利用水稻基因OsNHAD提高植物的耐盐性的制作方法

专利名称：：利用水稻基因OsNHAD提高植物的耐盐性的制作方法
技术领域：
：本发明涉及水稻基因工程
技术领域：
。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能够提高盐胁迫耐受能力的水稻feAM4Z基因在水稻耐盐性遗传改良中的应用。所述的基因0sAK4Z与植物对非生物逆境的抗性相关。将该基因的完整翻译区(Codingsequence)与花椰菜花叶病毒启动子(CaMV35S)结合后直接转入水稻，转基因植株对高盐胁迫的耐受性显著提高。
背景技术：
：植物的生长除了有其固有的遗传基础外，往往还会受到诸多环境因素的影响。干旱、高盐、低温是最为常见的非生物逆境，严重影响了植物的生长，限制了植物的分布。非生物逆境会造成作物产量和品质的下降，在许多地区是农业发展的瓶颈。因此，培育抗逆性作物品种一直是农业科学技术研究的主要目标之一。为了适应或抵御这些逆境条件，植物在经过长期的生物驯化之后，形成了一套防御干旱、高盐、低温等逆境胁迫的自我保护机制。干旱、高盐和低温胁迫，都破坏了植物细胞的离子平衡，致使细胞脱水，使植物细胞受到离子和水分胁迫，引起植物体在基因表达，新陈代谢以及形态上的变化，这些变化包括一些基因表达升高或降低，生长的减缓甚至停止，体内激素(如ABA)的瞬时上升，体内调节渗透压的物质的聚集等(SekiM，UmezawaT，UranoK，ShinozakiK.Regulatorymetabolicnetworksindroughtstressresponses.Cwrr加'/7/Va;3t^'o力2007,10:296-302)。植物在受到逆境胁迫后，经过一系列的信号传导和转录调控，启动下游大量抗逆基因的表达。下游抗逆基因的编码产物主要是一些在植物抗逆反应中直接起保护作用的蛋白质，包括保护细胞免受水分胁迫伤害的功能蛋白、合成渗透调节物质的关键酶类、清除活性氧KOS的酶类等。这类蛋白能提高植物对逆境的耐受性，如伴侣蛋白、LEA蛋白、抗冻蛋白、通道蛋白、抗氧化蛋白等(ValliyodanB,NguyenHT.Understandingregulatorynetworksandengineeringforenhanceddroughttoleranceinplants.CwxQw'/j/Va/^&'o/，2006，9:189-195)。这些功能蛋白在植物对逆境的应答过程中起着非常重要的作用。因此分离和鉴定这些抗逆功能基因，并用于作物抗逆的遗传改良有着重要的意义。根据对已有的模式植物的研究，人们已在植物抗性改良方面作了尝试。例如LEA蛋白具有高度的亲水性，使植物能够在缺水条件下，保持膜系统及生物大分子免受破坏。将大麦的LEA蛋白基因^^转入水稻，转基因水稻的抗旱性和耐盐性均比对照有明显提高；且抗性强弱明显与LEA蛋白的含量相关(XuD，DuanX,WangB，HongB,HoT,VfuR.ExpressionofaLateErabryogenesisAbundantProteinGene,HVA1,fromBarleyConfersTolerancetoWaterDeficitandSaltStressinTransgenicRice.戶Ja/7f1996，110:249-257)。拟南芥的钠氢离子交换蛋白基因^舰W不仅在拟南芥中表达能提高植株的抗盐性(ShiH,ZhuJK.RegulationofexpressionofthevacuolarNa+/H+抑tiportergeneAtNMlbysaltstressandabscisicacid./V朋tifo/fo'W，2002,50:543-550),将其转化番茄，转基因植株抗盐性也明显提高(ZhangHX，BlunwaldE.Transgenicsalt-toleranttomatoplantsaccumulatesaltinfoliagebutnotinfruit,〃at^-otec力加7，2001，19:765-768)。水稻(arza是最重要的粮食作物之一，培育抗逆水稻新品种具有重要的意义。在我们的前期研究中分离到一条受多种逆境诱导的cDNA，序列分析表明它与细菌的NHAD蛋白有一定的相似性。细菌的NHAD蛋白可以通过对钠氢离子的运输，提高转基因细菌对高盐等逆境的抗性(HabibianR，DziobaJ，BarrettJ,GalperinMY,LoewenPC,DibrovP.FunctionalanalysisofconservedpolarresiduesinVc-NhaD，Na7H'antiporterofVibriocholerae./历o7C力棚，2005,280:39637-39643)。但植物中NHAD蛋白超量表达能否提髙植物的抗逆性尚无报道。因此，从水稻中分离出AM4Z)同源基因，并鉴定它在提高水稻抗逆性方面所发挥的功能，对于培育抗逆水稻新品种将具有非常重要的意义。
