专利名称：一种使用actb基因分析arhgdib基因表达量的rt-pcr技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种使用ACTB基因mRNA作为内参，对ARHGDIB基因mRNA进行相对定 量的实时荧光RT-PCR扩增检测技术，并形成相应试剂盒，属于分子生物技术领域。
背景技术：
随着人类基因组图谱的完成，人们开始进入后基因组时代，重点也转向了研究各基 因在生命中的作用，包括基因在生长发育、遗传、疾病、外型体征等方面的作用。其中，对于 RhoGDP dissociation inhibitor (GDI)beta基因(ARHGDIB基因)表达的研究也越来越多。
基因表达的检测有几种方法。经典的方法是根据在细胞或生物体中所观察到的生 物化学或表型的变化来决定某一特定基因是否表达。随着大分子分离技术的进步使得特异 的基因产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。随着重组DNA技术的运用，现在有可能检 测、分析任何基因的转录产物。目前有好几种方法广泛应用于研究特定RNA分子。这些方 法包括RT-PCR、原位杂交、NORTHERN凝胶分析、打点或印迹打点、S-1核酸酶分析、RNA酶保 护研究以及基因芯片等。 荧光探针PCR技术是今年兴起并得到快速发展的技术，是将同时带有关联的荧光 发光基团(能量供体)和淬灭基团(能量受体)的荧光探针结合PCR技术而产生的一种 新的检测技术，具有灵敏度高、特异性强，且不易发生产物污染等特点，包括Taqman探针技 术、分子信标(Beacan探针)等，由于该技术操作简便，检测速度快，且各方面性能都有优 势，目前在临床、研究等核酸检测领域得到广泛的应用。 Actin-beta(ACTB)基因为常用的看家基因，在人体细胞内表达情况较为稳定，已 被广泛用于基因表达的研究，利用A ACt值的方法能对其他基因的表达情况进行相对定 量分析。公式为F二2—AAet。 本发明将RT-PCR与荧光探针技术结合，通过广泛筛选和优化检测引物和探针，同 时对细胞内的ACTB基因和ARHGDIB基因mRNA进行相对定量分析。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、简便的使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表达量的 RT-PCR技术。 为解决上述问题，本发明提供了一种使用一步法RT-PCR同时检测ACTB基因mRNA 和ARHGDIB基因mRNA的技术。 根据GeneBank序列号为NC_000012的基因序列为模板，设计了一对引物及特异性 探针，检测长度为139bp的目标mRNA，其引物探针序列分别为
引物1 :5—-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3— (Seq No. 1)
引物2 :5— -GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3— (Seq No. 2)
探针1 :5—-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-3—(Seq No. 3)
4
或探针2 :5—-TGGTCCTGTGGTGACAGATCCGA-3— (Seq No. 4) 设计的探针跨越了 NCJ)00012基因序列中第111098-111743位核苷酸的内含子，
分别与其两端的外显子特异性匹配，这样可非常有效的避免基因组DNA对实验结果的影
响，同时也省去了使用DNA酶对样本进行消化用以去除DNA干扰的步骤。 根据GeneBank序列号为ACJ)00050的基因序列为模板，设计了一对引物及特异性
探针，检测长度为147bp的内参(ACTB基因)mRNA，其引物探针序列分别为 引物3 :5—-CAATGAGCTGCGTGTGGCAG-3— (Seq No. 5) 引物4 :5—-AGCACAGCCTGGATAGCAAC-3— (Seq No. 6)探针3 :5—-CGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTG-3— (Seq No. 7) 设计的探针跨越了 AC_000050基因序列中第1427-1867位核苷酸的内含子，分别 与其两端的外显子特异性匹配，这样可非常有效的避免基因组DNA对实验结果的影B向，同 时也省去了使用DNA酶对样本进行消化用以去除DNA干扰的步骤。 上述技术的探针(探针1、探针2和探针3)，其5—端的荧光发光基团可为FAM、 TET、 JOE、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Fluorescein、 Rhodamine、 Rhodamine Red、 Rhodamine Green、 Rhodamine 6G、 Oregon Green 488、 Oregon Green 500、 Oregon Green 514、 Texas Red、 TAMRA、 Inosine、 HEX、 FITC、 Acridine orange或ROX中任意一种；3—端荧光淬灭基团可为 DABCYL、 DABSYL、 Eclipse、 TAMRA、 BHQ-l、 BHQ_2、 BHQ-3或MGB基团中的任意一种。
本发明提供的使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术是使用一步 法RT-PCR的技术，操作更为简便、快速。使用表达量相对稳定的ACTB基因与目标基因同时 检测，能对标本中的ARHGDIB基因mRNA进行相对表达量进行定量分析。
本发明提供的使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术形成的试剂 盒中使用2个RNA阳性对照品，为人工合成的RNA序列，序列如下
