翻白草三萜化合物的制作方法

翻白草三萜化合物的制作方法
【专利摘要】本发明提出一种如式(I)所示的三萜类化合物，该化合物具有制备治疗2型糖尿病的药物的用途。
【专利说明】
翻白草三萜化合物
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种翻白草三萜化合物。
【背景技术】
[0002] 中药翻白草是蔷薇科委陵菜属植物翻白草(Potentilla discolor Bunge)的干燥 全草，始载于《救荒本草》。翻白草广泛分布于北半球的温带和寒带，我国以山东、辽宁、安徽 三省该药材产量最大，此外，河北、河南、内蒙古、湖南、江苏和广西等省份也有分布。其性 甘、苦、平，具有清热解毒、止血消肿之功效，可用于治疗痢疾、疟疾、肺痈等症。
[0003] 对翻白草化学成分的研究起始于19世纪30年代，目前，从翻白草中分离获取的化 合物主要是三萜类、黄酮类、留体类以及多酚类。
[0004] 翻白草含有丰富的三萜类化合物，按其骨架结构，主要分为如下几类:①乌苏酸、 坡模醇酸、3β，24-二羟基-乌苏-12烯-28-酸、3β-羟基-乌苏-12烯-28-酸、委陵菜酸和2α，3 β，19α-三羟基-乌苏-12烯-28-酸等乌苏烷型三萜[1，U。②齐墩果酸、3β，24-二羟基-齐墩果-12烯-28-酸和野蔷薇苷 [3]等齐墩果烷型三萜。③2-羟基白桦酸[3]，白桦酸，3α，30_二羟基-20(29)-烯-27-白桦酸等羽扇豆烷型三萜。
[0005] 现有技术文献
[0006] [1]薛培凤，乔梁，梁鸿，等.多裂委陵菜化学成分的研究[J].北京大学学报(医学 版），2004,36(1):21.
[0007] [ 2 ]薛培凤，尹婷，梁鸿，等.翻白草化学成分研究[J].中国药学杂志，2005，40 (14):1052.
[0008] [3]张莉，杨杰，陈筱清，等.翻白草的化学成分[J].植物资源与环境学报，2010，19 (2):94-96.
【发明内容】

[0009] 发明人对翻白草(Potentilla discolor Bunge)的化学成分、提取工艺、药理活性 进行了系统研究。从翻白草提取分离出10个三萜类化合物(化合物1~10)。其中，化合物5为 新化合物，经结构鉴定，命名为(20S )-3α-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸，其结构如式（I)所 示：
[0010]
[0011] 即，本发明包括以下内容。
[0012] 本发明提供上述式（I)所示的三萜类化合物。
[0013] 本发明进一步提供一种翻白草总三萜，其中含有式（I)所示的三萜类化合物。
[0014] 本发明进一步提供一种翻白草总三萜，其中含有式(I)所示的三萜类化合物、蔷薇 酸、2α-羟基乌苏酸、2α，3β，19α-三羟基-熊果酸、3α，30_二羟基-20(29)-烯-27-白桦酸、熊 果酸、山楂酸、19α-羟基熊果酸、2α，3α-二羟基-12-烯-28-乌苏酸、齐墩果酸。
【附图说明】
[0015] 图1为翻白草提取分离过程示意图；
[0016] 图2-1、2_2为(20S)-3a-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸咕NMR谱图；
[0017] 图 3-1、3-2、3-3 为(20S) -3a-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸 13CNMR谱图；
[0018] 图 4-1、4-2 为(20S)-3a-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸 2D-NMR 谱图；
[0019] 图 5-1、5-2、5-3 为(20S) -3a-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸 R0ESY谱图。
【具体实施方式】
[0020] -、化合物的提取
[0021] 1、实验方法
[0022] 1.1实验仪器与材料
