pcrmastermix：美国abi公司pcrmastermix试剂盒，2ml；ddh2o：5ml；(2)猪线粒体cytb基因的检测体系，具体包括以下组分：(a)猪线粒体cytb基因检测的特异性探针寡核苷酸探针:5’-atcacaaatctactatca-biotin-3’(18bp,tm:48.5℃)，探针的3’端经biotin修饰；(b)单链扩增子与探针的杂交及检测溶液杂交缓冲液：1g/lpeg4000,1.5mmgcl2，ph7.0，100ml；展开液：0.01mol/lpbs，ph7.4，200ml。实例1：食品中猪源性成分快速检测试剂盒特异性检测：用正向引物pf和下游引物(pr)对猪肉及其它6种动物源性成分，羊肉、牛肉、鸡肉、鹅肉、鸭肉、兔肉的dna样本进行pcr扩增、杂交后取产物进行侧向流层析试纸条检测，仅猪肉dna检测结果呈阳性，其它对照以及空白对照均为阴性。结果表明该方法特异性良好，采用一条修饰的特异性探针与单链pcr扩增物杂交，再通过侧向流层析试纸条检测杂交产物，增加了检测的特异性。(见图2)实例2：食品中猪源性成分快速检测试剂盒灵敏性检测：将猪肉dna进行10倍梯度稀释，分别将不同稀释度的dna作为模板进行pcr扩增，同时经琼脂糖凝胶电泳和侧向流层析试纸条进行检测，结果琼脂糖胶电泳法在模板dna量100pg时条带明显模糊，已无法正确判读结果，电泳法的检测灵敏度为100pg。而试纸条检测时，当模板dna量100fg时，仍可明确判断阳性检测结果(见图3)。结果表明试剂盒的检测灵敏度较pcr-琼脂糖凝胶电泳提高1000倍。实例3：食品中猪源性成分快速检测试剂盒用于商业样本的检测1)标本采集与保存：从长春地方超市购买销售比例较大并标明主要成分的28份种肉制品，样品的种类如表1，每个样品做一个平行样。2)改良方法制备样品dna(a)将肉样品及肉制品商业样本剪碎，分别各准确称取0.1g，液氮研磨后转移至1.5ml离心管中，加入800μl裂解液，65℃孵育30min，期间振荡混匀3-4次，12000×g离心5min；(b)上清液移入一洁净离心管中，加入400μl三氯甲烷：异戊醇(24:1)混合液，振荡混匀后12000×g离心5min；(c)取上清液于另一洁净离心管中，加入320μl异丙醇，室温沉淀30min；(d)12000×g离心5min，弃上清液，向沉淀中加入500μl70％乙醇漂洗，12000×g离心5min；(e)弃上清液，沉淀室温干燥后用20μlte缓冲液溶解，测定od值后-20℃保存3)pcr反应体系和反应条件pcr反应体系:pcrmastermix(美国abi公司pcrmastermix试剂盒)5.2μl,10μmol/l引物各0.8μl,模板dna1μl,ddh2o17.2μl，总体积25μl；pcr反应条件:95℃预变性5min,95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,40个循环；95℃变性2分钟，置于冰上；4)侧向流层析试纸条的制备胶体金颗粒-链霉亲和素(aunps-sa)复合物制备：调整胶体金(aunps)溶液ph至7.0，18μg链酶亲和素(sa)为稳定1ml30nm胶体金的蛋白量，在该条件下将aunps与sa偶联,铺于金标垫上；将1.2mg/ml的鼠抗fam抗体和1.2mg/ml的bsa-生物素偶联物划在尼龙膜表面，形成检测线为t线和控制线为c线。侧向流层析试纸条的结构组成：从下至上依次为下部吸水垫、样品区、金标垫、nc膜、t线、c线及上部吸水垫；5)单链扩增子与探针的杂交及检测取10μl上述变性的pcr产物和1μl寡核苷酸探针(10mmol/l)于50μl杂交缓冲液[(1g/lpeg4000,1.5mmgcl2)，ph7.0]中混匀；35℃温育1分钟后进行核酸液相杂交；取10μl杂交混合物上样于侧向流层析试纸条的样品垫，将样品垫的下端浸入90μl展开液(0.01mol/lpbs，ph7.4)中，于5分钟内肉眼读取结果。结果：本方法对19份猪肉样本均可检出；另外，在9份午餐肉、牛肉卷等干制品中有5份检测出猪肉成分；对检测结果与商品标注不一致的商品将其对应的pcr产物进行测序，测序结果与检测结果一致。结果表明，该方法在用于在商业样本及复杂食物样本的检测中具有较高的准确性；从检测结果不难看出，市场上猪肉掺假牛肉现象比较为严重，肉制品掺假问题确实是行业的普遍问题。(见表1)表1市售猪肉、牛肉样品鉴定结果table1identificationresultsofcommercialporkandbeefsample结论：本发明对猪线粒体cytb基因检测优化了引物和探针，开发的食品中猪源性成分快速检测试剂盒具有较高灵敏度和特异性，将侧向流层析试纸条快速检测和pcr扩增技术完美结合，省去了常规pcr的电泳、成像等检测步骤，灵敏度比常规pcr高1000倍，其检测结果在5分钟内可肉眼快速判读，简单快速；同时相比于实时荧光定量pcr(qpcr)技术，避免了需要较高技术要求及昂贵仪器的缺陷，易于推广；同时适用于发展中国家、基层实验室及商场自检机构进行猪源性成分的快速定性检测，提高检测效率、降低检测成本。当前第1页12当前第1页12