制备鸟苷类化合物及其中间体的方法

专利名称：制备鸟苷类化合物及其中间体的方法
本申请是申请号为01110115.6，申请日为2001年3月27日，发明名称为“制备鸟苷类化合物及其中间体的方法”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用本申请以申请日为2000年3月27日的在先日本专利申请No.2000-087302为基础，并要求其优先权，其全部内容在此引作参考。
背景技术：
本发明涉及制备鸟苷类化合物的方法，该鸟苷类化合物被用作抗病毒剂、反义药物的原料；和涉及鸟苷类化合物的中间体乙二醛-鸟苷类化合物的制备方法。
鸟苷或2′-脱氧鸟苷在工业上主要是通过提取/分离DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)的水解产物来生产，因为化学合成鸟苷或2′-脱氧鸟苷的产率极低。然而，DNA水解产物中除了含有所需的2′-脱氧鸟苷之外，还含有2′-脱氧腺苷、2′-脱氧胞苷和胸苷。RNA的水解产物中除了所需的鸟苷之外，还含有腺苷、胞苷和尿苷。因而，为了只收取鸟苷或2′-脱氧鸟苷，必须实施复杂的提取/分离过程，因此不可避免地提高了产品的成本。
另一方面，业已报道了一种方法，在该方法中，使作为原料的核苷(或脱氧核苷)和核酸的碱基(nucleic acid base)在核苷磷酸化酶的作用下进行碱基交换反应，由此获得所要的核苷(或所要的脱氧核苷)(Hori，N.，Watanabe，M.，Yamazaki，Y.，Mikami，Y.，Agric.Biol.Chem.，53，197-202(1989))。通过这种方法，可以容易地制备腺苷和2′-脱氧腺苷(日本专利申请说明书No.11-46790“制备嘌呤核苷化合物的方法”)。为了用这种酶合成反应方法得到鸟苷和2′-脱氧鸟苷，至少在反应所需的酶能发挥作用的pH范围内，鸟嘌呤必须是溶于水的。一般认为，为了使得酶反应顺利进行，最好反应底物的溶解度至少等于酶的米氏常数(Km)或更高。但是，由于鸟嘌呤的水溶解度不超过几个ppm，所以上述酶合成反应方法不能实际采用。鉴于这种陷于僵局般的状况，需要开发一种制备鸟苷或2′-脱氧鸟苷的有效方法。
发明简述本发明的目的是提供一种以高产率有效制备鸟苷或2′-脱氧鸟苷(即鸟苷类化合物)的方法，以及以高产率有效制备鸟苷类化合物中间体乙二醛-鸟苷或乙二醛-2′-脱氧鸟苷(即乙二醛-鸟苷类化合物)的方法。
本发明人为解决上述问题而进行了刻苦的研究，结果获得了下面的1)-6)项发现。
1)当水溶解度不超过几个ppm的鸟嘌呤与乙二醛反应时，得到下式(1)表示的乙二醛-鸟嘌呤，而乙二醛-鸟嘌呤是溶于水的。
(乙二醛-鸟嘌呤也称为6，7-二氢-6，7-二羟基咪唑并[1，2-a]嘌呤-9(3H)-酮)2)当含有嘌呤核苷磷酸化酶(EC 2.4.2.1)的微生物本身或由该微生物生成的这种酶被用于乙二醛-鸟嘌呤以及核糖-1-磷酸酯和2-脱氧核糖-1-磷酸酯的一种而进行反应时，得到式(2)表示的乙二醛-鸟苷类化合物(即乙二醛-鸟苷或乙二醛-2′-脱氧鸟苷)。或者当含有嘌呤核苷磷酸化酶(EC 2.4.2.1)和嘧啶核苷磷酸化酶(EC 2.4.2.2)的微生物本身或由该微生物生成的这些酶被用于乙二醛-鸟嘌呤以及选自尿苷、2′-脱氧尿苷和胸苷中的任一种，在磷酸根离子的存在下进行反应时，得到式(2)表示的乙二醛-鸟苷类化合物(即乙二醛-鸟苷或乙二醛-2′-脱氧鸟苷)。换言之，乙二醛-鸟嘌呤可以作为嘌呤核苷磷酸化酶的底物。
(其中R表示氢原子或羟基)(乙二醛-鸟苷也称为3-(β-D-赤式-戊-呋喃糖基)-6，7-二氢-6，7-二羟基咪唑并[1，2-a]嘌呤-9(3H)-酮，而乙二醛-2′-脱氧鸟苷也称为3-(2-脱氧-β-D-赤式-戊-呋喃糖基)-6，7-二氢-6，7-二羟基咪唑并[1，2-a]嘌呤-9(3H)-酮)。
3)在上述2)制备所述的乙二醛-鸟苷的方法中，如果加入至少一种选自下面的化合物甘氨酸、亚氨基二乙酸、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸(以后称为“EDTA”)、乙二醇、二(β-氨基乙基醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(以后称为“EGTA”)和这些物质的盐，或者一起加入至少一种上述化合物和硼酸或它的盐，则反应产率显著提高。上述化合物是作为核糖-1-磷酸酯或2-脱氧核糖-1-磷酸酯(它们是底物或碱基交换反应生成的中间体)的稳定剂加入的。
