专利名称：牛泌乳量及品质相关基因pou1f1作为分子标记的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于家畜分子标记技术领域，具体涉及一种与牛泌乳量及品质相关尸Ot/丄F7基因片段作 为分子标记的应用。
背景技术：
就我国奶牛的情况而言，高产良种奶牛相对缺乏，奶牛品种和遗传品质比较差，因此在我国需 加强高产奶牛的选育。家畜的重要经济性状往往是受到遗传和环境的作用，奶牛的产奶性状(包括 产奶量、乳脂含量、乳蛋白含量、乳脂率、乳蛋白率等)主要是受遗传因素控制，并受到环境因素 的影响。
随着现代分子生物学技术的发展，利用分子标记辅助选择(marker-assistedselection, MAS) 技术进行选育已经成为可能，从遗传上选择有优势的等位基因，实施分子育种与常规育种相结合， 不仅提高选种的相对准确率和效率，而且可以进行早期选择、提高选择强度、縮短世代间隔。应用 分子标记的现代育种技术对于提高奶牛的产奶量和改善乳品质是先进有效的方法。将灵敏度极高的 一些DNA分析手段应用于奶牛育种中，其主要目的是在DNA分子水平上寻找与奶牛产奶性状密切相关 的遗传标记，用于奶牛的标记辅助选择(Marker Assisted Selection, MAS)，实现早期选择，加 快育种速度，奶牛分子育种是未来奶牛品种改良的主要手段。
垂体特异性转录因子(Pituitary Specific Transcription Factor, POU1F1,或简称Pit-l)是POU结构 域(PIT-OCT-UNC domain)中几种同源(异型)蛋白之一，目前已被正式命名为POUIFl。 POU结构域是 由一段DNA结合区域组成，包括一个POU特异性区域(POU-specific domain, POU-SD)和一个POU同 源性区域(POU-homeo-domain， POU-HD)。垂体特异性转录因子POUIFI参与调节机体的细胞生长与 发育，对垂体激素分泌细胞的基因转录起重要调节作用。
牛的尸OWW基因包含6个外显子禾口5个内含子，基因全长19654bp,其中mRNA全长1502bp，编 码291个氨基酸。Moody等(1995)根据连锁分析的结果，将牛的户OL7^7基因定位于牛的l号染色体。 Woollard等(2000)人将户OW尸7基因定位于牛lp21 22区域上。
Renaville等(1997a)在对89头意大利荷斯坦奶牛Pit-l基因第6外显子的Hinfl酶切结果分析表明A 等位基因与产奶量及角形、A等位基因与体深及后腿形状、A等位基因与低脂肪率和高角等都存在 显著相关。Tuggle和Freeman报道奶牛的POUlFl基因与乳脂率和乳蛋白率存在显著相关。
Zwierzchowski等(2002)报道，他们对波兰黑白花奶牛第6外显子的HinfI酶切分析表明，A等 位基因与产奶量和乳成分存在显著相关。DiStasio等(2002)对肉牛的POUlFl基因的第6外显子的 Hinfl酶切分析表明，BB基因型与腰肉厚存在显著相关。POUIFI蛋白是动物垂体前叶特异性表达 的一种具有重要功能的转录因子(Tuggleetal， 1996) 。 POUIFI蛋白对垂体前叶胚胎发育以及生长 激素(Growth Hormone, GH)、催乳素(Prolactin， PRL)和促甲状腺素亚P单位(Thyroid-Stimulating Hormone e， TSHP )基因的表达起决定性作用(Mangnlam et al. ， 1989; Rosenfeld et al. , 1991)。 POUIFI蛋白与垂体中的PRL基因、GH基因、TSHe基因及其POUlFl基因自身的启动子结合，调节这些基因的转录。通过调节这些基因的表达而对动物的生长发育、繁殖和免疫等很多方面起重要的 作用。在多种垂体激素缺陷而导致侏儒的鼠和人类中，均可发现P0U1F1基因缺少活性(滕勇，经荣 斌，宋成义.哺乳动物POUIFI基因对其生长发育的作用.西北农业学报.2004, 13(2): 11-15)。因此，POU1F1 基因的突变有可能导致垂体的发育不全和阻碍GH和PRL两种激素的分泌。而这两种激素是泌乳性状 的主效基因，所以POUIFI基因是一种潜在的影响泌乳的基因。
迄今为止尚未见到有关利用POUIFI基因作为牛泌乳量及品质的分子标记及应用。
发明内容
本发明的目的在于克隆牛户OL7^V基因的部分DNA序列，寻找该基因突变位点以及多态性的 检测方法，筛选适用于牛泌乳量及品质性状相关的分子标记及其应用。 本发明通过以下技术方案实现