[0023]熔点用X-4型双目镜显微熔点测定仪(温度未校正，北京泰克仪器有限公司制造） 测定;UV用Shimadzu UV-2501PC型可见-紫外分光光度计测定;NMR:Bruker AV-500型核磁 共振仪，δ为ppm，J为Hz。
[0024] 薄层层析硅胶H、薄层色谱硅胶GF254、柱层析硅胶（100-200目，200-300目，青岛海 洋化工厂）；〇DS柱(40_60ym，Fuji)，SephadexLH_20葡聚糖凝胶(购自Pharmacia公司）；MCI 柱(小孔树脂柱、日本三菱化工株式会社）。
[0025]所用试剂均为分析纯级。
[0026]如无特殊说明，本发明所指比例以及百分比均指体积。
[0027] 1.2植物来源
[0028] 翻白草(Potentilla discolor Bunge)药材采自广西，植物标本经鉴定为蔷薇科 委陵菜属植物翻白草，标本存放于中国药科大学中药分析教研室。
[0029] 1.3提取分离
[0030]取采自广西的干燥翻白草全草14kg，如图1所示，用90%乙醇水溶液加热回流提取 3次，每次3h，合并提取液，减压蒸去大部分乙醇，用水混悬，然后用石油醚萃取三次，回收溶 剂后得到石油醚部分160g，然后用乙酸乙酯萃取三次，回收溶剂后，得乙酸乙酯部分300g。 [0031]乙酸乙酯部分(300g)用400g硅胶（100-300目）拌样，3.0kg(200-300目）进行硅胶 柱层析，氯仿-甲醇（1:0-0:1， V:V)梯度洗脱，薄层层析(TLC)检测合并相同流分。
[0032]将30-50体积％和50-70体积％的流分合并后减压干燥，进行小孔树脂(MCI)柱层 析，用水-甲醇（10:0-0:10，^^)梯度洗脱，收集70%-90%甲醇洗脱的成分，减压回收溶剂 至浸膏状，得到有效部位。取少量该有效部位，经颜色反应、Libermann-Burchard、Molish反 应，提示含有较多三萜类化合物(翻白草总三萜）。再用甲醇溶解有效部位，进行反向C18柱 层析，丙酮-水（1 1，v:v)梯度洗脱，反复纯化，得化合物l(17mg)，2(25mg)，3(8mg)，4 (20mg)，5(8mg)，6(100mg)，7(5mg)，8(4mg)，9(5mg)，10(120mg)。
[0033]化合物5较多地来自于反相C18柱层析的50-70体积％丙酮-水洗脱的流分。
[0034]翻白草分离流程如图1所示。
[0035] 依据与对照品TLC比对以及各种谱图数据[n^MS、1!! NMR、13C NMR和2D NMR(HMQC、 HMBC、C0SY)]最终确证了所得到的化合物分别为:蔷薇酸(euscaphic acid, 1)、2α-羟基乌 苏酸（corosolic acid，2)、2α，3β, 19α-三羟基-熊果酸（tormentic acid，3)、3α，30-二轻 基-20(29)-烯-27-白桦酸（3a，30-dihydroxylup-20(29)-en-27-〇icacid，4)、（20S)-3a-羟 基-29-二甲氧基_27_白桦酸（（20S)-3a-hydroxy-29-dimethoxy-lupan-27-〇ic acid，5)和 熊果酸（ursolic acid,6)、山植酸（maslinic acid,7)、19α-羟基熊果酸（pomolic acid, 8)、2α，3α-二羟基-12-稀-28-乌苏酸（2α，3a-dihydroxyurs-12-en-28-〇ic acid,9)、齐墩 果酸（oleanolic acid，10)〇
[0036] 其中，化合物（20S)-3a-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸（（205)-3〇-1^乜(《7-29-dimethoxy-lupan-27-oic acid，5)未见文献报道，为新化合物。
[0037] 2、结构鉴定
[0038] 化合物5:性状：白色无定形粉末(MeOH)，易溶于甲醇；
[0039]
[0040] 颜色反应：10%硫酸乙醇溶液反应显紫红色，1^;^61'11^1111-13111'(31^1(1反应呈阳性， Molish反应阴性，以上信息提示为三萜类化合物。HR-T0F-MS给出分子量m/z[M-H] - 517.3900(calcd for C32H53〇5,517.3898)，结合 13C-NMR和1H-NMR谱推测其分子式为 C32H54〇5 〇