发明内容本发明的目的是从水稻中分离克隆一个包含该功能蛋白同源基因完整编码区段的DNA片段(在本发明中所述"DNA片段"与"核苷酸序列"同义，下同)，利用这个基因提高水稻对盐胁迫耐受能力，应用该基因在水稻耐盐性遗传改良中的应用。对这个基因编码的蛋白序列进行分析表明它与细菌的冊八0(%+/11+antiporterDtype)蛋白有一定的相似性，因此被命名为OsNHAD基因。本发明涉及分离和应用一种包含flsAK^基因的DNA片段，该片段赋予植物在逆境条件下抗性增强的能力。其中，所述的0sNHAD基因是下列核苷酸序列之一1)序列表SEQNO:1中第60-1649位所示的DNA序列；或2)编码与l)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。可以采用已经克隆的OsAffi^基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基闵。同样，也可以采用PCR(polymerasechainreaction)技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的GsyW朋基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含0/ffi^基因的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得抗逆性增强的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，可以在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。携带有本发明&^\^必基因的表达载体可通过使用11质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，MethodforPlantMolecularBiologyVIII,AcademyPress,NewYork,pp.411-463;GeisersonandCorey,1998,PlantMolecularBiology(2ndEdition)。可使用包括本发明的tts鹏4"基因的表达载体转化的宿主是包括水稻在内多种植物，培育抗旱，抗盐或抗寒的植物品种。本发明基因是受逆境诱导表达的，因此可将本发明的基因与任何感兴趣的逆境诱导启动子结合后连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在逆境条件下可诱导表达基因，提高植物对非生物逆境的抗性。4下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。序列表SEQIDNO:1显示的是本发明分离克隆的包含有foAK仏基因编码区的核昔酸序列。图1:采用ClustalW软件(公开使用软件)将fl5腳5基因预测的蛋白序列与NHAD同源蛋白序列进行比对的结果。图中0s:gi115477946,Sequencesource:0ryzasativa水稻；Zm:gi195611882,Sequencesource:Zeamays玉米Atl:gi18402254,Sequencesource:Arabidopsisthaliana拟南芥At2:gi15222822,Sequencesource:Arabidopsisthaliana拟南芥；Mc:gi150247011，Sequencesource:Mesembryanthe咖mcrystallin咖冰叶日中花；Bj.'gi27378850，Sequencesource:Bradyrhizobiumjaponic咖大豆根瘤菌.图2:本发明的超量表达载体pCB2004H-0s朋AD的构建示意图。将fls/W必全长基因经重组反应插入CaMV35S启动子后。图3:用Real-timePCR检测fl7W7朋基因在水稻不同组织中的表达水平。10个组织或器官依次是1.愈伤组织；2.种子；3.发芽3天的幼苗；4.三叶期的叶片和根；5.剑叶；6.茎；7.短于5Cm的幼穗；8.抽出的穗；9.颖壳；10.胚乳。各组织/器官的fl7W力"基因相对表达量以愈伤组织为参照(即设定为1)。图4(包含图4a，图4b，图4c和图4d):用Real-timePCR检测fcAKW在多种逆境(干旱、高盐、低温、脱落酸即ABA等)胁迫后的表达量变化。flaWJ"基因相对表达量以处理前为参照(即设定为l)。图5:正常生长和200mmol/L高盐胁迫下，5个ttM^)超量表达转基因水稻家系(TO和对照生长状况的比较。具体实施例方式以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆包含有fls，遮因完整编码区段的DNA片段，以及验证ttsTWMZS因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。实施例1:分离克隆fls鹏W基因通过水稻品种"中旱5号"(由中国上海农科院提供的一个公开使用的一个水稻品种)和"珍汕97"(—个中国普遍推广应用的一个杂交水稻亲本)的干旱诱导基因表达谱分析，发现了一个受干旱诱导上升表达的EST(表达序列签)，经序列分析发现，该基因fc旭4Z编码产物与细菌(大豆根瘤菌)蛋白NHAD有7W的同源性(图1)，通过查找日本水稻全长数据库(http:〃cdna01.dna.affrc.go.jp)，找到其所对应的cDNA克隆J013023H14，并将其定位于第9染色体BAC克隆AP005787的110206bp-122237bp上。釆用TRIZ0L试剂(购自Invitrogen公司)从干旱胁迫处理的水稻品种"日本晴"(公开报道的一个品种)中提取叶片总RNA(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶SSII(购自Irwitrogen公司)将其反转录合成cDNA,反应条件为65°C5min，42'C120min，70°C10min。