专利名称：奶牛产奶量相关基因牛ERα作为分子标记的应用的制作方法
技术领域：
发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种与奶牛产奶性状相关的基因f/Pc作为奶牛分子 标记的应用。
背景技术：
我国牛奶和牛肉的生产同发达国家相比差距较大，主要是因为我国奶牛品种和遗传品质比较差。应用 分子标记的现代育种技术对于提高奶牛的产奶量和改善乳品质是先进有效的方法。将灵敏度极高的一些 DNA分析手段应用于奶牛育种中，其主要目的是在DNA分子水平上寻找与奶牛产奶性状密切相关的遗传标 记，用于奶牛的标记辅助选择(Marker Assisted Selection, MAS)，实现早期选择，加快育种速度。
乳腺发育主耍受类固醇和多肽类等激素的调控。雌激素是乳腺细胞进行有丝分裂的有效分裂原，对于 乳腺的正常发育是必需的(Jose Russo等，2002)。雌激素对靶细胞作用的分子基础是靶细胞内存在一种 能与其特异性结合的雌激素受体(Estrogen rec印tor，柳(St卿f等，1977)。
雌激素受体(M0是一类由配基激活的转录因子，介导大部分已知的雌激素效应。屈属于核受体超家 族的成员，是一种能与雌激素特异性结合的糖蛋白，具有特异性强、亲和力高和结合容量低的特性，包括
(George et al.， 1996)和f/PA (Eva Enmark等，1997)。 ^S 分布于许多组织，包括中枢神经系统、 心血管系统、免疫系统、泌尿生殖道、胃肠道、骨组织、肾脏、肺脏和子宫等。多数学者认为，雌激素对 乳腺的作用由SPff介导。从初情期开始，乳腺细胞快速生长发育，这主要由雌激素刺激导管增生和孕酮促 进腺泡发育引起的。Saji等(2000)用免疫组化法对大鼠乳腺中^ff"和M^的表达水平进行了研究，结果 发现初情期前乳腺中表达朋"的细胞约占40%,共同表达2种受体的细胞约占25%;妊娠期，多数细胞表达 0 》，少数细胞表达M"，共同表达2种受体的细胞极少；泌乳期，主要是共同表达2种受体的细胞；断奶 后，表达^ a的细胞较少，共同表达2种受体的细胞极少。虽然现已明确雌激素能促进乳腺导管的发育， 但其受体在乳腺发育中的作用还不清楚。
王月影等(2007)对不同发育期大鼠乳腺组织中雌激素受体a的表达进行了研究'研究结果发现，妊 娠期和泌乳期大鼠乳腺中^Z^表达水平均低于处女期，且差异显著(P<0. 05);整个妊娠过程中，以妊娠12d 最高；泌乳期随着时间的延长，fifc的表达水平增加，但差异不显著(P>0. 05)。提示^ c可能参与了乳腺
细胞的发育和凋亡。
迄今为止尚未见到有关牛^ c基因作为奶牛产奶性状的分子标记。
发明内容
本发明的目的具体涉及一种与奶牛产奶性状相关的基因^ "作为奶牛分子标记的应用。本发明是这样实现的
申请人通过制备获得了一个奶牛产奶量相关基因f" o作为分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: l所示，其中在序列表SEQ ID NO: 1的第114bp处有1个T114-A114的碱基突变，导致Z ral-RFLP多 态性。
其中用于扩增所述基因祝cz和检测序列表SEQIDNO: 1的第114bp处T-A碱基突变的正、反向引物 对的DNA序列如下所示
正向引物5' CAGGGCTCTCTGGTTCTTTG 3% 反向引物5'GGAGAAGGAGCGTCTTTGTG3'。
本发明的具体步骤如下
(1) 从被检牛血液样本中提取牛血液总DNA;
(2) 根据报道的牛ERa基因序列(GenBank登录号AY160683),利用生物学引物设计软件Primer5. 0 和在线引物设讣Primer3.0,综合考虑引物设计的各项原则，设计引物，引物由上海生工生物工程技术服 务有限公司合成。所述引物对的核苷酸序列如下
正向引物5' CAGGGCTCTCTGGTTCTTTG 3'， 反向引物5' GGAGMGGAGCGTCTTTGTG 3'。
(3) PCR反应扩增程序为94 。C变性3 min, 35次循环(94 °C 1 min， 60 °C 1 min， 72 。C 1 min)， 72 'C延伸10 min，得到PCR扩增产物。
