埃博霉素苷类化合物、其制备方法及作为细胞抑制剂的应用的制作方法

专利名称：：埃博霉素苷类化合物、其制备方法及作为细胞抑制剂的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及埃博霉素苷，尤其是埃博霉素苷A(EpothilonosideA)，埃博霉素苷B(EpothilonosideB)，埃博霉素苷C(EpothilonosideC),埃博霉素苷D(EpothilonosideD)和埃博霉素苷E(EpothilonosideE)，其制备方法以及作为细胞抑制剂在治疗组合物中的应用。
背景技术：
：埃博霉素(Epothilone)是由微生物粘细菌产生的一种新型天然细胞毒化合物，是一类新的稳定微管的细胞毒活性成分(参见Gerth，K.等人，J.Antibiot.(抗生素杂志)49，第560-563页(1966))。它与对人类不同实体瘤细胞有明显抗肿瘤活性的紫杉醇在生物学上具有相似性，其以同样方式诱导微管蛋白多聚体形成超稳定态，阻碍有丝分裂，阻止肿瘤细胞繁殖。埃博霉素在来源、合成方法、亲水性、抗肿瘤活性和抗肿瘤谱等方面均优于紫杉醇类药物，与已经确立的治疗相比，尤其是在肿瘤对用紫杉醇治疗已经产生耐药性的情况下，埃博霉素，尤其是埃博霉素A且最优选埃博霉素B具有各种优势，是一类新型抗肿瘤药物，被认为是紫杉醇的更新换代产品，是具有市场潜力的新型抗癌药物，其中埃博霉素B和A的化学结构如图所示。ROOHOEpothiloneA(R=H);EpothiloneB(R=CH3)自1995年发现埃博霉素的抗癌活性后，其得到了包括化学、生物学、医药学等多方面的广泛而深入的研究，并取得了一定的成果。其中对埃博霉素A和B类似物的研究，无论是从天然来源方面还是从化学合成方面一直都没有停止过。CN03822662专利保护了埃博霉素的改进发酵和分离纯化方法，专利97199814.0中保护了埃博霉素C、D、E和F的结构、制备方法及其作用，随后30多个埃博霉素类似物也由两个粘细菌菌禾中5bra"p'〃/77ce^Wos〃/z7，trainsSoce90/B2禾口Soce90/DB中分离得到。(JournalofNaturalProducts,2001，64(7):847-856)。专利99807769.0，200380103451.8，02816441.5，03822561.1和99815116.5等中保护了埃博霉素多种类似物的结构及其制备方法和用途。经过检索发现，无论是发酵产生的还是经过化学合成方法得到的埃博霉素类似物均未包含有埃博霉素和糖相连后形成的埃博霉素苷类化合物。经活性测试，埃博霉素苷类化合物具有和埃博霉素B相当的抑制肿瘤细胞的作用，同时这类化合物因为和糖基相连，亲水性要优于它们相对应的埃博霉素苷元。例如，实验表明，埃博霉素A在25'C水溶液中的溶解度为324mg/L，而埃博霉素苷A在25'C水溶液中的溶解度达到1329mg/L，这进一步说明埃博霉素苷类化合物比它们相对应的埃博霉素苷元具有更好的亲水性，而且水溶性好的埃博霉素苷类化合物有利于在体液内转运，达到作用部位与受体结合，从而产生药物效应。本发明主要是涉及由粘细菌发酵液中得到的一类新的埃博霉素苷及其它们的制备方法和用途。
发明内容本发明涉及下式表示的埃博霉素苷类化合物及其制备方法及作为细胞抑制剂的应用ORO^巾R、R4同时或其中之一为碳水化合物;R,为氢、低级烷基或羟基；R2、R3为氢或低级烷基；且Z为0或-Z-为两个键接碳原子之间的键。^巾(1)R、R4主要选自C4-C12的糖基，优选C5-C6的单糖基和C12的双糖基，更优选的C5的单糖基是阿拉伯糖基、木糖基、核糖基或者来苏糖基;C6的单糖基是葡糖基、果糖基、半乳糖基、鼠李糖基或者甘露糖基；C12的双糖基为蔗糖基、麦芽糖基或者乳糖基。最优选的C5的糖基为阿拉伯糖基，再优选D-构型的呋喃阿拉伯糖基。(2)K、R2、R3所优选的低级垸基为C1-C8的垸基，优选甲基和乙基。在本申请中，碳水化合物为糖基化合物，主要选自C4-C12的糖基，优选C5-C6的单糖基和C12的双糖基，更优选的C5的单糖基是阿拉伯糖基、木糖基、核糖基或者来苏糖基；C6的单糖基是葡糖基、果糖基、半乳糖基、鼠李糖基或者甘露糖基；C12的双糖基为蔗糖基、麦芽糖基或者乳糖基。最优选的C5的单糖基为阿拉伯糖基，再优选-D构型的呋喃阿拉伯糖基。低级烷基是指具有110个碳原子的直链和支链饱和烃基，优选Cl-C8的烷基，比如，例如为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基和辛基等等；更优选甲基和乙基。在对产埃博霉素A和B的粘细菌菌株大规模发酵和提取分离过程中发现该菌株中还产生很多埃博霉素类似物，其中埃博霉素和糖相连形成的糖苷化合物为一类未见报道的新颖的埃博霉素衍生物。