用引物GPF(5，-GGCACTCTCACTCACACGG-3，)和GPR(5'-GGATGGTCCCAATGTMCCC-3，)扩增出flsvW^9基因的全长cDNA(3252bp)。PCK反应条件为94。C预变性3niin;94°C30see,53°C30sec,72'C4min,35个循环；72'C延伸10rain。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的基因全长cDNA。将该克隆命名为pGEM-OsNHAD。实施例2:fo旭4Z基因超量表达载体的构建和遗传转化为了能更好的分析&AK4Z基因的功能，申请人将其在水稻中超量表达。从转基因植株的表型研究该基因的功能。超量表达载体构建方法如下首先将实施例1中得到的阳性克隆pGEM-0sNHAD质粒(实施例1中得到)用引物ALLF(5'-GGGGACAAGTTTGTACMAAAAGCAGGCTTMTACGACTCACTATAGGG-3')和ALLR(5，-GGGGACCACTTTGTACMGMAGCTCGGTATTTAGGTGACACTATAG-3')，扩增出包含flsV^必全长的DNA片断，反应条件为94'C预变性3niin;94'C30sec,50°C30sec,72°C4min，35个循环；72'C延伸10min。将该片段经BP重组反应构建到pD0NR207载体上(载体购自Invitrogen公司)，操作按Invitrogen公司提供的重组克隆试剂盒说明书进行。然后将pDONR207OsNHAD与pCB2004H载体(公开发表的超量表达载体,Leieta/-(2007)High-throughputbinaryvectorsforplantgenefunctionanalysis./W朋t扮oJ49:556-567)做LR重组，按Invitrogen公司提供的重组克隆试剂盒说明书(货号Cat.No.11791-020)进行。最终将ftryW必构建到可用于做遗传转化的超量表达载体pCB2004H上(见图2)。通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系将其导入到水稻品种中花11(中国水稻研究所提供的一个公开使用的一个水稻品种)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系在Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficienttransformationofrice,Qr/^aL，mediatedby々i-ofe"erj'咖andsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA,f/朋t/，6:271-282,1994)基础上改良进行。转化载体共获得了40株独立的转基因水稻植株。具体步骤(l)愈伤诱导将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70%的乙醇处理1分钟，0.15《氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将种子放在诱导培养基上(成分见后)；将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25土rC。(2)愈伤继代挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，温度25士rC。(3)预培养挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25土rC。(4)农杆菌培养在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105(来源于CAMBIA，商用菌株)两天，培养温度28'C;将所述的农杆菌转移至悬浮培养基(成分见后)里，28"C摇床上培养2-3小时。(5)农杆菌侵染将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至0De。。0.8-1.0;将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20'C。(6〉愈伤洗涤和选择培养灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400卯m羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸千；转移愈伤至选择培养基(成分见后)上选择2-3次，每次2周(第一次筛选羧苄青霉素浓度为400ppm,第二次以后为250卯m,潮霉素浓度250ppm)。(7)分化将抗性愈伤转移至预分化培养基(成分见后)上黑暗处培养5-7周；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26'C。(8)生根剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26t;。(9)移栽洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。