4)从原理是讲，由各种生物生产的核苷磷酸化酶在上述2)的制备方法中作为酶来使用都可能是有效的。但是，由芽胞杆菌属(Bacillusgenus)，埃希氏杆菌属(Escherichia genus)或克雷白氏杆菌属(Klebsiellagenus)微生物生产的酶是适当的，并且，由嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus.)JTS 859(FERM BP-6885)生产的耐热型的酶是特别优选的。
5)当将碱用于通过上述2)的方法得到的乙二醛-鸟苷类化合物而进行反应时，乙二醛-鸟苷类化合物的乙二醛部分很容易地释放出来，从而可以获得鸟苷类化合物(即鸟苷或2′-脱氧鸟苷)。
6)上述制备方法1)-5)可以通过一锅反应来进行。
在上述发现的基础上完成了本发明。
总而言之，本发明涉及下述方法(1)-(16)。
(1)一种制备式(2)表示的乙二醛-鸟苷类化合物的方法 其中R表示氢原子或羟基，该方法包括下面的步骤在嘌呤核苷磷酸化酶的存在下，将式(1)表示的乙二醛-鸟嘌呤与核糖-1-磷酸酯或2-脱氧核糖-1-磷酸酯反应 由此得到乙二醛-鸟苷或乙二醛-2′-脱氧鸟苷。
(2)一种制备式(2)表示的乙二醛-鸟苷类化合物的方法
其中R表示氢原子或羟基，该方法包括下面的步骤在嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的存在下，将式(1)表示的乙二醛-鸟嘌呤 和选自尿苷、2′-脱氧尿苷和胸苷中的任一种物质与磷酸根离子一起反应，由此得到乙二醛-鸟苷或乙二醛-2′-脱氧鸟苷。
(3)制备鸟苷类化合物的方法，该方法包括如下步骤在嘌呤核苷磷酸化酶的存在下，将式(1)表示的乙二醛-鸟嘌呤与核糖-1-磷酸酯或2-脱氧核糖-1-磷酸酯反应 由此得到式(2)表示的化合物
其中R表示氢原子或羟基；以及通过碱来分解式(2)表示的化合物，获得鸟苷或2′-脱氧鸟苷。
(4)制备鸟苷类化合物的方法，该方法包括如下步骤在嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶磷酸化酶的存在下，将式表示(1)的乙二醛-鸟嘌呤 和选自尿苷、2′-脱氧尿苷和胸苷中的任一种物质与磷酸根离子一起反应，由此得到式(2)表示的化合物 其中R表示氢原子或羟基；以及通过碱来分解式(2)表示的化合物，获得鸟苷或2′-脱氧鸟苷。
(5)上述(1)所述的制备乙二醛-鸟苷类化合物的方法，其中，作为嘌呤核苷磷酸化酶所使用的是含有这种酶的微生物本身或由该微生物产生的这种酶。
(6)上述(2)所述的制备乙二醛-鸟苷类化合物的方法，其中，作为嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶所使用的是含有这些酶的微生物本身或由该微生物产生的这些酶。
(7)上述(3)所述的制备鸟苷类化合物的方法，其中，作为嘌呤核苷磷酸化酶所使用的是含有这种酶的微生物本身或由该微生物产生的这种酶。
(8)上述(4)所述的制备鸟苷类化合物的方法，其中，作为嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶所使用的是含有这些酶的微生物本身或由该微生物产生的这些酶。
(9)上述(5)或(6)所述的制备乙二醛-鸟苷类化合物的方法，其中的微生物属于芽胞杆菌属(Bacillus genus)，埃希氏杆菌属(Escherichiagenus)或克雷白氏杆菌属(Klebsiella genus)。
(10)上述(7)或(8)所述的制备鸟苷类化合物的方法，其中的微生物属于芽胞杆菌属(Bacillus genus)，埃希氏杆菌属(Escherichia genus)或克雷白氏杆菌属(Klebsiella genus)。
(11)上述(5)、(6)和(9)中任一项所述的制备乙二醛-鸟苷类化合物的方法，其中的微生物是嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)JTS 859(FERM BP-6885)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)IFO3301、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)IFO 13168或肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)IFO 3321。
(12)上述(7)、(8)和(10)中任一项所述的制备鸟苷类化合物的方法，其中的微生物是嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)JTS859(FERM BP-6885)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)IFO 3301、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)IFO 13168或肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)IFO 3321。