[0041] IR(KBr)vmax cm-1 3447,1685；
[0042] 1H-NMR(C5D5N)，S(ppm):1.79-1.56(m，2H，H-l)，2.00-1.72(m，2H，H-2)，3.54(s，H-3)，1.73(m，lH，H-5)，1.49-1.20(m，2H，H-6)，1.99-1.96(m，2H，H-7)，2.21(m，lH，H-9)， 1.71- 1.36(m，2H，H-ll)，2.71-1.82(m，2H，H-12)，1.89(m，lH，H-13)，2.29-1.68(m，2H，H-15),1.76-1.72(m，2H，H-16)，1.61(m，lH，H-18)，1.93(m，lH，H-19)，2.50(m，lH，H-20)， 1.72- 1.50(m,2H,H-21),1.41-1.05(m,2H,H-22),1.04(s,3H,CH3-23),0.87(s,3H,CH3-24), 0.97(s,3H,CH 3-25) ,1.21(s,3H,CH3-26) ,0.88(s , 3H, CH3-28) ,4.18(d,J = 8.15Hz,lH,H- 29) ,1.05(d J = 5.6Hz,3H,CH3-30),3.30(s,3H,CH3-31),3.38(s,3H,CH3-32)；
[0043] 13C-匪R(C5D5N) ,δ(ρρπι) :34.23(C-1) ,26.63(02) ,75.06(03) ,38.91(04)， 49.57(C-5)，18.75(C-6)，38.21(C-7)，40.92(C-8)，51.23(C-9)，37.41(C-10)，21.20(C-11)，28.22(C-12)，38.38(C-13)，60.79(014)，25.73(C-15)，38.04(016)，42.60(017)， 50·57(C-18)，39·38(C-19)，38·07(C-20)，22.66(C-21)，40.98(C-22)，29.10(023),22.78 (C-24),16.96(C-25),17.59(C-26),178.31(C-27),18.96(C-28),108.75(C-29),9.31(C- 30) ,53.01(C-31),53.58(C-32).
[0044] 咕 MIR谱上有六个角甲基信号（如图2-1)J0.87、0.88、0.97、1.04、1.21(s，3H, each)及1.05((1，1 = 5.60抱），另外在63.30附近还有两个明显的甲基单峰信号3.30(3!1，8)、 3.38(3!1，8)，提示含有两个甲氧基。质子信号55.30(!1，8)、4.18(!1，(1，1 = 8.15抱）、3.54(!1， s)暗示与羟基等含氧基团相连(如图2-2)。
[0045] 13C NMR谱中有32个碳信号，包括六个角甲基碳信号SC9.31、16.61、17.59、18.75、 18.96和21.20(如图3-1)，两个甲氧基碳信号6巧3.01、53.58(如图3-2)，两个连氧碳信号6〇 75.06和60.79以及一个羧基碳信号S C178.31 (如图3-2和3-3)。
[0046] 综合以上信息，推定该化合物为3α-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸(3a-hydroxy-29-dimethoxy-lupan_27-〇ic acid)，结构如式（I)所不。
[0047]
[0048] 根据2D-NMR可以对其结构进行确证和全归属，如下：