与牛泌乳量及品质性状相关基因尸Of7/F/作为分子标记的应用，按照以下步骤制备 用GENEBANK中提供的牛POU1F1 (登录号NC—007299.3)基因的DNA序列设计引物；从奶牛血 液中提取基因组总DNA， PCR扩增，得到如序列表SEQ ID N0: 1所示的核苷酸序列。其中在序列表 SEQ ID NO: 1的第15640bp处有1个A15640-T15640的碱基突变，导致Hinf I -RFLP多态性。
申请人设计了扩增上述与牛泌乳量及品质相关的P0UIF1基因片段的引物对，同时该引物也是用 于检测序列表SEQ ID NO: 1的第15640bp处A-T碱基突变的正、反向引物，该引物对的DNA序列 如下所示
正向引物5' -AAACCATCATCTCCCTTCTT-3'， 反向引物5' -MTGTACAATGTGCCTTCTGAG-3'。 本发明为奶牛的分子标记辅助育种提供了新的遗传标记。 更详细技术细节如《具体实施方式
》所述。
序列表SEQ ID NO: 1是本发明作为分子标记的奶牛POU1F1基因的部分DNA序列。 图1:是本发明的技术流程图.
图2:对目的DNA片段PCR产物的检测结果，图中1一4泳道为PCR产物，长度为451bP; M泳道
DNA分子量标记(100bp DNA ladder) 图3:是奶牛POU1F1基因序列的Poulfl-历"/1多态性的检测结果。
具体实施例方式
实施例1奶牛P0U1F1基因部分DNA序列的扩增及其多态性检测 1、奶牛P0U1F1基因部分DNA序列的扩增 (1)引物设计
根据GENBANK提供的牛POUIFI基因(登录号为NC—007299.3)的序列设计引物，序列信息如
下
上游引物5' -AAACCATCATCTCCCTTCTT-3' 下游引物5' -AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3'
(2)从奶牛血液中提取总DNA及检测分析1) 从奶牛血液中分离白细胞；
2) 在含有白细胞的试管中加入lml的1XSET, 200uL的蛋白酶K (10mg/mL) ， 10%十二烷基磺酸钠 (SDS) 100uL。置入恒温水浴锅37。C消化过夜；
3) 加入等体积的平衡酚，缓慢颠倒离心管10min，以使管内溶液混匀，4°C 8000rpm离心10min;
4) 小心吸取上层含有DNA的上清液，移入另一离心管中，再次加入等体积平衡酚重复(4.)操作；
5) 同法吸取上清液，加入等体积的平衡酚/氯仿/异戊醇(体积比25:24:1)，缓慢颠倒离心管10min， 4°C 8000rpm离心10min;
6) 吸取上清后加入氯仿/异戊醇(体积比24:1)，与以上相同的条件离心；
7) 吸取上清液，加入1/10体积的NaAc (3M， pH5.2)及2倍体积的无水乙醇(无水乙醇要预冷)， 振荡离心管可见内有白色的絮状物，即DNA，于-20'C放置30分钟；
8) 取出样品，于12000rPm高速离心10min，小心倒掉上层无水乙醇；
9) 加入lmL 70%的乙醇洗涤沉淀，同样12000rpm高速离心10min;
10) 小心弃去70%乙醇，在室温下使残留乙醇挥发，加入适量的TE溶解DNA;
11) 充分溶解后的DNA样可在含有溴化乙锭(EB)的1.5%琼脂糖胶上电泳检测，同时在浓度测定仪 上测定浓度；将该DNA样品存放于-20'C备用。
(3) PCR扩增
PCR反应体系为10 ^iL: lOXBuffer 1.0 ^L， 25mMMg2十1.0 ^L， 4pM上游引物、下游引物(如 上所述)各0.5mL， 10mMdNTP0.2|iL， 5U4iLTaq酶0.2pL， 500ng/nLDNA0.8ML, ddH20 5.8(xL，
混匀、瞬时离心。
扩增条件为94。C预热12min —94。C变性30 s—65'C退火30 s—72'C延伸30 s (从第二步变 性到第四步进行12个循环，退火温度在每个循环降1度)—94'C变性30 s—54'C退火30 s—72'C延 伸30s (从第五步变性到第七步进行24个循环)—72'C延伸10min—15'Cl0min， 4'C保存。PCR 产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。 (4) PCR产物回收及测序 PCR扩增产物经l. 2呢琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物。将PCR产物回收纯化后 测序，测序结果显示PCR产物的长度为244bp和207bp。 2 PCR-SSCP检测及其测序寻找SNP位点 (1) PCR-SSCP检测