(13)上述(1)、(2)、(5)、(6)、(9)和(11)中任一项所述的制备乙二醛-鸟苷类化合物的方法，其中加入至少一种选自下面的化合物甘氨酸、亚氨基二乙酸、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、乙二醇、二(β-氨基乙基醚)-N，N，N’，N’-四乙酸和它们的盐，或者一起加入至少一种上述化合物和硼酸或它的盐。
(14)上述(3)、(4)、(7)、(8)、(10)和(12)中任一项所述的制备鸟苷类化合物的方法，其中加入至少一种选自下面的化合物甘氨酸、亚氨基二乙酸、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、乙二醇、二(β-氨基乙基醚)-N，N，N’，N’-四乙酸和它们的盐，或者一起加入至少一种上述化合物和硼酸或它的盐。
(15)上述(1)、(2)、(5)、(6)、(9)、(11)和(13)中任一项所述的制备乙二醛-鸟苷类化合物的方法，该方法是按照一锅反应实施的。
(16)上述(3)、(4)、(7)、(8)、(10)、(12)和(14)中任一项所述的制备鸟苷类化合物的方法，该方法是按照一锅反应实施的。
本发明的其它目的和优点将在以下的说明书部分予以陈述，而且从说明书中有些是显而易见的，或者通过实施本发明而知悉。本发明的这些目的和优点可以通过下文具体指出的手段和组合，加以了解和实现。
发明详述以下将详细描述本发明。
<原料>
在本发明中用作原料的乙二醛-鸟嘌呤(即，6，7-二氢-6，7-二羟基咪唑并[1，2-a]嘌呤-9(3H)-酮)，可以高产率地制备。将嘌呤加入到乙二醛水溶液，将该混合物在高温(优选在50-75℃)加热下搅拌15-20小时。乙二醛-鸟嘌呤的水溶解度随温度升高而增加。反应完成后，乙二醛-鸟嘌呤通过冷却结晶，经过滤可以获得白色固体。
然而，实施一锅反应，连续加入核苷磷酸化酶和核糖供体或2-脱氧核糖供体时，所得的乙二醛-鸟嘌呤溶液实际上可以作为原料溶液使用。
在本发明中，用作核糖供体的核糖-1-磷酸酯和尿苷，以及用作2-脱氧核糖供体的2-脱氧核糖-1-磷酸酯、2′-脱氧尿苷和胸苷均可以市购，例如从Sigma Aldrich Japan Co.购得。
<通过酶反应合成乙二醛-鸟苷类化合物的条件>
将核糖供体和2-脱氧核糖供体(以下称为“核糖基供体”)和乙二醛-鸟嘌呤加入到磷酸盐缓冲溶液(pH 6-8，优选pH 7)中，往上述磷酸盐缓冲液混合物中加入生产嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶(或仅生产嘌呤核苷磷酸化酶)的微生物，或加入由该微生物生产的这些酶。所得的反应混合物在最适宜酶的温度下搅拌24-60小时，结果导致“反应式1和反应式2”或“反应式3和反应式4”所表示的反应。乙二醛-2′-脱氧鸟苷通过“反应式1和反应式2”得到，乙二醛-鸟苷通过“反应式3和反应式4”得到。在作为前半部分的“反应式1和反应式3”中，嘧啶核苷磷酸化酶被用作反应酶；在作为后半部分的“反应式2和反应式4”中，嘌呤核苷磷酸化酶被用作反应酶。至于酶的最适宜温度，对于由嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)JTS 859(FERMBP-6885)生产的酶的情形，温度为大约40-70℃。
在本发明的酶反应中，使用嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶(或单独使用嘌呤核苷磷酸化酶)。当嘧啶核苷(尿苷、2′-脱氧尿苷或胸苷)用作核糖基供体时，在作为前半部分反应的“反应式1和反应式3”中生产核糖-1-磷酸酯或2-脱氧核糖-1-磷酸酯，嘧啶核苷磷酸化酶实际上是必须的。另一方面，当核糖-1-磷酸酯或2-脱氧核糖-1-磷酸酯在反应起始时被用作核糖基供体时，“反应式1”或“反应式3”表示的反应是不需要的。但是，在这种情况下，即使存在嘧啶核苷磷酸化酶，对整个酶反应也不会有任何反面影响。
在反应式1-4中，“PYNP”表示嘧啶核苷磷酸化酶，“PUNP”表示嘌呤核苷磷酸化酶。
(反应式1) (反应式2)
(反应式3) (反应式4)
在本发明中，原料核糖基供体的初始浓度是5-1000mM，优选10-100mM。乙二醛-鸟嘌呤一次的溶解量不大，但是，如果假定初始加入的乙二醛-鸟嘌呤一次全部溶解，则所表示的初始浓度为5-1000mM，优选10-100mM。1-20mM磷酸根离子初始浓度是足够用的。