(139bp)(Seq No. 8)
GCUGUGCU(147bp)(Seq No. 9) 其中，ARHGDIB基因mRNA检测体系使用模板1作为阳性对照品，ACTB基因mRNA检 测体系使用模板2作为阳性对照品。 本发明提供的使用ACTB基因mRNA分析ARHGDIB基因相对表达量的RT-PCR技术 形成的试剂盒组成为组成成分(20人份/盒)体积反应缓冲液A380 ii 1反应缓冲液B380 ii 1混合酶60 ii 1RNA阳性对照品A30 ii 1RNA阳性对照品B30 ii 1DEPC水1ml
其中，反应缓冲液的组分(终浓度)包括50mM Tris-HC1(PH 8.3)、50mM KC1、 300uMdNTP、3mM MgCl2，而且ARHGDIB基因mRNA检测体系(反应缓冲液A)含200nM引物1、 200nM引物2和200nM探针1， ACTB基因mRNA检测体系(反应缓冲液B)含200nM引物3、 200nM引物4和200nM探针3，其中，两条探针的5—端标记的发光基团均为FAM，在3—端标 记的淬灭基团均为Eclipse。混合酶的组成成份(终浓度)包括0. 5U AMV酶、0. 5U RNase Inhibitor、0. lmg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0. 05U UNG酶。RNA阳性对照品A和RNA 阳性对照品B分别为适当浓度的模板1和模板2。
本发明提供的技术形成的试剂盒操作步骤如下
PCR反应液的配制 A管按每人份反应缓冲液A 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22u1/ 管分装到0. 2ml PCR管中，然后加入适量待检的总RNA并补充DEPC水，使反应总体积为
30ul ; B管按每人份反应缓冲液B 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22u1/ 管分装到0. 2ml PCR管中，然后加入适量待检的总RNA并补充DEPC水，使反应总体积为
30ul ; RNA阳性对照品直接取8ul ， A管使用RNA阳性对照品A， B管使用RNA阳性对照品 B，按如下程序进行一步法RT-PCR检测反应管先在5(TC反应5分钟，然后95t:保温5分 钟，再按94°C 20秒一60°C 35秒循环40次(6(TC退火条件下采集荧光)。
采用比较Ct值的相对定量法，即通过标本的两管检测Ct值与正常对照品的两管 检测Ct值的A A Ct值，根据F = 2—A Aet公式计算ARHGDIB基因相对ACTB基因的表达量。
传统的RT-PCR使用两步法扩增，时间长，操作相对复杂，且因多了一个步骤而易 发生污染，所以本发明提供的技术采用一步法RT-PCR，将RT步骤与PCR步骤一步完成，无 须开管进行二次加样，将少了污染的机会。由于反应体系中RT步骤是使用特异性引物进 行延伸，与传统的随机引物法相比，逆转录需要的时间更短，通常可在1.5小时内完成全部 RT-PCR反应，并且由于使用热稳定性较强的AMV逆转录酶，可在5(TC进行RT反应，产品的 特异性非常高。
图1为在ABI7300全自动荧光PCR仪上ARHGDIB基因荧光PCR扩增曲线图
图2为临床标本总RNA稀释产物荧光PCR扩增曲线图
具体实施例方式
根据GeneBank中的人类基因组12号染色体ARHGDIB基因相关序列进行比对和分
析，设计和制备引物与探针(设计模板GeneBank序列号为NCJ)00012): 引物1 :5—-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3— (Seq No. 1) 引物2 :5—-GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3— (Seq No. 2) 探针1 :5—-FAM-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-Eclipse-3— (Seq No. 3) 设计并制备人工合成RNA序列(Seq No.8) 根据GeneBank中的人类基因组7号染色体ACTB基因相关序列进行比对和分析， 设计和制备引物与探针(设计模板GeneBank序列号为ACJ)00050): 探针3 :5—-FAM-CGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTG-Eclipse-3— (Seq No. 7)
设计并制备人工合成RNA序列
GCU(147bp)(SeqNo. 9) 将人工合成的两条RNA序列用DEPC处理过的水溶解并稀释至适当浓度，分别作为 ARHGDIB和ACTB基因mRNA的阳性对照品。 按如下配方配制反应缓冲液A(终浓度):50mM Tris-HC1(PH 8. 3)、50mM KCl、 300uMdNTP、3mM MgCl2、200nM引物1、200nM弓|物2禾P 200nM探针1。 按如下配方配制反应缓冲液B(终浓度)50mM Tris-HC1(PH 8. 3)、50mM KCl、 300uMdNTP、3mM MgCl2、200nM引物3、200nM弓|物4禾P 200nM探针3。 按如下配方配制混合酶(终浓度):0.5U AMV酶、0.5U RNase Inhibitor、0. lmg/ ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0.05U UNG酶。试剂盒组成为组成成分(20人份/z盒)体积反应缓冲液A380 ii 1反应缓冲液B380 ii 1混合酶60 ii 1RNA阳性对照品A30 ii 1RNA阳性对照品B30 ii 1DEPC水1ml本发明提供的试剂盒未提供mRNA提取试剂，用户可根据自身要求使用传统的酚-氯仿提取方法或购买商业化的RNA提取试剂盒。