[0049] 在1H-4 COSY谱中2H-1 (δ 1 · 56/1 · 79)与2H-2(δ 1 · 72/2 · 00)相关，而后者同时与H-3 (δ3·54)相关;Η_5(δ1·73)与2Η-6(δ1·49/1·40)相关，同时后者也与2Η_7(δ1·96/1·99)信号 发生耦合;Η-9(δ2·21)与 2!1-1101.71/1.36)相关，2!1-1202.71/1.82)与!1-1301.89)相 关，而2!1-11(51.71/1.36)与2!1-12(52.71/1.82)也同时相关。!1-13(51.89)与!1-1901.93) 相关，后者同时与2Η-21(δ1.50/1.72)相关，同时2Η-21也与2Η-22(δ1.〇5/1.41)相关。
[0050] 在1HMBC 谱中（图 4-l、4-2)，羧基碳信号δc178·31与H-13(δl·89)相关；δl·21(3H-26)、δl·89(H-13)及δl·61(H-18)与C-14(δ60·78)相关 ；C-28(δl8·96)与H-18(δl·61)、H-22 (δ1·41)相关。
[0051] 在R0ESY谱中（图5-1、5-2、5-3)、3〇.88(3!1-28)与130、150、160、1卵、210和22册相 关。结合文献，以上信息确证了该化合物为C-27羧基。
[0052] 在1Η-匪R中，!1-3〇3.54,8)表明!1-3处于6键上。1?(^5￥中（图5-1、5-2、5-3)!1-3(5 3.54)与!1-比01.79)、!1-2002.〇)、3!1-2你0〇.87)相关，可归属4环上的!1，同时也确证了该 构型。
[0053] 此外，HMBC 谱中（图 4-l、4-2)、3H-31(S3.30，s)、3H-32(S3.38，s)与 108.7(029)相 关，表明C-29上连有两个甲氧基。
[0054]另外，通过C-30的化学位移大小来确定C-20的绝对构型，因为如果C-20为S构型， 则C-30的化学位移为δ^1〇. 3;如果C-20为R构型，则C-30的化学位移处于较低场，为δ^17.7。 因此，化合物5中C-20为S构型。
[0055] 综所上述，化合物 5 的结构确定为（SOSpSa-hydroxy-Sg-dimethoxy-lupan-ST-oic acid。 经文献检索， 化合物 5 为一新化合物 ，波谱数据如下 (表1) 。
[0056] 表 1 化合物5的1H-NMR、13C_NMR数据(CsDsN^ppmJ Hz).
[0057]
[0058]
[0059]
[0060] 根据文献查阅，从委陵菜属中分离得到的三萜类化合物几乎都是游离苷元，主要 是五环三萜，按其分类，主要有乌苏烷型、齐墩果烷型和羽扇豆烷型;其结构中大多有双键、 羟基和羧基，且双键的位置几乎都是12(13)位，羧基的位置大多都是28位;其结构的变化就 主要体现在羟基数量、取代位置和立体化学的变化上，最常见的羟基取代模式为2α，2β，3α， 3β，19α，23，24位，其它位置则少见。
[0061] 值得一提的是，在发明人得到的10个三萜类化合物中有两个为羽扇豆烷型三萜 (其中一个为新化合物），且羧基都存在于C-27位。根据文献检索，大多数天然存在的羽扇豆 烷型三萜多为C-28位羧基，C-27位羧基的天然化合物仅有七个，分别是从唇形科植物 Hyptis suaveolens，鼠李科植物Gouania microcarpa以及本植物翻白草中分离得到。现在 发明人又从翻白草中也分离得到一个新的C-27羧基的羽扇豆烷型三萜，极大地丰富了这一 类型的化合物。
[0062]二、化合物活性研究 [0063]( - )糖消耗
[0064] AMP蛋白激酶(AMPK，AMP即腺苷一磷酸）主要控制细胞新陈代谢:它会决定身体中 的脂肪是储存还是燃烧，这主要取决于细胞中总能量。当细胞能量水平较高时，细胞中存在 高浓度的能量分子ATP (三磷酸腺苷），因此AMPK会促使细胞进行"合成代谢"，将多余能量作 为脂肪储存下来；当ATP水平较低时，AMPK将关闭合成代谢，反而激发分解代谢，让脂肪燃烧 为能量。已有研究表明，AMPK能作为治疗2型糖尿病的一种有效手段。当AMPK探测到细胞中 ATP浓度较低时，它们会利用各种机制使细胞中的葡萄糖变为ATP。对于啮齿类动物的实验 已经表明，AMPK对于降低血糖是有效的。
[0065]本实验就是利用糖消耗实验来探索翻白草总三萜部位和其中的三萜单体能否通 过AMPK途径对2型糖尿病实现治疗作用。
[0066] 1、实验材料
[0067] 1.1样品