<脱氧核糖-1-磷酸酯等的稳定剂>
在本发明中，如上述反应式所示，即使在核苷(尿苷、2′-脱氧尿苷、胸苷)用作原料的情况下，反应也是通过核糖-1-磷酸酯或2-脱氧核糖-1-磷酸酯作为反应中间体来进行的。这些磷酸酯化合物在性质上不稳定，放置时，随时间自然分解为核糖和磷酸根离子或2-脱氧核糖和磷酸根离子，当磷酸酯酶存在于反应体系时，会加速这种分解。如果这种分解发生，会降低乙二醛-鸟苷类化合物的产率，因为中间体的分解产物核糖或2-脱氧核糖不能作为核苷磷酸化酶的底物。因而，为了增加产率，本发明致力于寻找一种能稳定核糖-1-磷酸酯或2-脱氧核糖-1-磷酸酯和抑制磷酸酯酶活性的物质。
结果发现，加入至少一种选自以下的化合物甘氨酸、亚氨基二乙酸、次氮基三乙酸、EDTA、EGTA和它们的盐，并且在更优选的情况下，一起加入至少一种上述化合物和硼酸或它的盐是有效的。和硼酸或其盐一起加入EDTA或其盐，显示出特别优良的效果。加入的每个组分优选浓度是20-200mM硼酸或其盐、2-10mM上述的至少一种化合物或其盐(即，甘氨酸、亚氨基二乙酸、次氮基三乙酸、EDTA、EGTA)。对所用的上述化合物的盐和硼酸盐没有具体的限制，可以使用任何盐。例如，所用的盐可以是碱金属如钠和钾的盐，以及碱土金属如钙和镁的盐。
<从乙二醛-鸟苷类化合物制备鸟苷类化合物>
乙二醛-鸟苷类化合物在碱的水溶液中，通过分解释放出乙二醛部分，由此获得鸟苷类化合物。作为碱的水溶液，例如，可以使用0.05-0.5N，优选0.1-0.25N的氢氧化钠水溶液。分解反应随pH和温度的增加而加速。但是，必须选择温和的条件，在该条件下连接核糖基团的键不断裂。具体讲，乙二醛-鸟苷类化合物在pH 4-8的范围是相对稳定的，但是在pH 9或更高的条件下分解并释放出乙二醛部分。最后的结论是，优选在60-80℃、pH 9-11范围和1-5小时的时间内，使乙二醛-鸟苷类化合物分解得到鸟苷类化合物。
<鸟苷类化合物的分离和提纯>
从反应溶液中收集产物，可以通过超滤法、离子交换分离法、吸附色谱法、重结晶等进行，反应产物的产量可以通过HPLC方法用UV探测器测定。
<微生物和酶>
原则上讲，本发明使用的嘌呤核苷磷酸化酶(EC 2.4.2.1)和嘧啶核苷磷酸化酶(EC 2.4.2.2)可以是任何来源的。由下述微生物生产的酶是优选的。用于本发明的微生物不受限于这些具体例子，只要该微生物能生产有效量的上述酶即可。
然而，如上述反应式所示，本发明采用核苷或2′-脱氧核苷作为底物，因而必然生成磷酸酯化合物作为中间体。所以，具有强核苷酶和/或磷酸酯酶活性的微生物是不能使用的。
满足这些条件的微生物的例子包括属于芽胞杆菌属(Bacillusgenus)，埃希氏杆菌属(Escherichia genus)或克雷白氏杆菌属(Klebsiellagenus)的微生物。更具体讲，这些微生物包括嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)JTS 859(FERM BP-6885)、大肠埃希氏杆(Escherichia coli)IFO 3301、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)IFO13168和肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)IFO 3321。
在本发明中，原料的溶解度和溶解速度越高，所得到的产率和反应速度就越高。因此，反应期间相对高的温度是有利的。鉴于此，优选使用嗜热细菌和耐热酶。在上述微生物的例子中，嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)JTS 859(FERM BP-6885)是最优选的。
“IFO”表示，这些微生物被保藏在大阪发酵研究所(Institute forFermentation，Osaka(IFO)，2-17-85，zyusohonmachi，Yodogawa-ku，Osaka-shi，532-0024 JAPAN.)“IFO菌株”对想要得到它们的任何人都是开放的。嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)JTS859是国际保藏菌种(其保藏编号为FERM BP-6885)，被保藏于专利微生物国际保存单位，日本国立生命科学和人体技术研究所(Patent Microorganism Depository，National Institute of Bioscience andHuman-Technology，Agency of Industrial Science and Technology)。依照“国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约”(BUDAPESTTREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THEDEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENTPROCEDURE)，微生物JTS 859(FERM BP-6885)保藏于1987年10月20日。