试剂配方(1)试剂和溶液缩写本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-节基腺嘌呤);CN(Carbenicillin，羧节青霉素);KT(Kinetin,激动素);NM(Napthaleneaceticacid，萘乙酸)；IM(Indole-3-aceticacid,d引哚乙酸)；2，4_D(2，4-Dichlorophe加xyaceticacid,2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(CaseinEnzymaticHydrolysate,7jC解酪蛋白)'HN(HygromycinB，潮霉素)；DMS0(DimethylSulfoxide,二甲基亚砜)；N6咖x(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方1)N6培养基大量元素母液[10倍浓縮液(10X)]的配制硝酸钾(KM)3)28.3g磷酸二氢钾(KH2P04)4.0g硫酸铵((NH4)2S04)4.63g硫酸镁(MgS047ft0)1.85g氯化钙(CaCl22H20)1.66g逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。2)N6培养基微量元素母液[100倍浓縮液(100X)]的配制碘化钾(KI)0.08g硼酸(H3B03)0.16g硫酸锰(MnS044H20)0.44g硫酸锌(ZnS047H20)0.15g室温下溶解并定容至IOOOml。3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X)的配制准备800ml双蒸水并加热至70。C，加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA2H20)3.73克'充分溶解后在70'C水浴中保持2小时，定容至1000ml,4'C保存备用。4)维生素贮存液(100X)配制烟酸(Nicotinicacid)0.1g维生素Bl(ThiamineHC1)0.1g7200910061607.X说明书第6/17页维生素B6(PyridoxineHC1)0.1g甘氨酸(Glycine)0.2g肌醇(Inositol)10g加水定容至1000ral，4'C保存备用。5)MS培养基大量元素母液(IOX)的配制硝酸铵(NH4N03)16.5g硝酸钾19.0g磷酸二氢钾1.7g硫酸镁3.7g氯化钙4.4g室温下溶解并定容至1000ml。6)MS培养基微量元素母液(IOOX)的配制碘化钾0.083g硼酸0.62g硫酸锰0.86g钼酸钠(Na2Mo042H20)0.025g硫酸铜(CuS045H20)0.0025g室温下溶解并定容至IOOOml。7)2,4-D贮存液，6-BA贮存液，萘乙酸(NAA)贮存液，吲哚乙酸(IM)贮存液l均为mg/ml。8)葡萄糖贮存液0.5g/ml。9)AS贮存液的配制秤取AS0.392g,DMSO10ml。(3)用于水稻遗传转化的培养基配方1)诱导培养基N6醒母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA)C存液(100X)10ml维生素贮存液(ioox)10ml2，4-D贮存液2.5ml脯氨酸(Proline)0.3gCH0.6g蔗糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml,分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。2)继代培养基N6max母液(10X)N6mix母液(100X)Fe2+EDTAJt存液(100X)维生素贮存液(100X)2,4-D贮存液脯氨酸CH蔗糖Phytsgel100ml10ml10ml10ml2.0ml0.5g0.6g30g3g加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9,煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。3)预培养基N6薩母液(IOX)N6mix母液(100X)Fe"EDTA贮存液(100X)维生素贮存液(100X)2,4-D贮存液CH蔗糖琼脂粉(Agarose)12.5ml1.25ml2.5nil2.5ml0.75ml0.15g5g1.75g加蒸馏水至250ral，IN氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。4)共培养基N6max母液(10X)N6mix母液(100X)Fe"EDTApt存液(100X)维生素贮存液(100X)2,4-D贮存液CH蔗糖琼脂粉12.5ml1.25ral2.5ml2.5ml0.75ml0.2g5g1.75g加蒸馏水至250inl，IN氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250WAS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。