[0068]①3α，30-二羟基-20 (29)_烯-27-白桦酸，②本发明的新化合物（即（20S)-3α-羟 基-29-二甲氧基-27-白桦酸），③科罗索酸，④翻白草总三萜，其中样品④用少量DMS0(二甲 亚砜)溶解(确保DMS0在培养体系中的终浓度不大于0.1%)，再用PBS(磷酸盐缓冲液)稀释， 使细胞上清液中样品最终浓度依次为ΙΟμ mol/L，ΙΟμ mol/L，ΙΟμ mol/L和100μg/ml，二甲双胍 用PBS溶解，使细胞上清液中样品终浓度为lmmo 1 /L。
[0069] 1.2试剂
[0070] DMEM培养基(Gibco公司，批号：1115806);
[0071 ] 应用液另加 0.06g/L青霉素 (80万单位)和0. lg/L硫酸链霉素（100万单位)及3.7g/ L碳酸氢钠，pH调至7.2;
[0072]注射用青霉素钠(苏州二叶制药有限公司，批号100501);
[0073] 硫酸链霉素(南京生兴生物技术有限公司，批号:0E100E10);
[0074] 碳酸氢钠(南京化学试剂有限公司，批号：11022610211);
[0075] 新生小牛血清（Newborn calfserum，NCS)(上海微科生化试剂有限公司，批号： A10110-0904)；
[0076] 胰蛋白酶（Sunshine公司，批号：1C221H04);
[0077] DMS0(Snshine公司，批号：2A022A02);
[0078] 二甲双胍(ALEXIS BI0CHEMICALS，批号：L20508/a)
[0079] 葡萄糖（国药集团化学试剂有限公司，批号:F20101115);
[0080] 葡萄糖测定试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司，批号:20120701);
[0081] 1.3细胞株
[0082]前脂肪细胞3T3-L1，小鼠源。
[0083] 1.4动物
[0084] ICR小鼠，雄性，18_22g，由南京青龙山实验动物养殖场提供。2、实验过程
[0085] 2.1条件培养液 CM( conditioned-medium)的制备
[0086] 取小鼠脱颈椎处死，75%的酒精中浸泡3-5min，移至超净台中，腹腔注射PBS 5ml/ 只，轻揉小鼠的腹部2min，用移液枪吸出以6 X 105接种于6孔板内，于5 %C02，37°C细胞培养 箱内孵育，4h后吸弃未贴壁细胞，以PBS洗2次，贴壁细胞换以1(冊(1^ 61^'-1^叫打'8-Hense 1 ei t)液培养，每孔加 KRH液2ml，并在每孔加入10μ1的LPS (终溶度为5μg/ml)，48h后收 集上清液作为巨卩策细胞条件培养液(〇〇11(1;[1:;[0116(1-1116(1;[11111，01)，滤菌，分装，|￡于-70 <€超低 温冰箱中保存备用。
[0087] 2.2细胞复苏与培养
[0088]取出冻存的3T3-L1细胞置37°C水浴中，使其快速融化，转入5ml含10%新生小牛血 清的DMEM培养基中，重悬细胞，再转入75ml培养瓶中于5 %⑶2，37°C的细胞培养箱中培养， 每天换液。前脂肪细胞3T3-L1细胞为贴壁细胞，接种后1-2天，表现为单层密集生长，细胞呈 梭形，有分支。待细胞达到80%融合时，用PBS清洗两遍，0.25%胰蛋白酶消化30s，按1:6传 代。取对数生长期的细胞，台盼蓝排斥法进行活细胞计数，调节细胞浓度为l〇 6/ml接种于48 孔培养板，5 % C02，37 °C细胞培养箱内孵育24h，当细胞基本融合时，用KRH清洗两遍换用KRH 液饥饿，每孔200yL饥饿4h后进行实验。
[0089] 2.3药物处理与测定
[0090] 2.3.1生理条件下筛选
[0091] 实验设空白组、样品组及阳性对照(二甲双胍)组。先将饥饿好的细胞用KRH液清洗 两遍，然后用KRH体系加样品，培养板孔内分别加入预定浓度的样品①②③④(①②③终浓 度lOymol/L，④终浓度100μg/ml)和二甲双胍(终浓度25ymol/L)，空白组加入同体积的KRH 液;各组均加入葡萄糖溶液，使其终浓度为1 lmmo 1/L，5 %⑶2，37 °C细胞培养箱内孵育4h，用 葡萄糖试剂盒测定。