这些微生物生长于细菌的标准培养基上，加入胰蛋白胨、酵母提取液、葡萄糖等，生长得更好并生成大量的上述酶。此外，加入核酸化合物如肌苷于培养基中，可有效提高这些酶的活性。所培养的细菌本身可以作为粗制的酶来使用。另外，通过标准方法(如通过超声波作用或研磨破碎，离心分离，硫酸铵—分离和膜分离)能从所培养的菌获得酶，并且所得的粗制酶也可以使用。
以下是按照“Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology，Volume II”(1984)，对被保藏菌株的细菌学特征的研究结果。试验基本上按照Takeji Hasegawa《Biseibutsu no Bunrui to Dotei(微生物的分类和鉴定)》(编辑版，Gakkai Shuppan center，1985)所述的方法进行。
嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)JTS 859(FERMBP-6885)1.形态学特征(1)细胞的形状和大小杆状、5.4-6.5μm×0.7-0.9μm(2)孢子形成椭圆体状的孢子，一个细胞生长一个孢子，该孢子位于细胞的端部。
2.培养特征(1)肉汤液培养在62℃培养2天。
(2)肉汤琼脂平面培养白色而略带浅黄色、平滑、不透明、无堆积。菌落呈波动的环形。
(3)肉汤琼脂斜面培养白色而略带浅黄色、平滑、不透明、无堆积。生长适度。
3.生化特性(1)格兰氏染色阳性(2)厌氧培养 不生长(3)能动性周毛运动(4)氧化酶阳性(5)过氧化氢酶阳性(6)明胶的液化能力能液化(7)石蕊乳凝固(8)O-F试验 发酵型(9)VP试验阴性(10)从D-葡萄糖产生气体 未产生(11)从D-葡萄糖产生酸 产生(12)从L-阿糖产生酸 未产生(13)从D-甘露糖醇产生酸 产生(14)从D-木糖产生酸 未产生(15)在萨布罗氏(Sabouraud′s)培养基中生长斜面培养观察到生长液体培养观察到生长(16)0.001％溶菌酶下生长 没有生长(17)0.02％叠氮化物下生长没有生长(18)7％NaCl下生长 没有生长(生长至2％)(19)酪蛋白的水解能水解(20)淀粉的水解 能水解(21)蛋黄试验没有生长(22)二羟丙酮的产生 没有产生(23)柠檬酸的利用阴性(24)吲哚的产生 阴性(25)脲酶的活性 阳性(26)苯丙氨酸的脱氨基作用阴性(27)精氨酸的二水解酶活性阳性(28)酪氨酸的分解作用阴性(29)呋喃果聚糖的产生阴性(30)硝酸盐的还原阳性(31)硝酸钠的脱氮作用阴性(32)硫化氢的产生阳性(33)对无机氮源的利用仅具有NO3的氮源 观察到生长仅具有NH4的氮源 观察到生长(34)GC含量 47.3％(35)生长温度范围 40-71℃最佳范围 60-68℃(36)生长pH范围 5.7-8.5最佳范围 6.0-7.0
由上述的特征进行判断，本发明的菌株可以确定为嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)。
<一锅反应>
本发明的制备乙二醛-鸟苷化合物的方法和制备鸟苷类化合物的方法均可以通过一锅反应来实施。具体讲，首先将鸟嘌呤与乙二醛水溶液反应，制备出起始反应溶液，再将反应所必需的核糖基供体(优选与稳定剂一起加入)、酶溶液以及任选的磷酸根离子加入到起始反应溶液中，进行反应，由此通过一锅反应可以制备出乙二醛-鸟苷类化合物。此外，采用碱分解上述反应产物，制备鸟苷类化合物也可以通过一锅反应进行。
实施例通过以下的生产实施例、试验实施例和实施例将对本发明进一步予以详细描述。
生产实施例1合成乙二醛-鸟嘌呤将22.65g鸟嘌呤(由Tokyo Kasei Kogyo Co.制造)和21.75g 40％乙二醛水溶液(Tokyo Kasei Kogyo Co.制造)加入到950mL纯水中，并将混合物在70℃下加热搅拌18小时，然后将混合物冷却至4℃并过滤，将过滤得到的白色固体干燥，得到30.7g乙二醛-鸟嘌呤。核磁共振(NMR)谱的测量结果如下。
1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)δ8.52(bs，1H)，7.70(bs，1H)，7.16(d，1H)，6.39(d，1H)，5.46(d，1H)，4.83(d，1H).