(4) 用2. 5°/。琼脂糖凝胶电泳对步骤(3)的扩增产物进行检测，所述电泳条件为屯压100 V，时间为20min, 染色，在凝胶成像系统中观察条带。
(5) PCR产物回收测序，发现在114位存在突变位点。
(5) 取16 uL PCK扩增产物，加入5 Z ra I限制性内切酶和2 y L IOX酶切缓冲液，加水至20 u L, 37 。C,反应5 h。
(6) 反应完成后，在10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳条件为稳压100 V，电泳时间为4 h，银染，根据扩 增产物的大小判定结果。
使用PCR扩增得到含有T114-A114 (等位基因突变)SNP位点的ERa基因259bp的片段。由于扩增
引物中引入了一个碱基的错配，产生了一个酶切位点，导致5rs I -RFLP多态性。
根据扩增产物的大小判定结果若出现259bp —条带，判定该基因型为M型；若出现172bp和87bp两 条带，判定该基因型为BB型；同时出现259bp、 172bp和87bp三条带，判定该基因型为GT型。
序列表SEQ ID NO: 1是本发明作为分子标记用的ER a基因的核苷酸序列 图l:是本发明的技术流程图。
图2:用奶牛血样DNA扩增^ff"基因259bp的片段，琼脂糖检测电泳图。琼脂糖凝胶浓度为2. 5%。图中 编号说明如下1， 2， 3， 4， 5泳道分别为5个样本的PCR扩增产物(25恥p); M泳道DNA分子量标记(100 一600bp)。图3: 基因259bp测序结果图。
图4: 基因PCR产物经Z^3l酶切，基因分型电泳图。聚丙烯酰胺胶浓度为10%。图中编号说明如下
泳道l、 2、 8、 9、 10、 ll为AB基因型；泳道3、 4、 5、 6、 7为BB基因型。M泳道DNA分子量标记(100 —600bp)。
具体实施例方式
实施例1 (制备实施例)
1、 奶牛血样的采集及处理
取奶牛血样约10niL,加入O. 5 mol/L的EDTA500 u L (使终浓度为25 mmol/L)抗凝，4'C离心(8000 rpm) 10 min,弃上层清，分离白细胞，加入蒸馏水，摇匀，使红细胞破裂，离心10 min，弃上层清液。重复两 次后，在沉淀中加入1XSET 1 raL和lW。十二垸基硫酸钠(使终浓度为0.5%)，再缓慢加入蛋白酶K (终浓 度为50 100 yg/mL)，置于55 'C水浴锅消化8 10 h， 4 。C冰箱中保存备用。
2、 从奶牛血样中提取总NDA
(1) 取消化后的试样，加入等体积的平衡酚(PH 8.0)，缓慢颠倒离心管10 min， 4 'C, 8000 rpm离 心10 min。
(2) 小心吸取含有DNA的上清液，移至另一离心管中，重复步骤(1)的操作。
(3) 吸取的上清液中加入等体积的平衡酚/氯仿/异戊醇(体积比为25: 24: 1)，缓慢颠倒离心管10rain, 4 。C， 8000 rpm，离心10 min。
(4) 吸取上清液后加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24: 1),缓慢颠倒离心管10min， 4 °C 8000 rpm离心10 min。
(5) 吸取上清液，加入1/10体积3 raol/L NaAC及2倍体积的无水乙醇，迅速转动离心管，可见白色的 絮状物，艮阳NA， -20 。C放置30 min。
(6) 取出冷冻后的样品，于10000 rpm转速离心5 8 min，去掉上层乙醇，加入70%的乙醇1 raL洗涤 沉淀，80000 rpm离心5 8 min。
(7) 加入70%的乙醇重复洗涤一次，80000 rpm离心5 8 min。
(8) 弃去乙醇，在室温下挥发残留乙醇，加入适量的TE溶解DNA，存放于-20 'C冰箱保存备用。
3、 引物设计
根据牛^7ftf基因序列(GenBank登录号NC_007307)，利用生物学引物常用设计软件Premier 5,设 计引物，由上海生丁.生物工程技术有限公司合成。 该引物对的核苷酸序列如下 正向5' CAGGGCTCTCTGGTTCTTTG 3', 反向5' GGAGMGGAGCGTCTTTGTG 3'。