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，取4uL扩增产物中加入溴酚蓝变性剂混合物(0.25%溴酚 蓝:变性剂=体积比为1:4) 10uL， 95。C变性15min。变性结束后立即将PCR管置于冰水混合物上 冰浴，防止DNA单链复性。然后在胶联度为39:1的10%的聚丙烯酰胺凝胶上点样进行电泳检测。 1) 10%非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制(总体积35mL) 40%丙烯酰胺溶液 9mL 双蒸水 19mL 5XTBE缓冲液 3.5mL
10% AP溶液 200 u L
5N,N，N' ,N'-四甲基 乙二胺(TEMED) : 20 UL
将以上溶液于小烧杯中混合摇匀。
2) 上样、电泳
凝胶聚合后拔出梳子，用注射器吸取1XTBE缓冲液(购自上海亚培生物科技有限公司)冲洗 梳孔，以除去未聚合的胶液，使样品容易沉降。组装好电泳设备，用1%的琼脂糖胶液封闭好玻璃板 与电泳槽之间的缝隙，防止电泳缓冲液渗漏。在上下缓冲槽中倒入足量1XTBE缓冲液，用50nL 微量进样器将PCR变性产物缓缓注入梳孔。上样完毕后开启电泳仪电源，在110V-120V恒压下电泳 6-8小时，直至二甲苯氰电泳指示条带迁移到凝胶底部。
3) 凝胶染色
电泳完毕，取下玻板，小心地将凝胶从玻板上剥离下来，放入双蒸水中漂洗一次，然后浸入10% 乙醇溶液固定5-10min;用1%硝酸脱色3-8min,然后双蒸水迅速漂洗一次，0. 2%硝酸银晃动闭光染 胶15-25min;染色结束后用双蒸水快速冲洗凝胶两次(每次10s)，洗去凝胶表面残留的硝酸银溶 液。在染胶盒中倒入含3%化20)3和微量甲醛的显色液，立即快速地晃动胶盒，避免析出的黑色银颗 粒在凝胶表面沉积。显色液颜色变暗时立即更换新鲜的显色液。注意观察显色情况，目的条带显现 清晰后立刻将凝胶转入3%的乙酸溶液，浸泡lOmin停显。
4) 凝胶成像与电泳条带分析
将目标条带清晰的凝胶在BIO-RAD凝胶成像系统中进行扫描并保存电泳图谱。根据电泳条带判 断基因型。
(2) PCR产物的纯化和测序
在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL Ependorff管中，然后 用PCR产物纯化试剂盒(购自日本TOYOBO公司，按照该试剂盒的说明书操作)纯化PCR产物。纯 化方法为在1. 5 ml离心管中加入400 u L吸附液，在凝胶完全溶解之前将其放置在室温中，且不 时进行搅拌，如果想要快速溶解琼脂糖凝胶或溶胶难以溶解时，放入55'C水浴锅温浴5min，加入 30liL磁珠，经常用漩涡混合器搅拌，并放置2min (室温)，然后放入离心机(6000卬m, 5sec)， 加入600iiL洗净液，搅拌10sec，离心(6000rpm, 5sec)，加入lmL 75%无水乙醇，搅拌10sec， 瞬时高速离心，彻底去除上清部分(打开微型试管的盖子，55'C下放置5min，干燥)，加入 25uL-100uL蒸馏水，搅拌10sec,放置2min后离心(6000rpm， 5sec)，回收上清液。上清液中 含有回收的目的片段。
从两个品种的样品中分别挑选几个DNA样品送到上海生工生物工程技术有限公司进行测序。
(3) DNA序列比对及突变位点的鉴定 用测序获得的基因序列进行序列同源性比较，用DNAstar5. 01软件SeqMan和MegAlign工具对
测序峰图进行分析，以鉴定和获得该DNA序列的突变信息。 3、 PCR-RFLP诊断方法建立
(1) PCR产物的扩增 PCR产物的扩增如前面所述。(2) PCR产物酶切 设计的引物如下-
上游引物5' -AAACCATCATCTCCCTTCTT-3' 下游引物5' -AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3
PI酶切反应体系为lOuL:限制性内切酶M"/1 0.2uL (lOU/uL), lOX缓冲液luL， PCR 产物2uL，加ddH20至10wL， 55。C条件下水浴酶切3 4小时。
(3) PCR-RFLP检测
酶切产物检测由于本试验扩增产物片断较小，所以都用聚丙烯酰胺凝胶进行酶切结果检测， 所用的丙烯酰胺胶联度为29:1浓度为8%的凝胶。 每板胶35mL，配制方法
30%丙烯酰胺9.3mL
双蒸水 18.42mL
5XTBE: 14mL
腦AP: 0.23mL
TEMED: 20 uL
酶切产物用8%丙烯酰胺凝胶电泳，缓冲液为1XTBE， 110V恒压4小时，用银染法染色，拍照，并 由带型来判断基因型，记录基因型。结果如表1-3.