生产实施例2 制备含有核苷磷酸化酶的细菌悬浮液按照下述方法培养嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)JTS 859(FERM BP-6885)，它生产嘌呤核苷磷酸化酶(以下称为“PUNP”)和嘧啶核苷磷酸化酶(以下称为“PYNP”)。
在培养细菌时，使用pH 6.2的由10g细菌-胰蛋白胨、5g酵母提取液、3g葡萄糖、3g盐、1g肌苷和1L水组成的培养基。将100mL上述培养基装入500mL锥形烧瓶。将从斜面培养基用铂环收集的细菌环接种到烧瓶中的培养基中。旋转振荡(200rpm)下，将烧瓶中的细菌在65℃培养16小时，得到培养液。将1.2L相同的培养基装入2L-培养罐中，把60mL培养液接种到罐内的培养基中。然后在1vvm空气气流速度、65℃培养温度和pH 6.5-7.0范围(静)条件下，将罐中的细菌培养6小时，同时两个搅拌叶轮(上叶轮和下叶轮，每个直径为42mm)以650rpm旋转。培养完成后，通过离心分离(10,000G，4℃，15分钟)获得细菌。将细菌全部悬浮于40mL的10mM磷酸钾溶液(pH 7)，由此得到含有PUNP和PYNP的酶溶液(以下称为“酶溶液”)。
在一分钟内将1μmol的底物转化为产物所需的酶活性定义为“1U”。在60℃按照标准方法测定酶溶液的酶活性，1mL的酶溶液显示出66U的PUNP活性和166U的PYNP活性。
试验实施例1 鸟嘌呤和乙二醛-鸟嘌呤的溶解度将每个化合物过量悬浮于水中，在每个温度下搅拌1小时，并静置一会儿。在下述的条件下，用带有UV探测器的HPLC对液层进行分析，结果如表1所示。
HPLC分析条件探测器UV(260nm)柱Superiorex ODS(Shiseido制造)洗脱剂0.1M磷酸二氢铵溶液∶甲醇＝97∶3(v/v)流速1mL/分钟样品20μL
表1
实施例1 通过核苷磷酸化酶合成乙二醛-2′-脱氧鸟苷制备5mM磷酸盐缓冲液(pH 7)，其中含有30mM 2′-脱氧尿苷、30mM乙二醛-鸟嘌呤、100mM硼酸和4mM乙二胺四乙酸的二钠盐。将1ml由生产实施例2所获得的酶溶液加入到99ml上述磷酸盐缓冲液混合物，使所得反应混合物的总量为100ml。将反应混合物在50℃保持48小时，使反应进行。然后于60℃将混合物过滤并冷却至4℃。将过滤得到的白色结晶(产率量为80％)进行光谱测定，结果如下。与参考文献(Chung，F.，Hecht，S.S.，Carcinogenesis，6，1671-1673(1985))所述的值对照，结果证实产物是乙二醛-2′-脱氧鸟苷。
UV(pH 7)，λmax(nm)248，272(肩峰)1H-NMR(DMSO-d6+D2O，200MHZ)，δ7.95(s，1H，2-H)，6.12(t，1H，1′-H)，5.50(s，1H，7-H)，4.90(s，1H，6-H)，4.35(bs，1H，3′-H)，3.83(bs，1H，4′-H)，3.54(m，2H，5′-H)，2.52(m，1H，2′-H)，2.28(m，2H，2′-H).