经过初步的对肿瘤细胞抑制作用的测试，发现这些埃博霉素苷类化合物具有和埃博霉素B相似的活性，同时这类化合物因为和糖基相连，亲水性要优于埃博霉素B和A及其他埃博霉素类似物。以下是这些埃博霉素苷类化合物的提取分离及结构鉴定的描述和它们对几种肿瘤细胞的抑制作用。本发明涉及一类埃博霉素苷的发酵、提取、分离过程，其包含以下步骤(l)发酵工艺纤维堆囊菌(5"ara/7^'咖cel/Wos娜)菌株So0157-2(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM208078)利用可同化的碳源、氮源和非极性大孔吸附树脂在通氧、搅拌的条件下深层发酵，得到含有非极性大孔吸附树脂发酵培养液。培养条件参见罗立新等"纤维堆囊菌发酵产生埃博霉素条件的优化"(华南理工大学学报，2006,34(5))。从申请日起二十年内申请人承诺该菌株可以向公众发放该菌株。优选其中所述的可同化的碳源为淀粉、葡萄糖、甘油、糊精或者蔗糖；优选其中所述的可同化的氮源是指棉籽蛋白粉、酵母粉或者蛋白胨；其中所述发酵工艺优选在以下条件下操作罐压为0.03-0.04bar，搅拌转速为50-250rpm，通气流量为500-1000L/h，26-32。C培养8-16天得到粘细菌的发酵液。(2)、提取和分离工艺使上述发酵液通过树脂、硅胶和S印hadexLH-20凝胶处理，得到含有埃博霉素苷A，埃博霉素苷B，埃博霉素苷C，埃博霉素苷D和埃博霉素苷E的粗品，在反相柱中用含有低级烷基醇或氰(腈)的混合溶剂进行层析。优选其中使用反相C18的柱填料，并且使用的混合溶剂为乙腈的水溶液，甲醇的水溶液或者甲醇、乙腈混合有机溶剂的水溶液进行洗脱。更具体的所述粗品的制备工艺如下所述a.使加入了第一种非极性大孔吸附树脂的发酵液过振动筛，同时水洗除杂，然后把大孔树脂装柱，用乙醇溶液进行梯度洗脱，收集并合并乙醇洗脱液；b.将合并后的乙醇洗脱液用水稀释成适宜浓度的醇溶液，或者经过真空蒸发浓縮至适当体积后再稀释成适宜浓度的醇溶液，上第二种非极性大孔吸附树脂柱，用乙醇溶液梯度洗脱，收集并合并适当梯度下的洗脱流分，将合并后的流分经过真空浓縮至干，即得含有埃博霉素苷A，埃博霉素苷B，埃博霉素苷C，埃博霉素苷D和埃博霉素苷E的混合样品；c.以上混合样品上硅胶柱，S印hadexLH-20凝胶柱，最后得到含有埃博霉素苷A，埃博霉素苷B，埃博霉素苷C，埃博霉素苷D和埃博霉素苷E的粗品。本发明中，上述第一种加入发酵液中的大孔树脂和第二种用于初步分离的大孔树脂均为非极性大孔吸附树脂，它们可以是同一种非极性大孔吸附树脂，也可以为不同的非极性大孔吸附树脂。其中，本发明第一种非极性大孔吸附树脂优选为XAD-1600或HP-20，如AmberliteXAD-1600(Rohm&Haas，美国)、DiaionHP-20(MitsubishiChemical,日本)。本发明中的第二种非极性大孔吸附树脂优选为H41或H60型号的非极性大孔吸附树脂(江苏省，林化所南京科技开发总公司所产)本发明优选为H41型号的非极性大孔吸附树脂。本发明中，经过第二种非极性大孔吸附树脂分离后，收集的适当梯度下的流分为乙醇梯度为50-100%，优选60%-70%。本发明还涉及一种分离和提纯埃博霉素苷A，埃博霉素苷B，埃博霉素苷C，埃博霉素苷D和埃博霉素苷E的方法，其特征在于，通过以上方法处理得到的粗品在反相柱中用含有低级垸基醇或氰(腈)的混合溶剂进行层析。其中使用了反相C18的柱填料，并且使用的混合溶剂为乙腈的水溶液，甲醇的水溶液或者甲醇、乙腈混合有机溶剂的水溶液进行洗脱。最后得到博霉素苷A，埃博霉素苷B，埃博霉素苷C，埃博霉素苷D和埃博霉素苷E的单体化合物。本发明还涉及到埃博霉素苷A，埃博霉素苷B，埃博霉素苷C，埃博霉素苷D和埃博霉素苷E的结构确认。所分到的埃博霉素苷A，埃博霉素苷B，埃博霉素苷C，埃博霉素苷D和埃博霉素苷E单体经过广泛的波谱研究和化学反应确认了他们的结构。其中埃博霉素苷的苷元经过详细的波谱分析(核磁共振、质谱、红外和紫外)即为埃博霉素类化合物，其所连糖的鉴定是通过用三氟乙酸对埃博霉素苷进行水解得到单个的糖，然后经过薄层层析对照，确定了其所连糖的种类。本发明还涉及结构表征如下的化合物埃博霉素苷A(3-O"CrD-阿拉伯呋喃糖-埃博霉素A)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>其物理化学性质如下性状(Appearance):无色油状物比旋度(Specificrotation):[a]25D-13.3(c0.3,EtOH);ESIMS历/z:626[M+H]+，648[M+Na]+High-resolutionESIMS:648.2840(calcdforC3孔7NO,。