[0092] 2.3.2炎性条件下筛选
[0093]实验设空白组、模型组、样品组及阳性对照(二甲双胍)组。培养板孔内分别加入预 定浓度的样品①②③④(①②③终浓度ΙΟμ mol/L，④终浓度100μg/ml)和二甲双胍(终浓度 lmmo 1 /L)，5 %⑶2，37 °C细胞培养箱内孵育0.5h，培养板孔内模型组、样品组及阳性对照加 入相同体积的C Μ，空白组加入同体积的K R Η液，各组均加入葡萄糖溶液，使其终浓度为 1 lmmol/L，5 % C02，37 °C细胞培养箱内孵育4h，用葡萄糖试剂盒测定。
[0094] 2.4实验结果
[0095] 2.4.1生理条件下筛选结果
[0096]细胞孵育4h后，用葡萄糖测定试剂盒于492nm波长下测0D值，由此，计算出细胞上 清中的糖含量，进而得出糖消耗量。结果见表2-1。
[0097] 表2-1生理条件下糖消耗量(n = 6)
[0098]
[0099] *与空白组相比P〈0.05
[0100] 2.4.2炎性条件下筛选结果
[0101]细胞孵育4h后，用葡萄糖测定试剂盒于492nm波长下测0D值，由此，计算出细胞上 清中的糖含量，进而得出糖消耗量。结果见表2-2。
[0102] 表2-2炎性条件下糖消耗量(n = 8)
[0103]
[0104]
[0105] *与模型组相比Ρ〈0·05
[0106] 3、结论
[0107] 由表2-1可看出，阳性对照组与空白组有显著差异，提示了实验的可靠性。三种样 品与空白组相比，糖消耗虽均有升高，但无显著差异，提示药物在激活ΑΜΡΚ方面无显著作 用。二甲双胍为ΑΜΡΚ特异性抑制剂，抑制生理条件下糖的消耗，提示这一途径与ΑΜΡΚ活化有 关系。
[0108] 由表2-2可看出，模型组与空白组有显著差异，显示造模成功，提示实验的可靠性。 四种样品中，①、②、③号样品的糖消耗量升高，且与模型组相比有显著差异，说明它们在炎 性条件下显著促进3T3-L1对葡萄糖的摄取，提示这三种样品在炎性条件下可能激活ΑΜΡΚ， 进而促进糖消耗，②号样品的糖消耗量接近阳性对照二甲双胍。二甲双胍作为一胰岛素敏 感性具有ΑΜΡΚ活性，同时亦具有抗炎活性(可能通ΑΜΡΚ途径所介导），作为一阳性药，显著增 加糖消耗，提示了 ΑΜΡΚ途径的参与。
[0109] 糖消耗实验表现的是非胰岛素状态下脂肪细胞对糖的摄取利用，这一过程主要是 通过ΑΜΡΚ途径而介导。炎性刺激可通过抑制ΑΜΡΚ的活化而抑制细胞对糖的氧化利用。
[0110](二)细胞毒活性研究
[0111]肿瘤是全世界医药研究的热点，目前使用的抗肿瘤药物多是通过干扰细胞的生 长、死亡、分化以及功能等相关的机制，来达到抑制细胞的生长甚至杀死细胞的目的。抗肿 瘤药物的筛选包括体内和体外两种方法。对于样品量极少时，一般以样品对体外培养的肿 瘤细胞生长的抑制作用作为初筛。由于癌细胞生长具有相对的独立性，故可在体外建立具 有无限增殖能力的细胞系，该法具有耗药量少(2-10mg)，周期短，费用低等特点。该实验中 我们采用MTT法研究从翻白草中分离得到的三萜成分化合物(20S)-3a_羟基-29-二甲氧基_ 27-白桦酸和3〇,30-二羟基-20(29)-烯-27-白桦酸对人体此?62，1?^-7和!^1 &癌细胞株系 的细胞毒性。
[0112] 1、实验材料
[0113] 1.1仪器及设备
[0114] 超净工作台（吴县实验动物器材厂）恒温⑶2培养箱（德国HeraeUS)96孔培养板 (NUNCL0N)酶标仪(Tecan Sunrise)倒置生物显微镜(重庆光学仪器厂)全自动双蒸水机(上 海玻璃仪器一厂)超速离心机0PTIMAXL-100K(贝克曼公司）。
[0115] 1.2试剂与化合物
[0116] RPMI1640培养基（GIB⑶）；胰蛋白酶（SIGMA);胎牛血清（HYCL0NE);MTT(SIGMA); DMS0(SIGMA)〇
[0117] 3α，30-二羟基-20 (29)_烯-27-白桦酸由本实验室分离鉴定，化合物经HPLC分析， 纯度彡98%。
[0118] (20S)-3a-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸由本实验室分离鉴定，化合物经HPLC分 析，纯度多98%。