检测步骤 PCR反应液的配制 A管按每人份反应缓冲液A 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22ul/ 管分装到0. 2ml PCR管中，然后加入适量待检的总RNA并补充DEPC水，使反应总体积为
30ul ; B管按每人份反应缓冲液B 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22u1/ 管分装到0. 2ml PCR管中，然后加入适量待检的总RNA并补充DEPC水，使反应总体积为
30ul ; RNA阳性对照品直接取8ul ， A管使用RNA阳性对照品A， B管使用RNA阳性对照品 B，按如下程序进行一步法RT-PCR检测反应管先在5(TC反应5分钟，然后95t:保温5分 引物3 :5—-CAATGAGCTGCGTGTGGCAG-3—
引物4 :5 — -AGCACAGCCTGGATAGCAAC-3—
(Seq No. 5) (Seq No. 6)
7钟，再按94°C 20秒一60°C 35秒循环40次(6(TC退火条件下采集荧光)。 结果分析与监控 根据仪器分析的结果，在如下情况视实验有效对照品A和对照品B的Ct值均 < 32且大于26。 根据公式F = 2—A Aet计算相对表达量。 也有部分全自动荧光PCR扩增仪可直接读取A A Ct值。 SEQUENCE LISTING 〈110〉上海复星医药(集团)股份有限公司
上海复星医学科技发展有限公司
剑军，何
懿，夏 〈120〉 一种使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术 〈160>9 〈170>PatentIn version 3. 3 〈210>1 〈211>24 〈212〉DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 1 accacagaag tccctgaaag agct 24 〈210>2 〈211>21 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400>2 ggtgagccgg gtgacaacga c 21 〈210>3 〈211>23 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈400>3 tcggatctgt caccacagga cca 23 〈210>4 〈211>23 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈400>4 tggtcctgtg gtgacagatc cga 23 〈210〉5
8:o川] :0112] :0113] :oii4]
〈211>20
〈212>DNA 〈213〉人工序列
<400>5
:0115]
caatgagctg cgtgtggcag
:0116] 〈210>6
:0117] 〈211>20
:0118] 〈212>DNA
:0119] 〈213>人工序列
:0120] 〈400>6
:0121] agcacagcct ggatagcaac 20
:0122] 〈210>7
:0123] <211>26
:0124] 〈212>DNA
:0125] 〈213>人工序列
:0126] 〈400>7
:0127] cgagaagatg acccagatca tgtttg 26
:0128] 〈210>8
:0129] 〈211>139
:0130] 〈212>RNA
:0131] 〈213>人工序列
:0132] 〈400>8
:0133] 3CC3C3g朋g UCCCUg朋3g 3gCUgC3gg3朋Ugg3C3朋g￡lUg￡lUg￡lg￡l gUCU￡l￡lUU￡l￡l 60
:0134] gu3c朋g朋3 acgcugcugg g3gauggucc uguggugaca g肌ccg朋ag ccccc朋ugu 120
:0135] cguugucacc cggcucacc 139
:0136] 〈210>9
:0137] 〈211>147
:0138] 〈212>RNA
:0139] 〈213>人工序列 <400>9 caaugagcug cguguggcuc ccgaggagca ccccgugcug cugaccgagg ccccccugaa 60 cccc朋ggcc朋ccgcg3g3 3g3Ug3ccc3 g肌c3Ugu皿gaggicc皿c3 3C3cccc3gc 120 caugimcguu gcuauccagg cugugcu 147
9
权利要求
一种使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术，其特征在于包含用于检测ARHGDIB基因mRNA的一对特异性引物和一条特异性探针以及用于检测ACTB基因mRNA的一对特异性引物和一条特异性探针，扩增目标片段长度分别为139bp和147bp，引物和探针序列分别为检测ARHGDIB基因mRNA的引物和探针引物15`-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3`(Seq No.1)引物25`-GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3`(Seq No.2)探针15`-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-3`(Seq No.3)或探针25`-TGGTCCTGTGGTGACAGATCCGA-3`(Seq No.4)检测ACTB基因mRNA的引物和探针引物35`-CAATGAGCTGCGTGTGGCAG-3`(Seq No.5)引物45`-AGCACAGCCTGGATAGCAAC-3`(Seq No.6)探针35`-CGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTG-3`(Seq No.7)或者上述引物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。
