高耐酸植物乳杆菌zdy2013的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，公开一种新型的耐酸性很好的植物乳杆菌。
【背景技术】
[0002] 植物乳杆菌是一种革兰氏阳性菌，最适生长溫度为30-35 °C，兼性厌氧。菌体呈短 杆状，不产芽抱，在MRS琼脂平板培养基中呈乳白色不透明，圆形，光滑的菌落。植物乳杆菌 为同型发酵乳酸菌，能利用葡萄糖、麦芽糖、薦糖等，在发酵过程中只产生乳酸，是典型的兼 性厌氧菌，有很强的的发酵碳水化合物的能力，较耐盐。植物乳杆菌与人类的生活密切相 关，被广泛用于乳制品、肉类、蔬菜W及果汁中，能通过胃肠道并定植于肠道发挥益生作用。 植物乳杆菌已被广泛应用于食品发酵、乳酸发酵和医疗保健。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种性能优良的植物乳杆菌。
[0004] 本发明从传统发酵酸豆角中分离出植物乳杆菌，具有良好的益生性能，极高的耐 酸耐胆盐性，耐胃肠液，抑菌性和抗药性；并且能调节肠道菌群，降低肠道中的条件致病菌， 提高乳杆菌和双歧杆菌的比例，促进肠道健康，发挥益生菌的优良性能。
[0005] 本发明耐酸植物乳杆菌ZDY2013(LactobacillusplantarumZDY2013)，于 2014 年4月28日保藏在中国典型培养物保藏中屯、（中国武汉武汉大学），编号：CCTCCN0:M 2014170ο
[0006] 本发明耐酸植物乳杆菌ZDY2013可W在MRS琼脂平板培养基上生长，为革兰氏阳 性杆菌，属于兼性厌氧生长，不产芽抱。为维持时间稳定地保存本发明植物乳杆菌的优良性 能，将其保存在含有15%甘油的混合保存液中，于-80°C冻存，或将其保存在10%的脱脂乳 中进行冻干保存。
[0007] 为了对微生物进行鉴定和分类，对本发明所述植物乳杆菌ZDY2013进行了 16S rDNA序列分析，结果为，与植物乳杆菌N3114显示出最高的同源性（99% )，显示出与植物乳 杆菌最高的分子系统学上的亲缘关系。因此，将此微生物鉴定为植物乳杆菌，并命名为植物 乳杆菌ZDY2013。于2014年4月28日保存于武汉市中国典型培养物保藏中屯、，保藏编号为 CCTCCN0:M2014170。植物乳杆菌ZDY2013的16SrDNA测序结果显示的碱基序列如本说 明附件中的碱基序列表所示。
[0008] 本发明的植物乳杆菌ZDY2013作为益生菌，不仅极耐酸耐盐，且具有抑菌性，能调 节肠道微生态，促进宿主健康。是一株性能优良的菌种。因此具有很高的研究价值和应用 价值。
[0009] 有益效果：本发明植物乳杆菌相比常规植物乳杆菌具有很高的耐酸耐胆盐能力， 对胃肠液的耐受能力，W及对肠道上皮细胞优异的粘附力，还具有调理肠道微生态的作用。 本发明所述植物乳杆菌对抗生素具有一定的耐受性，其生长代谢过程中所产生的的有机 酸，过氧化氨和生物素能抑制肠道致病菌的生长。从另一个侧面来说，本发明所述植物乳杆 菌可用于制作治疗和预防肠道疾病的组合物，还可w用于食品和饲料的防腐。
【附图说明】
[0010] 图1植物乳杆菌典型株ATCC8014和植物乳杆菌ZDY2013的生长曲线
[0011] 图2植物乳杆菌典型株ATCC8014和植物乳杆菌ZDY2013的耐酸性
[0012]图3植物乳杆菌ZDY2013体外模拟胃肠道转运后的存活率
[0013] 图4植物乳杆菌ZDY2013发酵上清液对致病菌的抑菌圈直径
【具体实施方式】
[0014]W下结合实例来进一步解释本发明，但实施例仅用于说明本发明，而本发明的应 用范围不能W任何方式由运些实施例所限制。
[0015] 实施例1 :植物乳杆菌ZDY2013的分离与鉴定
[0016] 从福建省永安市乡镇收集农户自家天然发酵的酸豆角样品，并及时将样品带回实 验室进行乳酸菌分离。将酸豆角发酵液W10 1的梯度稀释，涂布于MRS(加漠甲酪紫作为指 示剂）琼脂平板上，厌氧培养2地，挑取使培养基变黄的单菌落，在平板上划线分离，反复进 行纯化培养，用革兰氏染色法观察菌落形态选出革兰氏阳性菌。将分离得到的菌株液体培 养后，用PH计检测培养24h时抑值，筛选出产酸能力强的菌株。用接种环挑取单一的菌落 作为模板，进行菌落PCR。将阳性PCR产物送至公司测序，见序列表。
[0017] 将16SrDNA序列与数据库进行比对分析，所分离菌株的碱基序列与植物乳杆菌 N3114具有很高的同源性（99% )，因此被确认为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌ZDY2013， 于2014年4月28日保存于武汉市中国典型培养物保藏中屯、，保藏编号为CCTCCN0:M 2014170。经纯培养24小时后植物乳杆菌ZDY2013的培养上清液抑值为3. 4,能产生大量 有机酸。革兰氏染色结果呈阳性，可观察得出ZDY2013为棒状短杆菌。