4、 PCR扩增反应
PCR反应总体积为25 u L (见表l)。扩增程序是94 'C变性3 min， 35次循环(94 'C 1 min， 60 °C 1 min, 72 'C 1 min)， 72 。C延伸10 min。表l 本发明的PCR反应体系反应体系体积(n L)
10X buffer2.5
祝c正向引物1
祝c反向引物1
Tag酶(2U/P 1)0.5
d證(10 nM each)0.5
模板DNA1.5
ddHO 218
Total25
取2 PL PCR产物，2.5%琼脂糖凝胶电泳(100 V，电泳20 min)，溴化乙锭染色后，在凝胶成像系统 观察条带，PCR扩增产物片段大小应为259bp。 5、 PCR产物回收及测序
PCK扩增产物经1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物。将PCR产物回收纯化后测序， 测序结果显示PCR产物的长度为259bp。电泳图谱见图2
测序结果表明在这两个片段的114bp处有l个碱基突变(即T114-A114)，测序峰参见图3。
6、 酶切反应
取16uL PCR扩增产物，加入5 Z ral限制内切酶和2uL IOX酶切缓冲液，该缓冲液购自宝生物工程 (大连)有限公司，加水至20"L， 37。C反应5h。
7、 酶切产物检测
10%聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳(技术参数稳压IOO V,电泳4 h)，银染。具体染色方法如下
(1) 电泳完毕，取下玻璃板，小心地将凝胶从玻璃板上剥离下来，放入双蒸水中漂洗一次，然后浸入10% 乙醇溶液固定5 10 min。
(2) 用1%硝酸脱色3 8 min，然后双蒸水迅速漂洗一次。
(3) 0.2%硝酸银晃动闭光染胶15 25 min;染色结束后用双蒸水快速冲洗凝胶两次(每次10s),洗去凝 胶表面残留的硝酸银溶液。
(4〕在染胶盒中倒入含3呢Na2C03和微量甲醛的显色液，立即快速地晃动胶盒，避免析出的黑色银颗粒在凝 胶表面沉积。显色液颜色变暗时立即更换新鲜的显色液。 (5)注意观察显色情况，目的条带显现淸晰后立刻将凝胶转入3%的乙酸溶液，浸泡IO min停显。 8、基因型鉴定
CVM基肉型鉴定结果如图3所示，在ERa基因的PCR-RFLP酶切产物电泳图谱中，若只出现259bp—条带， 判定基因型为AA型；若出现172bp和87bp两条带，判定基因型为BB型；同时出现259bp、 172bp和87bp三条 带，判定基因型为AB型。
6实施例2 (应用实施例)
对祝a基因多态位点不同基因型与奶牛产奶量性状进行了关联分析的检测应用。牛for基因Dral 酶切多态位点关联分析结果见表1和表2。由表1和表2中可以得出2种基因型间对奶牛产奶量的影响有 达到显著差异(P<0. 05)。 BB型的产奶量比AB的型的要高，BB型优势个体。同时BB型的个体数也比AB 型的多，这也有可能是B等位基因有优良效果对选择育种影响的结果。
_^_利用最小二乘法分析各变因对产奶量的影响_
变因 自由度 平方和 均方 F P值
41. 74** <. 0001 5. 49" <■ 0001
1.88 0.1126
4. 24* 0. 0402
注，表示P〈0. 05，差异显著；"表示P〈0. 01,差异极显著
表2 牛&g基因"ra I酶切多态性与产奶量的统计分析_
^~ 观察数 "~产奶量
AB 78 5942. 18 ±1162.55'
BB 190 6213.77 ±1305.99'
注具有相同字母表示差异不显箸(P>0. 05),字母不同表示差异显著(P<0. 05)。
由表1和表2中可以得出三种基因型间对奶牛产奶量的影响没有达到显著差异(P〉0.05)， BB基因型
个体的产奶量最高，而AB基因型的个体最低。
表3牛五r"基因"ra I酶切多态性与乳脂率和乳蛋白率的统计分析
记录数基因型
AA ABBB
乳脂率1323. 616±0.453a3. 920±0. 239a
乳蛋白率1322. 847±0. 443°3. 024±0. 241a
注具有相同字母表示差异不显著(P>0. O5)，字母不同表示差异显著(P<0. 01).