2. 根据权利要求1所述的一种使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技 术，其特征在于标记探针5—端的荧光发光基团可以为FAM、 TET、 J0E、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Fluorescein、 Rhodamine、 Rhodamine Red、 Rhodamine Green、 Rhodamine 6G、 Oregon Green488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、 Acridine orange或R0X中任意一种；3—端荧光淬灭基团可以为DABCYL、DABSYL、Eclipse、 TAMRA、 BHQ-1 、 BHQ_2、 BHQ-3或MGB基团中的任意一种。
3. 根据权利要求1所述的一种使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技 术，其特征在于使用一步法RT-PCR荧光检测技术，对标本中的ARHGDIB基因mRNA和ACTB 基因mRNA进行同时进行检测，对ARHGDIB基因的表达量进行相对定量分析。
4. 根据权利要求1所述的一种使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技 术，其特征在于，可形成试剂盒，使用2个人工合成的RNA作为试剂盒的RNA阳性对照品，序 列如下UGCU(147bp)(Seq No. 9)。
5. 根据权利要求4所述的使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术，其 特征在于，形成的试剂盒，ARHGDIB基因mRNA检测体系使用模板1作为阳性对照品，ACTB基 因mRNA检测体系使用模板2作为阳性对照品。
6. 根据权利要求4所述的使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术，其 特征在于，形成的试剂盒组成为组成成分(20人份/盒)体积 反应缓冲液A 380 ill反应缓冲液B 380 ill混合酶 60 ii 1RNA阳性对照品A 30 illRNA阳性对照品B 30 illDEPC水 1ml其中，反应缓冲液的组分(终浓度)包括50mM Tris-HCl (PH 8. 3) 、50mM KCl、 300uMdNTP、3mM MgCl2，而且ARHGDIB基因mRNA检测体系(反应缓冲液A)含200nM引物 1、200nM引物2和200nM探针1， ACTB基因mRNA检测体系(反应缓冲液B)含200nM引物 3、200nM引物4和200nM探针3，其中，两条探针的5—端标记的发光基团均为FAM，在3— 端标记的淬灭基团均为Eclipse。混合酶的组成成份(终浓度)包括0. 5U AMV酶、0. 5U RNaselnhibitor、0. lmg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0. 05U UNG酶。RNA阳性对照品A和 RNA阳性对照品B分别为适当浓度的模板1和模板2。
7.根据权利要求6所述的一种使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术 形成的试剂盒，其特征在于，可使用如下操作步骤PCR反应液的配制A管按每人份反应缓冲液A 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22ul/管 分装到O. 2ml PCR管中，然后加入适量待检的总RNA并补充DEPC水，使反应总体积为30ul ;B管按每人份反应缓冲液B 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22ul/管 分装到O. 2ml PCR管中，然后加入适量待检的总RNA并补充DEPC水，使反应总体积为30ul ;RNA阳性对照品直接取8ul，A管使用RNA阳性对照品A，B管使用RNA阳性对照品B，按 如下程序进行一步法RT-PCR检测反应管先在5(TC反应5分钟，然后95"C保温5分钟，再 按94°C 20秒一60°C 35秒循环40次(6(TC退火条件下采集荧光)。结果分析，根据标本的两管检测Ct值与正常对照品的两管检测Ct值的A ACt值，对 ARHGDIB进行相对定量分析。
全文摘要
本发明涉及一种使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表达量的RT-PCR技术。本发明分别根据人的ARHGDIB基因mRNA和ACTB基因mRNA设计并筛选到最佳PCR检测方案，能同时对标本中的两个基因的mRNA进行检测，根据两个基因的mRNA检测Ct值与正常对照两个基因的mRNA检测Ct值的ΔΔCt值，可分析ARHGDIB基因与看家基因-ACTB基因之间的相对表达量。同时本发明提供相应的一步RT-PCR检测试剂盒。本发明还提供人工合成的两种RNA，减少假阴性的发生率；本发明检测速度快，能排除基因组DNA的干扰，特异性强，且灵敏度高，可用于ARHGDIB基因表达方面的研究和临床。
文档编号C12Q1/68GK101760523SQ20081020164
公开日2010年6月30日 申请日期2008年10月23日 优先权日2008年10月23日
发明者何剑军, 夏懿 申请人:上海复星医药(集团)股份有限公司;上海复星医学科技发展有限公司