SNa，648.2818).UVabsorptionspectrum入max(EtOH)nm(O:249(12083)206(20416)IRabsorptionspectrum:3444，2968，2926，2860，1738，1689cm—1;'H丽R(CDC13,400MHz)《2.92(1H,m，H-2a)，2.74(1H，m，H-2b)，4.11(1H，dd，/二9.8，2.2Hz，H—3)，3.20(1H，m，H—6)，3.71(1H，m，H—7)，1.56(1H，m，H—8)，1.56(1H，m，H—9a)，1.29(1H，m，H-9b)，1.56(2H,m，H-10)，1.78(1H，m，H-lla),1.50(1H'm，H-llb)，2.96(1H，m，H-12)，3.12(1H，m，H-13),2.23(1H，m，H-14a)，1.84(1H，m，H-14b)，5.38(1H，brd，/=9.8Hz，H-15)，6.55(1H，brs，H-17)，7.26(1H，s，H—19)，2.69(3H，s，H_21)，1.20(3H，s，H—22),1.32(3H，s，H—23)，1.16(3H，d，/二6.7Hz，H—24),1.03(3H，d，/=6.8Hz，H—25)，2.07(3H，brs，H-27)，5.12(1H，d，/=1.2Hz,H—1')，3.82(1H，dd，/=3.3，1.2Hz，H_2，)，3.77(1H，dd，/=5.2，3.3Hz，H-3'),4.04(1H，m,H-4，)，3.68(1H，m，H-5，a)，3.60(1H，dd，/=11.8，5.0Hz，H-5，b);13C丽R(CDC13,100MHz)5172,6(s，C_l)，39.2(t，C-2)，80.7(d，C—3)，53.6(s，C-4)，218.9(s，C—5)，47.7(d,C—6)，78.7(d，C—7)，37.3(d，C-8),31.7(t，C-9)，25.7(t,C-10)，28.3(t，C-11)，58.9(d，C—12),56.5(d，C_13)，33.8(t，C一14)，78.3(d,C—15)，139.6(s，C一16)，120.9(d，C—17)，153.0(s，C一18)，118.0(d,C—19)，167.1(s，C-20)，18.7(q，C-21)，24.8(q，C-22)，23.7(q，C-23)，16.6(q，C-24)，19.0(q，C-25)，15.2(q，C-27)，109.0(d，C-l，)，83.0(d，C—2，)，78.7(d，C_3，)，86.6(d，C—4，)，63.1(t，C—5');本发明还涉及结构表征如下的化合物埃博霉素苷B(3-^crD-阿拉伯呋喃糖-埃博霉素B)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>其物理化学性质如下性状无色油状物比旋度[a]25D-3.57(c0.28，EtOH);ESIMS:640[M+H]+，662[M+Na]+High—resolutionESIMS:662,2982(calcdforC32H49N010SNa，662.2975).UVabsorptionspectrum入max(EtOH)nm(e):249(10437)212(13845)IRabsorptionspectrum:r隨3455，2973，2927，2863，1739，1689cm—';'H丽R(CDC13，400MHz)52.60(1H，dd，/=16.9，10.0Hz，H-2a)，2.42(IH，dd，/=16.9，2.4Hz，H—2b)，4.25(1H,m，H_3)，3.17(IH，m，H—6)，3.71(1H，m，H-7)，1.74(1H，m，H-8)，1.63(1H，m，H—9a)，1.39(1H，m，H-9b)，1.53(2H，m，H—10),1,74(1H，m，H-lla)，1.41(1H，m，H-llb)，2.81(1H，dd，/=9.0,3.0Hz,H_13)，2.13(1H，m，H-14a)，1.99(1H，m，H-14b)，5.51(1H，dd，9.6，2.5Hz，H-15),6.61(1H，brs，H-17),6.99(1H，s，H—19)，2.69(3H，s，H—21)，1.00(3H，s，H-22)，1.34(3H，s，H—23)，1.15(3H，d，/=6.8Hz，H—24)，1.02(3H，d，/二7.0Hz，H—25)，1.29(3H，s，H—26)，2.06(3H，d，/二1.0Hz，H-27)，5.09(1H，brs,