有表3可知Er a不同的基因型对乳脂率和乳蛋白率的影响不显著平(P〉0. 05),但是BB型的乳脂率和 乳蛋白率都要比AB型的要高。
参考文献
1.王月影，范光丽，杨国宇等.不同发育期大鼠乳腺组织中雌激素受体A的表达.西北农林科技大学学 报(自然科学版).2007， 35 (3) : 53-56
场
年、季节 胎次 基因型
53849167. 7453849167. 74
合计
12 4 1
367 385
84975634.70
9722537. 18
5466863. 33
473476934. 2 627491137. 1
7081302. 89
2430634. 29
5466863. 33
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<221> primer—bind <222> (251). . (259) <223〉 <，>
<221> primer—bind <222〉 (1)..(19) <223> <220〉
<221〉 mutation <222〉 (114).. (114) <223〉 ■> 1
cagggctctc tgg"ctUg tgtctgaggc tcagtagttg agatcagtga gatcaaagtt 60 gcttttccat aac朋gccca acgctcatcfi朋ggcatctg tgtttgacat tagaaaatgc 120 tagccaagat gtcaggtggc tggtggaagc attcacaggt tctggtgttt tta卿ttgg 180 3C3Bctgt3t atttcEic卿3鄉tggtsc幼ggcatccs tttgc胡gtc ttg肪33cac 240 acaaagacgc tccttctcc 259
权利要求
1、奶牛产奶量相关基因ERα作为分子标记的应用，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，其中在序列表SEQ ID NO1的第114bp处有1个T114-A114的碱基突变，导致Dra I-RFLP多态性。
2、 一种作为分子标记应用的与奶牛产奶量相关的ERa基因片段，它的核苷酸序列如序列 表SEQ ID NO: 1所示，其中检测序列表SEQ ID NO: 1的第114bp处T-A碱基突变的正、 反向引物对的DNA序列如下所示正向引物5， CAGGGCTCTCTGGTTCTTTG 3，， 反向引物5 ， GGAGAAGGAGCGTCTTTGTG 3'。
全文摘要
本发明属于家畜分子标记制备技术领域。具体公开了一种奶牛产奶量相关基因ER α片段作为分子标记的应用。所述基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，其中在序列表SEQ ID NO1的第114bp处有1个T114-A114的碱基突变，导致Dra I-RFLP多态性。同时公开了扩增所述基因和检测序列表SEQ ID NO1的第114bp处T-A碱基突变的正、反向引物对的DNA序列。本发明为奶牛分子标记辅助选择提供了一种新标记。
文档编号C12Q1/68GK101525663SQ20091006166
公开日2009年9月9日 申请日期2009年4月20日 优先权日2009年4月20日
发明者勇 余, 姜勋平, 张淑君, 彭开华, 戴红安, 杨利国, 俊 梅, 胡修忠, 陶利文, 霍立军 申请人:华中农业大学