[0018] 如图1两条生长曲线所示，与植物乳杆菌典型株LactobaccillusplantarumATCC 8014相比，植物乳杆菌ZDY2013具有更好的生长性能，生长速度更快，生物量更高，更长的 稳定期。
[0019] 实施例2:耐酸性评价
[0020] 将植物乳杆菌的单菌落接种于5mLMRS培养基，37°C厌氧发酵1她，传代两次。W 1%接种量分别接种于抑为6. 5、5. 0、3. 5和2. 0的MRS液体培养基中，测定初始活菌数W 及随后的化，6h，12h和24h的活菌数。
[0021] 实验结果：
[0022] 如图2所示，与植物乳杆菌典型株ATCC8014相对比可W发现，植物乳杆菌 ZDY2013具有更强的耐酸能力，其能在较大的酸性范围（pH3. 5-pH6. 5)内生长，并且在抑 2. 0的MRS培养基中能维持3小时后无明显变化，6小时后活菌数无显著下降。运种长时间 的耐酸性是植物乳杆菌典型株植物乳杆菌ATCC8014所不具有的。同时也说明ZDY2013具 有长时间在胃肠道中存活的能力。其应用在生产加工中时，对加工条件的酸碱性要求更低。
[0023] 实施例3:体外模拟胃肠液转运
[0024] 将植物乳杆菌接种于模拟胃液，抑调为3. 0,解育90min，计数活菌数和存活率， 将培养液离屯、用生理盐水洗一次后加入模拟十二指肠液，解育lOmin，计数活菌数和存活 率，将培养液离屯、用生理盐水洗一次，离屯、加入模拟肠液，解育120min，计数活菌数和存活 率。实验结果： 阳0巧]见图3,结果表明，植物乳杆菌ZDY2013在经胃液，十二指肠液和肠液连续解育后 存活率达到65. 84%，活菌数高于益生菌在胃肠道中定植和发挥益生功能的最低要求溶度 (106c化/血)。综合耐酸性实例和模拟胃肠转运实例，可得出植物乳杆菌ZDY2013具有更好 的耐受性，在低抑和胆汁中能存活，顺利通过胃和十二指肠，保持足够高的活力到达小肠。
[0026] 实施例4:发酵上清液的抑菌能力
[0027] 将植物乳杆菌的单菌落接种于5mLMRS培养基，37°C厌氧发酵1她，传代两次。离 屯、得上清液。将牛津杯置于MRS琼脂平板上，加入200UL发酵上清液。厌氧培养2地，用卡 尺测定其抑菌圈的直径。 阳02引实验结果：如图4所示植物乳杆菌ZDY2013的发酵上清液对八种食源性致病 菌都具有抑制作用。对单增李斯特的抑制效果最明显。抑菌圈直径分别为，单增李斯特 菌（L.mono巧togenes，28. 33 + 0. 76mm)，铜绿假单胞菌化aeruginosa, 21. 83 + 0. 58mm)， 鼠伤寒沙口氏菌仅Typhimurium，19. 17 + 0. 29mm)，阪崎肠杆菌巧.sakazakii， 14. 17 + 0. 20mm)，大肠杆菌巧.coli0157:H7，18. 00 + 0. 50mm)，宋内氏志贺氏菌 仅sonnei，14. 33 + 0. 58mm)，蜡样芽胞杆菌化cereus，17. 83 + 0. 29)，和金黄色葡萄球菌 (S.aureus, 12. 33 + 0. 29mm)。
[0029] 实施例5 :调节胃肠道微生态抑制肠道致病菌。
[0030] 20只小白鼠随机分为两组，实验组和对照组。实验组每天灌胃200UL菌悬液，对照 组等剂量的生理盐水。14天后取结肠和盲肠内容物，W及粪便。用实时巧光定量PCR技术 分析肠道菌群的变化。
[003U 实验结果：巧光定量PCR结果显示（如表1)， W巧表1
[0033]
[0034] 肠道屯大类菌群的定量检测结果（倍数大于1表示数量上升，小于1表示数量下 降）。小鼠在接受完植物乳杆菌ZDY2013连续灌胃14天的处理后，与对照组相比，肠道和粪 便中的微生态发生了明显的改变，主要趋势为有益菌数量上升，条件致病菌数量下降，肠道 健康得到明显的改善。有益菌数量的增加，具有维持肠道内菌群平衡，提高机体免疫力，促 进营养物质吸收等多种功能。
【主权项】
1.耐酸植物乳杆菌ZDY2013,于2014年4月28日保藏在中国典型培养物保藏中心，编 号：CCTCCNO:M2014170。
【专利摘要】本发明公开了一株具有很强耐酸性的植物乳杆菌ZDY2013保藏地点为武汉市中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？NO:M2014170。本发明植物乳杆菌分离于福建省农家自制酸豆角，为革兰氏阳性菌，生长速度快，极耐酸耐胆盐，能在胃肠液中保持较高的存活率，并能抑制食源性致病菌的增长。此外，还能调节肠道菌群多样性，改善宿主胃肠道健康。CCTCC NO:M 201417020140428
【IPC分类】C12R1/25, C12N1/20
【公开号】CN105255752
【申请号】CN201510552202
【发明人】魏华, 黄仁慧, 万翠香, 许恒毅, 徐锋, 陶雪莹, 何丽华
【申请人】南昌大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年9月2日