H-1，)，3.95(1H，s，H-2，)，3.95(1H，s，H-3，)，4.25(1H，m，H-4，)，3.81(1H，dd，11.9，2.8Hz，H—5，a)，3.72(1H，dd，/=11.9，3.0Hz,H-5，b);13C丽R(CDCL，100MHz)《170.1(s，C—1)，39.0(t，C-2)，78.6(d，C—3)，53.5(s，C—4)，218.9(s，C—5)，42.8(d，C-6)，73.3(d，C—7)，35.7(d，C-8)，31.0(t,C-9)，21.9(t，C-IO)，32.8(t，C-11)，62.0(s，C—12)，61.8(d，C—13)，32.9(t，C一14)，78.2(d，C—15)，137.7(s，C-16)，121.7(d，C-17)，151.3(s，C-18),117.0(d，C-19)，166.3(s，C-20)，17.0(q，C-21)，19.8(q，C-22),23.4(q，C-23)，12.7(q，C—24)，17.0(q，C—25)，22.3(q，C—26)，14.7(q，C—27)，108.7(d，C-l，)，79.2(d，C-2，)，78.3(d，C_3，)，87.9(d，C_4，)，62.2(t，C-5，)；本发明还涉及结构表征如下的化合物埃博霉素苷C(3-^crD-阿拉伯呋喃糖-埃博霉素C)1812104'其物理化学性质如下性状无色油状物比旋度[a]25d-27,38(c0.84,EtOH);ESIMST7/z:610[M+H]+，632[M+Na]+High-resolutionESIMS:632.2895(calcdforC31H47N09SNa，632.2869).UVabsorptionspectrum入max(Et0H)nm(e):251(16443)213(20503)IRabsorptionspectrum:pw3457，2972，2926，2857，1738,1687cm1;'H丽R(CDC13，400MHz)^2.58(1H，dd，/=15.8，10.8Hz，H-2a)，2.43(1H，dd，/=15.8，2.1Hz，H—2b),4.24(1H，m,H—3)，3.06(IH，m，H-6)，3.71(1H，m，H—7)，1.70(1H，m，H—8)，1.31(2H，m，H-9)，1.65(1H，m，H—10a)，1.27(1H，m，H—10b)，2.25(IH，m，H—lla)，2.01(1H，m，H—lib),5.47(1H，m，H—12)，5.41(1H，m，H—13)，2.81(IH，m，H—14a)，2.16(1H，m，H—14b)，5.37(1H，brd，10.1Hz'H—15)，6.59(1H，brs,H-17)，6.98(1H，s,H-19)，2.70(3H,s'H-21)，1.09(3H，s，H—22)，1.36(3H，s，H—23),1.19(3H，d，/=6.7Hz，H—24)，1.02(3H,d，力6.8Hz，H—25)，2.07(3H，d，/=0.8Hz，H—27)，5.19(1H，brs，H-l，)，3.92(1H，brs，H—2，)，3.95(1H，brd,/=8.6Hz，H—3，)，4.26(1H，m，H—4，)，3.85(1H，dd，,11.9，2.9Hz，H—5，a)，3.76(1H,dd，/二11.9，1.7Hz，H—5，b);13CNMR(CDC13，100MHz)《169.9(s，C—1)，39.0(t，C—2)，79.9(d，C-3)，53.3(s'C-4)，219,7(s，C-5)，42.2(d，C-6)，73.9(d，C-7)，37.9(d，C-8)，32.2(t，C—9)，27.2(t，C—10)，27.5(t，C—11)，133.7(d，C-12)，124.6(d，C-13)，31.6(t，C-14),79,5(d，C-15)，138.4(s，C-16)，120.9(d，C—17)，151.6(s，C—18)，116.6(d，C-19)，166.2(s，C—20)，18.8(q，C—21),20.1(q，C—22)，23.9(q'C—23)，13.3(q，C—24)，15.8(q，C-25),15.1(q，C-27)，109.2(d，C—1，)，78.8(d，C—2')，78.2(d,C_3，)，88.1(d，C一4，)，62.3(t，C—5，)；本发明还涉及结构表征如下的化合物埃博霉素苷D(3-0-cH)-阿拉伯呋喃糖-27-羟基埃博霉素C)其物理化学性质如下性状无色油状物比旋度[a]25D-26.19(c0.42,EtOH);ESIMS/z/z:626[M+H]+，648[M+Na]+High-resolutionESIMS:648.2800(calcdfor(^HwNOmSNa,648.2818).UVabsorptionspectrum入ax(EtOH)nm(e):254(10714)209(9970)IRabsorptionspectrum:;3446，2971，2927，2858，1737'1688cm—1;'H丽R(CDC13，400MHz)52.60(1H，dd，/=15.6,10.6Hz，H-2a),2.48(IH，dd'/=15.6，2.4Hz，H—2b)，4.24(1H，m，H—3)，3.08(IH，m，H—6)，3.72(1H，m,H_7)，1.74(1H，m，H—8)，1.34(2H，m，H_9)，1.68(1H，m,H-10a)，1.26(1H，m，H—10b)，2.27(IH，m，H-lla)，2.00(1H，m，H-lib),5.49(IH，m，H—12)，5.36(IH，m，H—13)，2.85(IH，m，H—14a)，2.11(1H，m，H-14b)，5.38(1H，brd，10.6Hz，H—15)，6.61(IH，brs,H—17)，7.13(1H,s，H—19)，4.45(IH，brd，/=14.0Hz,H-27a)，4.35(1H，brd，户14.0Hz，H-27b)，2.74(3H，s，H-21),1.09(3H，s,H-22)，1.33(3H，s，H-23)，1.08(3H，d，/二6.8Hz，H-24)，1.03(3H，d，7.1Hz，H-25)，5.18(1H，brs,H—1')，3.86(1H，m，H—2，)，3.95(1H，brd，9.9Hz，H—3，)，4.25(1H，m，H—4')，3.84(1H,brd，/二11.5Hz，H_5，a)，3.73(1H，brd，/=11.5Hz，H-5，b);13CNMR(CDC13，100MHz)5170.3(s，C-l)，38.8(t，C-2)，78.8(d，C—3)，53.1(s，C—4)，219.7(s，C一5)，42.4(d，C—6)，73.9(d，C一7)，37.9(d，C—8),32.3(t，C一9)，27.3(t，C一IO)，27.6(t，C—11)，133.9(s，C—12)，124.4(d，C-13),32.1(t，C一14)，79.6(d，C一15)，140.5(s，C—16)，123.4(d，C-17),150.9(s，C_18)，119.3(d，C—19),167.3(s，C—20)，19.1(q，C—21)，20.8(q，C—22)，23.6(q,C—23)，13.3(q，C—24)，15.8(q，C—25)，58.3(t,C—27)，108.8(d，C—1，)，79.6(d，C-2，)，77.9(d，C-3，)，87.9(d，C-4，)，62.4(t,C-5，)；本发明还涉及结构表征如下的化合物埃博霉素苷E(3-^crD-阿拉伯呋喃糖-25-去甲基埃博霉素A)4'其物理化学性质如下性状无色油状物比旋度[a]25D7.96(c1.13，EtOH);ESIMS/z/z:612[M+H]+，634[M+Na]+High-resolutionESIMS:634.2662(calcdforC30H45N01()SNa，634.2662).UVabsorptionspectrumAmax(EtOH)nm(e):250(7087)214(8798)IRabsorptionspectrum:「raax3438，2979,2929，2861，1736，1690cm';'H丽R(CDCU400MHz)52.62(1H，dd，/=15.4，9,3Hz，H-2a)，2.48(1H，dd，/=15.4，2.6Hz，H-2b)，4.43(1H，dd，/:9.3，3.0Hz，H—3)，2.96(1H，m,H—6)，3.85(1H，m，H—7)，1.60(1H，m，H—8a)，1.46(1H，m，H-8b),1.60(2H，m，H-9)，1.60(1H，m，H-10a)，1.46(IH，m，H—10b)，1.66(1H，m，H—lla)，1,60(1H，m，H-llb)，2.93(IH，m,H-12),3.02(1H，m，H-13)，2.12(1H，m，H-14a)，1.94(1H，m，23H-14b)，5.49(1H，dd，9.0，3.8Hz，H-15)，6.65(1H，brs，H-17)，7.01(1H，s，H-19),18.8(3H，s，H-21)，1.11(3H，s，H-22)，1.33(3H，s，H-23)，1.15(3H，d，6.9Hz，H—24)，2.07(3H，d，/=0.9Hz，H-27)，5.15(1H，brs,H-1，)，3.94(1H，brs，H-2