5)悬浮培养基N6max母液(10X)N6mix母液(100X)Fe"EDTAIC存液(100X)维生素贮存液(100X)2,4-D贮存液CH蔗糖加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4,萄糖贮存液和IOOWASjt存液。6)选择培养基N6max母液(10X)N6mix母液(100X)Fe2+EDTAfc存液(100D维生素贮存液(100X)2，4-DIC存液CH蔗糖琼脂粉加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。7)预分化培养基N6max母液(10X)N6raix母液(100X)Fe2+EDTAjC存液(100X)维生素贮存液(100X)6-BA!t存液KT贮存液NM!t存液IM贮存液CH5ml0.5ml0.5ml1ml0.2ml0.08g2g分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入lml葡25ml2.5ml2.5ml2.5ml0.625ml0.15g7.5g1.75g封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250WHN和400ppniCN，25ml2.5ral2.5ml2.5ml0.5ml0.5ml50W50Pi0.15g7.5g琼脂粉1.75g加蒸馏水至250ml,1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250WHN和200ppmCN,分装倒入培养皿中(25ml/皿)。8)分化培养基100ml10ml10ml10ml2ml2ml0.2ml0.2ml1g30g3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并定容至IOOOml,分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。N6咖x母液(10X)N6mix母液(薩)Fe2+EDTA於存液(100X)维生素lt存液(100X)6-BA贮存液KTft存液NAA贮存液IM贮存液CH蔗糖Phytsgel9)生根培养基MSmax母液(10X)MSmix母液(腿)Fe"EDTAfc存液(100X)维生素贮存液(100X)蔗糖Phytagel50ml5ml5ml5ml30g3g加蒸馏水至900ffll，IN氢氧化钾调节pf!值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。实施例3:检测水稻内源te舰4Z基因的表达水平以水稻品种"珍汕97"(&7za紹"raL.ssp.Indica，中国公开推广的水稻品种)为材料，提取以下IO个不同生长时期的不同组织的RM用Rea-timePCR检测fls/lS^基因的表达水平。选取的10个组织分别是1.愈伤组织；2.种子；3.发芽3天的幼苗；4.三叶期的叶片和根；5.剑叶；6.茎；7.短于5cm的幼穗；8.抽出的穗；9.颖壳；10.胚乳。总RNA采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶SSII(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA(方11法根据Invitrogen公司反转录酶试剂说明书)，反应条件为65°C5min，42°C120min，70°C10min。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物(5'-GCACMMTCTCCCTCTATCCCT-3'和5，-CACCCTTTCATGACCCCG-3')对ttaW必基因进行特异的PCR扩增(扩增产物长73bp)。同时用引物(AF:5，-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3'和AR:5'-TGCACMTGGATGGGTCAGA-3')对水稻Actinl基因做特异扩增(扩增产物长76bp)，以作为内对照进行定量分析。反应条件为95。C5min;95°C10sec,60°C5sec,72°C34sec,40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。结果表明OsNHAD基因在所选取的组织中均有一定量的表达，但在叶片和胚乳中的表达量相对较高(见图3)。我们选用籼稻品种"珍汕97"做为表达谱分析的材料。种子催芽后，在正常生长条件下培养18-20天，至四叶期时进行各种逆境和激素的处理。干旱处理是将幼苗直接从水培液(参考文献？？)中取出暴露于空气中，分别在胁迫前、胁迫后1小时、3小时、6小时、12小时、24小时取样；高盐胁迫是将幼苗由水培液移入含有200咖ol/LNaCl的水培液中，分别在胁迫前，胁迫至水稻叶片微巻、半巻、全巻，以及复水后取样；低温胁迫是把水稻幼苗放入4'C人工气候室，分别于胁迫前、胁迫后1小时、6小时、12小时、24小时取样。激素处理是用100iiM脱落酸(ABA)均匀的喷洒水稻植株表面后，分别在胁迫前、胁迫后30分钟、3小时、6小时、12小时、24小时取样。所有的处理和取样过程都是在持续光照的条件下进行的。提取叶片的总RNA(Trizol试剂，购自Invitrogen公司)后，按J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版有关实验操作方法进行RNA转膜，并以OsNHAD为探针做Northern杂交。结果表明，Os細Z基因在高盐、低温和旭A处理中有非常强的诱导上升表达，在干旱胁迫中也有轻微地上升表达(见图4)。实施例4:OsNHAD基因超量表达转基因Tl代家系在逆境条件下的生长状况本实施例选取了5个OsNHAD基因超量表达Tl家系进行了高盐胁迫实验。具体步骤如下将超量表达转基因家系水稻种子去壳消毒(75%酒精处理3min，0.15%氯化汞处理30min，无菌水清洗数次)，在含有50mg/L潮霉素的1/2MS基本培养基上发芽，将野生型水稻对照家系晚一天播于不含潮霉素的1/2MS基本培养基上，2-3天后挑选发芽好且长势一致的种子转移到含有0咖ol/L和150mmol/L的NaCl的1/2MS基本培养基上，在光照培养室(模仿自然生长条件，光照14个小时，黑暗10个小时)生长10夭后观察表型和测量植株的株高。每个家系的每种处理株数不少于30棵植株，实验设置3次重复。结果表明本发明克隆的^yVK必基因超量表达的转基因植株的生长在正常条件下与对照没有明显的差别，但在逆境胁迫处理后其生长要显著(t测验尸<0.01)优于对照，说明ttyiK4Z基因的表达可以缓解逆境条件造成的植株生长受阻，增强转基因水稻植物对非生物逆境的抗性(图5)。尽管OsAK^基因也受低温和干旱逆境的诱导表达，但在本实施例中的Os鹏4Z基因5个超量表达的转基因T,代家系对低温和千旱逆境的耐受性没有显著地提高，这可能因为fta^K4Z编码的是一个Na7H+反向运输蛋白从而特异性参与对高盐胁迫的耐受性。<110>华中农业大学〈120〉利用水稻基因OsNHAD提高植物的耐盐性<130><141>2009-04-13<勝2<170>Patentlnversion3.1〈210>1<211>3252<212>■<213〉7jC稻(Oryzasativa)<220><221>gene〈222>(1).(3252)<223〉〈220〉<221〉CDS〈222〉(60)..(1649)<223><400>1ggcactctcactcacacggagagagagagagagagagactagactagtagtaccaatta59atggcggcgetctcctcctgcttaetcgccgccgtccgacctcatcct107MetAlaAlaLeuSerSerCysLeuLeuAlaAlaValArgProHisPro151015ccacctccacctcgaccgetctccccttccttcateccctctgccetc155ProProProProArgProLeuSerProSerPhelieProSerAlaLeu202530cgccaccgccaccgcetcagecaagcgccgcccetcgccacctctetc203ArgHisArgHisArgLeuSerGinAlaProProLeuAlaThrSerLeu35404513<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>actcgaaatcca卿actcttetctgggtgatagggtttgtaactttc779ThrArgAsnProArgThrLeuLeuTrpVallieGlyPheValThrPhe225230235240ttcttgagttctatecttgacaatttgacttecactattgtgatggtt827PheLeuSerSerlieLeuAspAsnLeuThrSerThrlieValMetVal245250255teattgctteggaaaetagtacctccateagagtacagaaaattgtta875SerLeuLeuArgLysLeuValProProSerG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aVal430TyrLeuAspAla445GlyValAlaSerGlyLysTyrThrLeulie515Asn500GinAsnPheVal470GlyLysGlyGlylie柳ThrMetGlyMetAla475LeuLeuValPheTyrSerAsnAsnArgMetLeu520Phe490LysTrpSerCysAsn505GinAsnLysLysPro495ThrCys480GinThrLeu525Gly510lieArgCysGly权利要求1、一种能够提高盐胁迫耐受能力的OsNHAD基因在水稻耐盐性遗传改良中的应用，其特征在于，该基因是下列核苷酸序列之一1)序列表SEQNO1中第60-1649位所示的DNA序列；或2)编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。全文摘要本发明涉及水稻基因工程
技术领域：
。分离、克隆和通过功能验证得到一种能够提高盐胁迫耐受能力的水稻OsNHAD基因在水稻耐盐性遗传改良中的应用，所述的基因是下列核苷酸序列之一序列表SEQNO1中第60-1649位所示的核苷酸序列；或编码与1)编码的蛋白质相同的蛋白质的核苷酸序列。将含OsNHAD基因的核苷酸序列与外源启动子连接后转入水稻，转基因水稻的耐盐性得到显著提高。文档编号C12N15/82GK101538573SQ20091006160公开日2009年9月23日申请日期2009年4月16日优先权日2009年4月16日发明者昕侯,戚珠云,熊立仲申请人:华中农业大学