实施例2 从乙二醛-2′-脱氧鸟苷合成2′-脱氧鸟苷将0.1g上述实施例1所得的乙二醛-2′-脱氧鸟苷加入到0.2N氢氧化钠溶液，并在70℃搅拌2小时，将混合物中和以后，在实施例1的条件下，用HPLC方法进行分析，证实定量地得到了2′-脱氧鸟苷。此外，对通过色谱和重结晶得到的白色结晶进行光谱测定，从各种光谱证实所得结晶为2′-脱氧鸟苷。
实施例3 稳定剂对乙二醛-2′-脱氧鸟苷生成量的影响制备5mM磷酸盐缓冲液(pH 7)，其中含有20mM 2′-脱氧尿苷、20mM乙二醛-鸟嘌呤、表2所示的稳定剂和1mL生产实施例2所制备的酶溶液。(表2中，“*”表示稳定剂的浓度是4mM，而没有“*”表示稳定剂的浓度是100mM)。将100ml上述磷酸盐缓冲液混合物于50℃保持38小时，令反应进行。通过碱将反应溶液所含的乙二醛-2′-脱氧鸟苷分解，定量地得到2′-脱氧鸟苷。然后测定2′-脱氧鸟苷的浓度。另外，按照制备上述缓冲液混合物的相似方法制备对照溶液，只是以加入100mM盐酸三(羟甲基)氨基甲烷(“Tris”)来代替稳定剂。该溶液以下称为“Tris(对照)”。对结果的分析发现，类似于EDTA与硼酸的、形成络合物的化合物组合对提高反应产量是有效的。
表2
实施例4 通过各菌株生产的酶合成乙二醛-2′-脱氧鸟苷将500ml与生产实施例2所用的相同的培养基装入3个2L的锥形烧瓶。用从原种斜面培养物以铂环收集的各细菌环，将大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)IFO 3301、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)IFO13168和肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)IFO 3321分别接种到三个烧瓶的培养基中。上述细菌在振荡烧瓶(200rpm)的条件下，于37℃分别培养16小时，获得培养溶液。通过离心(10,000G，4℃，15分钟)培养溶液来收集细菌。将所得细菌悬浮于10mL的10mM磷酸钾缓冲液(pH7)，由此得到三种酶溶液。
在以下条件下，用上述三种酶溶液的任一种和生产实施例2所得嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)JTS 859的酶溶液，从2′-脱氧尿苷和乙二醛-鸟嘌呤合成乙二醛-2′-脱氧鸟苷。具体讲，首先制备5mM磷酸盐缓冲液(pH 7)，其中含有30mM 2′-脱氧尿苷、30mM乙二醛-鸟嘌呤、100mM硼酸和4mM乙二胺四乙酸的二钠盐。将上述四种酶溶液(所含细菌相当于100ml上述培养溶液)的每一种(2mL)分别加入到98mL上述磷酸盐缓冲液混合物中，得到四种反应混合物。每种反应混合物在各个反应温度下保持48小时，使反应进行。结果如表3所示。
表3
实施例5 使用不同的核糖基供体合成乙二醛-鸟苷类化合物首先制备5mM的磷酸盐缓冲液(pH 7)，其中含有表4所示的每种核糖基供体、20mM乙二醛-鸟嘌呤、100mM硼酸和4mM乙二胺四乙酸二钠盐(每种核糖基供体的浓度是20mM，但表4中的“*”表示其浓度是10mM)。将0.25ml生产实施例2所得的酶溶液加入到所需量的上述磷酸盐缓冲液混合物中，使得到的反应混合物的总量为10mL。反应混合物在50℃下保持48小时，使反应进行。结果如表4所示。
表4
实施例6 使用嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)JTS859生产的酶时底物浓度对制备的影响首先制备5mM的盐酸盐缓冲液(pH 7)，其中含有表5所示各浓度的底物基质鸟嘌呤或乙二醛-鸟嘌呤、与各个底物基质相同浓度的核糖基供体2′-脱氧尿苷、100mM硼酸和4mM乙二胺四乙酸二钠盐。将1ml生产实施例2所得的酶溶液加入99ml上述磷酸盐缓冲液混合物中。反应混合物在50℃下保持48小时，使反应进行。结果如表5所示。当将乙二醛-鸟嘌呤选作底物基质时，生成的乙二醛-2′-脱氧鸟苷通过碱分解，得到2′-脱氧鸟苷。
对所得2′-脱氧鸟苷的量进行了测定。在表5中，当鸟嘌呤的浓度不小于50mM时，不予以分析。
表5
实施例7 一锅反应法合成将0.45g鸟苷和0.44g 40％乙二醛水溶液加入到10mL水中，并将混合物在70℃搅拌18小时。然后，将以下物质和水加入到上述混合物中，得到一水溶液，其含有最终浓度为30mM的2′-脱氧尿苷、100mM的硼酸、4mM的乙二胺四乙酸二钠盐和5的mM磷酸钾。
将1ml生产实施例2所得的酶溶液加入到99ml上述水溶液中，使得到的反应混合物的总体积为100mL。反应混合物在50℃下保持48小时，使反应进行。将包含于反应混合物中的乙二醛-2′-脱氧鸟苷通过碱分解为2′-脱氧鸟苷。经HPLC测定2′-脱氧鸟苷的浓度，表明产率为80％。
实施例8 乙二醛-鸟苷的合成首先制备5mM的磷酸盐缓冲液(pH 7)，其中含有50mM的尿苷、50mM乙二醛-鸟嘌呤、100mM硼酸和4mM乙二胺四乙酸二钠盐。将1ml生产实施例2所得的酶溶液加入到99ml上述磷酸盐缓冲液混合物中，使所得反应混合物的总体积为100mL。该反应混合物在50℃下保持48小时，使反应进行。加热过滤后，将混合物冷却至4℃。对过滤得到的白色结晶(产率为72％)进行光谱测定，结果如下。与实施例1的乙二醛-2′-脱氧鸟苷光谱比较，结果证实产物是乙二醛-鸟苷。
1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)，δ8.85(5，1H，5-H)，8.00(5，1H，2-H)，7.27(d，1H，7-OH)，6.50(d，1H，6-OH)，5.71(d，1H，1′-H)，5.49(d，1H，7-H)，5.44(d，1H，3′-OH)，5.18(d，1H，2′-OH)，5.06(s，1H，5′-OH)，4.88(d，1H，6-H)，4.41(m，1H，2′-H)，4.10(d，1H，3′-H)，3.90(d，1H，4′-H)，3.57(m，2H，5′-H).