，)，3.98(1H，m，H—3，)，4.24(1H，m，H—4，)，3.82(1H，dd，/=11.9，2.6Hz，H—5，a)，3.73(1H，dd，/=11.9，2.1Hz,H-5，b);13CNMR(CDCU100MHz)《169.9(s，C—1)，38.8(t，C一2)，78.5(d，C—3)，53.2(s，C—4)，220.5(s,C—5)，44.4(d，C—6)，69.1(d，C—7)，31.9(t，C—8)，24.8(t，C—9)，23.8(t，C—10)，26.4(t，C—11),57.1(d，C-12)，54.4(d，C—13)，32.2(t，C—14)，77.9(d,C—15)，137.5(s，C-16),121.4(d，C-17)，151.4(s，C—18)，116.9(d,C—19)，166.2(s，C一20)，18.8(q'021)，20.0(q，C—22)，23.2(q，C—23)，11.3(q，C—24)，15.3(q，C—27)，108.4(d，C—1，)，79.4(d，C_2，)，78.3(d，C-3，)，88.0(d，C—4')，62.1(t，C—5，)；最后本发明涉及治疗性组合物，该组合物由一种或多种上述的化合物与一种或者多种常规载体和/或稀释剂组成。上述化合物以埃博霉素A和B为对照样品，测试他们对肿瘤细胞的抑制作用，结果表明这类化合物与埃博霉素B具有相似的肿瘤细胞抑制作用(详细情况见实施例3)，具有进一步研究和开发的价值。埃博霉素苷类化合物的发酵、提取，分离及活性实验见下面的具体实施例。以下实施例是对本发明的进一步说明但不限制本发明。实施例1，So0157-2菌种固体斜面培养固体斜面培养基为S-42培养基，成份为胰蛋白胨0.05%，MgS04.7H200.15%,琼脂1.5%，pH7.4，灭菌后分别加入以下无菌溶液，其终浓度分别为(NH4)2S040.05°/。，CaCl2.2H200.1%，K2HP040.006%，FeEDTA0.0008%,连二硫酸钠0.01%，葡萄糖0.35%。斜面28'C培养10天，接种到种子培养基，种子培养基成份为淀粉2.0%，葡萄糖0.2%，棉籽蛋白粉1.0%，酵母粉0.2%，硫酸镁O.1%，碳酸钙O.2%，微量元素液lml/L，pH7.4摇瓶种子培养时间为72小时，培养条件为250rpm，28°C，接种量为5%。种子罐培养条件50升(一级种子培养液)罐压为0.03-0.04bar，搅拌转速为100rpm,通气流量为500L/h，28'C培养3天，接种量为10%。500升(二级种子培养液)罐压为0.03-0.04bar，搅拌转速为50rpm，通气流量为25mVh，28t:培养3天，接种量为10%。发酵培养基(5吨发酵罐)配方，淀粉3.0%，葡萄糖0.2%，棉籽蛋白粉1.0%，酵母粉0.4%，硫酸镁0.1%，碳酸钙O.3%，微量元素液lml/L，树脂1.5%，泡敌O.03%，pH7.4。培养条件罐压0.03-0.04bar，搅拌转速为50rpm，通气流量为120mVh，28'C培养12天。So0157-2菌种固体斜面培养固体斜面培养基为S-42培养基，成份为胰蛋白胨0.05%，MgS04.7H200.15%，琼脂1.5%，pH7.4，灭菌后分别加入以下无菌溶液，其终浓度分别为(肌)2S040.05%，CaCl2.2H200.1%，K2HP040.006%，FeEDTA0.0008%，连二硫酸钠0.01%，葡萄糖0.35%。斜面28'C培养10天，接种到种子培养基，种子培养基成份为淀粉1.8%，葡萄糖0.5%，棉籽蛋白粉0.8%，酵母粉0.5%，硫酸镁O.1%，碳酸钙O.3%，微量元素液lml/L，pH7.4摇瓶种子培养时间为72小时，培养条件为250rpm，28°C，接种量为5%。种子罐培养条件50升(一级种子培养液)罐压为0.03-0.04bar，搅袢转速为100rpm，通气流量为500L/h，28。C培养4天，接种量为5%。500升(二级种子培养液)罐压为0.03-0.04bar,搅袢转速为50rpm，通气流量为25mVh，28'C培养4天，接种量为5%。发酵培养基(5吨发酵罐)配方，淀粉3.5%，葡萄糖0.1%，棉籽蛋白粉1.2%，酵母粉0.8%，硫酸镁O.1%，氯化钙O.3%，微量元素液lml/L，树脂2.0%，泡敌0.03%，pH7.4。培养条件罐压0.03-0.04bar，搅拌转速为50rpm，通气流量为120mVh，28'C培养11天。实施例3埃博霉素苷A、B、C、D和E的提取分离将加入了XAD-1600树脂的3吨产埃博霉素的发酵液过振动筛，并用水洗树脂。树脂用30%乙醇溶液上柱，然后用95%乙醇溶液洗脱，分段收集洗脱流分，经过HPLC分析后，收集并合并含有埃博霉素苷A，埃博霉素苷B，埃博霉素苷C，埃博霉素苷D和埃博霉素苷E的流分。