[0119] 1.3细胞株及培养
[0120]人乳腺癌细胞株(MCF-7)、人子宫癌细胞株(Hela)和人肝癌细胞株(HepG2)(均由 北京协和药物所提供)培养于RPMI1640培养基中，含10%小牛血清，37°C，5%C02。
[0121] 2、实验部分
[0122] 2.1实验原理
[0123] MTT比色法是一种经典的检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒 体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝色结晶甲臜并沉积在细胞中，而 死细胞无此功能。二甲基亚矾(DMS0)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长 处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细 胞数成正比。该方法己广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、 细胞毒性试验等。
[0124] 2.2实验过程
[0125] 分别取处于对数生长期的贴壁人乳腺癌细胞株(MCF-7)、人子宫癌细胞株(Hela)、 人肝癌细胞株(HepG2)，用胰酶消化后，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基配成5000个/ ml的细胞悬液，以8 X 103个/孔接种在96孔细胞培养板中，每孔接种200μ1，37°C，5 %⑶2培 养24小时。设置一系列不同浓度，同时对照组换含有等体积的PBS培养基，每组设3平行孔， 37°C，5 %C02培养2天。1500r/min离心，弃去上清液，每孔加入5mg/ml新鲜配置的含MTT工作 液20μ1，37°C，继续培养4小时。小心弃去上清液，用胰酶消化后，每孔加入150μ1 DMS0溶解 ΜΤΤ甲臜沉淀，用微型超声震荡器混匀后，在酶标仪上以试验波长为490nm测定光密度值。按 下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率:肿瘤细胞生长抑制率=(1_药物组A490值/对照组 Am) X 100%。然后求得该化合物的半数杀伤浓度IC50。
[0126] 3、结果
[0127] 经过初步的细胞毒活性测试，计算得3α，30-二羟基-20 (29)_烯-27-白桦酸对人乳 腺癌细胞株(10?-7)、人子宫癌细胞株(此1&)、人肝癌细胞株(!1叩62)的1(： 5()分别为24.9， 17.5和20.1111111〇1/1，（203)-3€[-羟基-29-二甲氧基-27-白桦酸对人乳腺癌细胞株(10^-7)、 人子宫癌细胞株(Hela)、人肝癌细胞株(HepG2)的IC 5Q分别为21.7，13.8和14.9臟01/1。提示 上述三萜化合物对人乳腺癌细胞株（MCF-7)、人子宫癌细胞株（Hela)、人肝癌细胞株 (!fepG2)具有良好的抑制活性，可用于乳腺癌、子宫癌、肝癌的临床治疗。
[0128] 表3翻白草三萜化合物的细胞毒活性(η = 8)
[0129]
【主权项】
1. 如式(I)所示的Ξ祗类化合物，2. 如权利要求1所述的Ξ祗类化合物，由菩薇科委陵菜属植物翻白草分离而得。3. -种翻白草总Ξ祗，其中含有权利要求1所述的Ξ祗类化合物。4. 一种翻白草总Ξ祗，其中含有权利要求1所述的Ξ祗类化合物、W及菩薇酸、2α-径基 乌苏酸、2α，3β，19α-Ξ径基-熊果酸、3α，30-二径基-20 (29)-締-27-白枠酸、熊果酸、山植 酸、19α-径基熊果酸、2α，3α-二径基-12-締-28-乌苏酸、齐墳果酸。
【文档编号】A61P35/00GK106083987SQ201610513075
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月1日
【发明人】谈景福, 朱光明, 俞磊明, 朱俊杰, 王立会
【申请人】上海市药材有限公司