进一步按照与实施例2相似的方法，从本实施例所得的产物制备出鸟苷。这事实上也表明本实施例的产物为乙二醛-鸟苷。
根据本发明，通过微生物产生的酶反应，可以由核糖基供体和乙二醛-鸟嘌呤制备乙二醛-鸟苷类化合物，通过碱将乙二醛-鸟苷类化合物分解，可以高产率有效地制备鸟苷类化合物，即鸟苷和2′-脱氧鸟苷。
对于本领域技术人员而言，其它的优势和改进是很容易实现的。由此本发明的范围并不限于本文所描述的具体细节和典型实施例。因此，在不背离所附权利要求和它们的等同方案所定义的本发明总的主题的精神和范围下，可以做各种修改。
权利要求
1.一种制备式(2)表示的乙二醛-鸟苷类化合物的方法 其中R表示氢原子或羟基，该方法包括下面的步骤在嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的存在下，将式(1)表示的乙二醛-鸟嘌呤原 和选自尿苷、2′-脱氧尿苷和胸苷的一种物质以及磷酸根离子一起反应，得到乙二醛-鸟苷或乙二醛-2′-脱氧鸟苷，其中嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶得自选自嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)和肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)的微生物。
2.一种制备式(2)表示的乙二醛-鸟苷类化合物的方法 其中R表示氢原子或羟基，该方法包括下面的步骤在含有嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶微生物的存在下，将式(1)表示的乙二醛-鸟嘌呤 和选自尿苷、2′-脱氧尿苷和胸苷的一种物质以及磷酸根离子一起反应，得到乙二醛-鸟苷或乙二醛-2′-脱氧鸟苷，其中所述微生物选自嗜热脂肪芽胞杆菌、大肠埃希氏杆菌和肺炎杆菌。
3.根据权利要求1的制备乙二醛-鸟苷类化合物的方法，其中所述微生物是嗜热脂肪芽胞杆菌JTS 859(FERM BP-6885)、大肠埃希氏杆菌IFO 3301、大肠埃希氏杆菌IFO 13168或肺炎杆菌IFO 3321。
4.根据权利要求2的制备乙二醛-鸟苷类化合物的方法，其中所述微生物是嗜热脂肪芽胞杆菌JTS 859(FERM BP-6885)、大肠埃希氏杆菌IFO 3301、大肠埃希氏杆菌IFO 13168或肺炎杆菌IFO 3321。
5.根据权利要求1～4任一项的制备乙二醛-鸟苷类化合物的方法，其中加入选自甘氨酸、亚氨基二乙酸、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、乙二醇、二(β-氨基乙基醚)-N，N，N′，N′-四乙酸及其盐的至少一种化合物。
6.根据权利要求1～4任一项的制备乙二醛-鸟苷类化合物的方法，其中选自甘氨酸、亚氨基二乙酸、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、乙二醇、二(β-氨基乙基醚)-N，N，N′，N′-四乙酸及其盐的至少一种化合物和硼酸或其盐一起加入。
全文摘要
本发明公开的是，在嘌呤核苷磷酸化酶存在下，将乙二醛－鸟嘌呤与核糖－1－磷酸酯和2′－脱氧核糖－1－磷酸酯两者之一进行反应，或者在嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶存在下，将乙二醛－鸟嘌呤和选自尿苷、2′－脱氧尿苷和胸苷的一种物质与磷酸根离子一起反应，制备乙二醛－鸟苷类化合物；然后通过碱将乙二醛－鸟苷类化合物分解，制备由鸟苷和2′－脱氧鸟苷组成的鸟苷类化合物。
文档编号C07H1/00GK1818074SQ20051013753
公开日2006年8月16日 申请日期2001年3月27日 优先权日2000年3月27日
发明者三上洋一, 松本清一郎, 林良宪, 佐藤丰树 申请人:有机合成药品工业株式会社