将上述乙醇洗脱液配成30%乙醇溶液，上H41树脂柱，用30%，40%,50%，60%，70%的乙醇溶液，每浓度2柱体积洗脱，收集60%-70%乙醇溶液洗脱流分，将合并后的流分经过真空浓縮至干，即得含有埃博霉素苷A，埃博霉素苷B，埃博霉素苷C，埃博霉素苷D和埃博霉素苷E的混合样品；以上混合样品用CHCl3溶解后，上硅胶柱，用70:30，40:60的石油醚/丙酮梯度洗脱，分段收集洗脱流分，TLC检测，得到EP-1、EP-2、EP-3、EP-4四个组分。其中EP—;l主要含有埃博霉素a和埃博霉素bEP-2上S印hadexLH-20，乙醇洗脱，收集目标组分真空浓縮至干。在以下条件下对上述浓缩物进行反向色谱分离液相系统Agilent1100半制备高压液相色谱仪柱子ZORBAX.EclipseXDB-C18(250mm*9.4mm)洗脱剂甲醇/水=80:20流速1.5mL/min检测波长A=249nm收集保留时间为16.2min的峰得到埃博霉素苷C。EP-3上S印hadexLH_20，乙醇洗脱，收集目标组分真空浓縮至干。在以下条件下对上述浓縮物进行反向色谱分离液相系统Agilent1100半制备高压液相色谱仪柱子ZORBAX.EclipseXDB-C18(250mm*9.4腿)洗脱剂乙腈/水=40:60流速-1.5mlVmin检测波长X=249nm收集保留时间为14.5-16.5min和22.8min的峰。保留时间为14.5-16.5min的峰再进行反向色谱分离液相系统Agilent1100半制备高压液相色谱仪柱子ZORBAX.EclipseXDB-C18(250mm*9.4ram)洗脱剂乙腈/甲醇/水=35:10:55流速1.5miymin检测波长X=249nm收集保留时间为26.6min的峰得到埃博霉素苷E。保留时间为22.8min的部分再进行反向色谱分离液相系统Agilent1100半制备高压液相色谱仪柱子ZORBAX.EclipseXDB-C18(250mm*9.4mm)洗脱剂乙腈/水=60:40流速1.5mlVinin检测波长A=249nm收集保留时间为8.8min的峰得到埃博霉素苷D。EP-4上S印hadexLH-20，乙醇洗脱，收集目标组分真空浓縮至干。在以下条件下对上述浓縮物进行反向色谱分离液相系统Agilent1100半制备高压液相色谱仪柱子ZORBAX.EclipseXDB-C18(250mm*9.4腿)洗脱剂乙腈/水=45:55流速1.5mU/min检测波长X=249nm收集保留时间为15min和17min的峰。其中保留时间为17min的峰为埃博霉素苷A。保留时间为15min的部分再进行反向色谱分离液相系统Agilent1100半制备高压液相色谱仪柱子ZORBAX.EclipseXDB-C18(250mm*9.4誦)洗脱剂乙腈/甲醇/水二35:10:55流速1.5mlVmin检测波长A=249nm收集保留时间为28.lmin的峰得到埃博霉素苷B。实施例4埃博霉素苷A、B、C、D和E的活性研究采用CCK-8法[1]检测各化合物的细胞毒性。取对数生长期的细胞收集于离心管中，1000rpm/min离心5分钟，计数，重悬细胞浓度至50000个/ml，100ul/孔加入96孔细胞培养板。阴性对照为100ul/孔的每ml/50000的细胞溶液，空白对照为100ul细胞培养液(RPMI1640+10%胎牛血清)。然后置于37°C、5%(:02培养箱中，培养过夜。用DMSO分别将各待测化合物稀释至10mg/ml，再用细胞培养液倍比稀释，将每种依次递减浓度的各待测化合物样品液加入96孔细胞培养板中，每孔25ul，；阴性对照和空白对照均加25ul的细胞培养液。再放于37°C、5G/oC02培养箱中培养48hr。每个样品均8个复孔。每个孔内加入10ul的CCK-8试剂继续培养3.54h后，在490nm的波长下测定吸光度(A)值。由上测得埃博霉素苷A、B、C、D和E对人肺腺癌细胞A549，人肺癌细胞NCI-H460，人前列腺癌细胞PC-3，人前列腺癌细胞DU-145,人乳腺癌细胞MDA-MB-231，人结肠癌细胞HCT-116的IC5。(yg/mL)，并与埃博霉素B对这些肿瘤细胞的ICs。值进行了对比，结果见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>参考文献TominageH，IshiyamaM，Ohset0Awater-soluabletetrazoliumsaltusefulforcolorimetriecellvisibilityassay.AnalCo腿un，1999，36:47—50。