表l Poulfl-g/"/I变异位点在牛群中的等位基因频率和基因型频率
等位基因频率
基因型 样本数 基因型频率
Allele frequency
Genotype Number Genotype frequency
_^_
AA 14 0.0526 0.2199 0.7801
AB 89 0.3346
BB 163 0.6128
合计 266 1.0
表l显示出Poulf1-Hinf I变异位点在牛群中的等位基因频率和基因型频率，在266头奶牛中， 其中BB基因型在该研究群体中的频率最大，为0.6128、其次是AB基因型，为03346、而AA基因型最 低，为0.0526。等位基因A的频率为0.2199，等位基因B的频率为O. 7801。由此可以看出B为优势等 位基因。
表2 尸ou7/7基因g切/1酶切多态性与产奶量的统计分析
基因型隨-、w 样本数产奶量
GenotypeNumbeMilk yield
AA146574.65±1217.16a
AB896167.64±1429.21a
BB1635987.69±1286.10b
7注具有相同字母表示差异不显著(PX).05)，字母不同表示差异显著(PO.Ol)。 表2看出三种基因型间对奶牛产奶量的影响没有达到显著差异(P>0. 05)，但是M型和BB型之间、 AB型和BB型之间达到了显著差异(P〈0.05)。
表3 /^WW基因Hinfl酶切多态性与乳脂率和乳蛋白率的统计分析
记录数 Numble
基因型 Genetype
AA
AB
BB
乳脂率 Fat percent (%) 乳蛋白率 Protein percent (%)
132 3.995±0.197a 3.488i0.417b 3.674±0.447a'
132 2.963 ±0.458a 3.023 ±0.254a 3.018±0.237a
注具有相同字母表示差异不显著(PX).05),字母不同表示差异显著(PO.Ol)。 表3可知P0U1F1-Hinf I不同的基因型对乳脂率和乳蛋白率的影响有显著的差异(P>0.05)。 M 型和AB型之间的差异达到了极显著水平(P〈0. 01); AA型、AB型与BB型之间达到了显著水平(P〈0. 05)。 乳蛋白率在不同基因型之间没有显著的差异(P>0.05)。 M型的个体乳脂率最高，AB型的最低。但 是AA型个体的蛋白率是最低的，AB型的蛋白率是最高的。
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权利要求
1、牛泌乳量及品质相关的POUIF1基因片段作为分子标记的应用，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，其中在序列表SEQ ID NO1的第15640bp处有1个A15640-T15640的碱基突变，导致HinfI-RFLP多态性。
2、 一种作为分子标记应用的与牛泌乳量及品质相关的P0UIF1基因片段，它的核苷酸序列 如序列表SEQ ID NO: 1所示，其中检测序列表SEQ ID NO: 1的第15640bp处A-T碱基突 变的正、反向引物对的DNA序列如下所示正向弓l物5' -AAACCATCATCTCCCTTCTT-3', 反向引物5' -AATGTACAATGTGCCTTCTGAG-3'。
全文摘要
本发明属于家畜分子标记制备技术领域。具体公开了一种奶牛泌乳量及品质相关的POUIF1基因片段作为分子标记的应用。所述基因核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，其中在序列表SEQ ID NO1的第15640bp处有1个A15640-T15640的碱基突变，导致HinfI-RFLP多态性。同时公开了扩增所述基因和检测序列表SEQ ID NO1的第15640bp处A-T碱基突变的正、反向引物对的DNA序列。本发明为奶牛分子标记辅助选择提供了一种新标记。
文档编号C12N15/12GK101525664SQ20091006166
公开日2009年9月9日 申请日期2009年4月20日 优先权日2009年4月20日
发明者勇 余, 辉 刘, 刘兴斌, 张淑君, 杨利国, 杨焕堂, 武防杰, 江一波, 胡修忠, 谈宇青 申请人:华中农业大学