权利要求1、一种式I化合物其中R、R4同时或其中之一为碳水化合物；R1为氢、C1-C10烷基或羟基；R2、R3各自独立地为氢或C1-C10烷基；且Z为O或-Z-为两个键接碳原子之间的键。2、根据权利要求l的化合物，其中R、&选自C4-C12的糖基。3、根据权利要求2的化合物，其中R、R4选自C5-C6的单糖基和C12的双糖基。4、根据权利要求3的化合物，其中C5的糖基是阿拉伯糖基、木糖基、核糖基或者来苏糖基；C6的糖基是葡糖基、果糖基、半乳糖基、鼠李糖基或者甘露糖基；C12的双糖基为蔗糖基、麦芽糖基或者乳糖基。5、根据权利要求4的化合物，其中C5的糖基为阿拉伯糖基。6、根据权利要求5的化合物，其中所述阿拉伯糖基为D构型的呋喃阿拉伯糖基。7、根据权利要求16任一项的化合物，其中R,、R2、R3中的垸基为Cl-C8的烷基。8、根据权利要求16任一项的化合物，其中R,、R2、R3中的垸基为甲基或者乙基。9、根据权利要求l的化合物，是由下式表征的埃博霉素苷A:i、10、根据权利要求l的化合物，是由下式表征的埃博霉素苷B:11.<image>imageseeoriginaldocumentpage3</image>12、一种根据权利要求1的化合物，是由下式表征的埃博霉素苷D:o三…s,13.<image>imageseeoriginaldocumentpage4</image>14、一种产生含有权利要求l的化合物的发酵液的制备方法，其特征为纤维堆囊菌(5b/"朋p'咖ce"Wos鹏)菌株So0157-2利用可同化的碳源、氮源和非极性大孔吸附树脂在通氧、搅拌的条件下深层发酵所得。15、根据权利要求14的方法，可同化的碳源选自淀粉、葡萄糖、甘油、糊精或者蔗糖。16、根据权利要求14的方法，可同化的氮源选自棉籽蛋白粉、酵母粉或者蛋白胨。17、根据权利要求14的方法，发酵工艺条件如下罐压为0.03-0.04bar，搅拌转速为50-250rpm，通气流量为500-1000L/h，26-32。C培养8-16天得到粘细菌的发酵液。18、根据权利要求14的方法，其中化合物为权利要求9的埃博霉素苷A，权利要求10的埃博霉素苷B，权利要求11的埃博霉素苷C，权利要求12的埃博霉素苷D或者权利要求13的埃博霉素苷E。19、一种分离和提纯按照权利要求14中所述方法制备的发酵液中化合物的方法，其特征在于，使发酵液通过树脂、硅胶和S印hadexLH-20凝胶处理，得到含有化合物的粗品，在反相柱中用含有C1-C10烷基醇或氰的混合溶剂进行层析，得到纯的化合物。20、根据权利要求19的方法，其中使用反相C18的柱填料，并且使用的混合溶剂为乙腈的水溶液，甲醇的水溶液或者甲醇、乙腈混合有机溶剂的水溶液进行洗脱。21、根据权利要求19的方法，其中化合物为权利要求9的埃博霉素苷A，权利要求10的埃博霉素苷B，权利要求11的埃博霉素苷C，权利要求12的埃博霉素苷D或者权利要求13的埃博霉素苷E。22、根据权利要求21所述的方法，其特征在于，含有埃博霉素苷A，埃博霉素苷B，埃博霉素苷C，埃博霉素苷D和埃博霉素苷E的粗品采用如下方法制备含有第一种非极性大孔吸附树脂的粘细菌发酵液过振动筛，同时水洗除杂，然后将树脂装柱，用乙醇溶液进行梯度洗脱，收集并合并乙醇洗脱液；将合并后的乙醇洗脱液用水稀释到适宜浓度，上第二种非极性大孔吸附树脂柱，用乙醇溶液进行梯度洗脱，收集并合并适当梯度下的洗脱流分，即得含有埃博霉素苷A，埃博霉素苷B，埃博霉素苷C，埃博霉素苷D和埃博霉素苷E的混合样品；以上混合样品依次上硅胶柱，S印hadexLH-20凝胶柱，最后得到含有埃博霉素苷A，埃博霉素苷B，埃博霉素苷C，埃博霉素苷D和埃博霉素苷E的粗品。23、根据权利要求22所述的方法，其特征在于，第一种非极性大孔吸附树脂为XAD-1600型树脂；第二种非极性大孔吸附树脂为H41型树脂。24、一种药物组合物组合物，包括一种或多种权利要求113任一项的埃博霉素苷类化合物与一种或者多种常规载体和/或稀释剂。25、权利要求113任一项的化合物或权利要求22的药物组合物用于生产细胞毒性治疗剂、免疫抑制剂或用于癌症治疗的治疗剂的用途。全文摘要本发明涉及埃博霉素苷，特别是埃博霉素苷A(EpothilonosideA)，埃博霉素苷B(EpothilonosideB)，埃博霉素苷C(EpothilonosideC)，埃博霉素苷D(EpothilonosideD)和埃博霉素苷E(EpothilonosideE)。本发明还涉及它们的制备方法以及作为细胞抑制剂的作用。文档编号C07H17/00GK101643490SQ200810147308公开日2010年2月10日申请日期2008年8月7日优先权日2008年8月7日发明者波吴,越周,应灵萍,辉张,李越中,王海彬,王继栋,骅白申请人:浙江海正药业股份有限公司