本发明属于食品
技术领域：
：，涉及植物乳杆菌st菌株及其在酸茶加工的应用。
背景技术：
：：中国是茶的国度，也是茶文化的起源地，对茶的描述最早可以追溯到上古的神农时期，当代的陆羽《茶经》中就有记载：“茶之为饮，发乎神农氏”。饮茶在我国已有几千年的历史，是人们普遍喜爱的日常饮料，目前已与可可、咖啡并称为世界三大无酒精饮料之一。国内外大量研究表明，茶叶中含有茶多酚、生物碱、茶多糖、茶色素等多种活性成分，其中茶多酚具有清除自由基、抗癌、抗突变、杀菌、降血压、抗辐射、防止心血管疾病和糖尿病等多种多种保健功能。儿茶素类化合物为茶多酚的主体成分，占茶多酚总量的65％～80％，主要包括儿茶素(ec)、没食子儿茶素(egc)、儿茶素没食子酸酯(ecg)和没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)4种物质。云南省地处中国西南部，得天独厚的自然条件和悠久的种茶历史，孕育了丰富的茶树种质资源，是世界上茶树的起源中心、原产地。居住在云南各地的少数民族种茶、制茶、爱茶，几乎每个民族都保留着各具特色的饮(吃)茶方式，形成了自己独特的饮食习惯和民间养生保健方法，创造了灿烂的名族文化。德昂族是我国跨境民族之一，长期居住在云南德宏、保山、临沧等地的偏远山区，历史上因交通闭塞、生产力落后、生活水平低等因素，缺医少药，倍受疾病的折磨。德昂族被称为“古老的茶农”，在与疾病的抗争中，德昂族经过长期的生活实践，逐渐孕育出了酸茶等一些具有鲜明民族特色的民间养生保健方法，并延续至今。现如今德昂酸茶制作工艺是在每年5、6月份在高温高湿时节，德昂族采集大叶种茶树鲜叶，经晾晒、冲洗、蒸(煮)茶和揉茶，装入竹筒之中，埋入地下发酵60-70天后，开水冲泡；也可以在发酵后再经压制和干燥制成茶砖，开水冲泡后饮用。从酸茶的加工工艺可以看出，目前酸茶的加工方法还仅仅停留在传统经验上，酸茶产品普遍存在加工周期长、质量不稳定、品质不统一、安全性难以保证等弊端。因此，规范酸茶加工方法，提高酸茶品质，保证质量稳定，让“藏在深闺人不识、微酸微苦味甘甜”的德昂族酸茶被世界认可，具有广阔前景和重要意义。技术实现要素：本发明从自然发酵酸茶中分离得到植物乳杆菌st，将植物乳杆菌st接种到酸茶发酵过程中，可以显著提高酸茶中儿茶素总量，提高酸茶品质，同时可以缩短加工周期，保证产品质量。本发明的技术方案是：植物乳杆菌st，该植物乳杆菌2017年4月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.13911，分类命名为植物乳杆菌st。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。该植物乳杆菌具有抑制主要腐败菌和食源致病菌生长及促进茶多酚生物转化的能力，将植物乳杆菌st接种到酸茶加工过程中，可以缩短加工周期，保证产品质量、提高酸茶品质。应用植物乳杆菌st加工酸茶的方法，其步骤如下：(1)清洗茶树鲜叶，沥干表面水分，将清洗后茶叶进行蒸汽杀青；蒸汽杀青的时间点以茶鲜叶青草气消失，叶色变黄为适度；(2)揉茶后，将茶叶置于玻璃瓶内，压紧；(3)接种植物乳杆菌st冻干菌粉，接种量为茶鲜叶重量0.02％，摇晃混匀；(4)密封玻璃瓶，置于25-37℃环境，发酵15d；(5)沥干发酵后酸茶的表面水分后，加热到75℃，倒入模具，压制成型。本发明与传统发酵相比，可显著缩短酸茶生产周期。增加酸茶中主要儿茶素含量，提高酸茶品质，而且加工过程可控，酸茶产品质量一致。具体实施方式实例1植物乳杆菌st的筛选、鉴定1.植物乳杆菌st的筛选在无菌条件下，称取1g左右的酸茶样品，加入到10ml的pbs中，匀浆5min后，按1％的比例接种到含0.1％维生素c的mrs肉汤培养基中，37℃厌氧培养18h。将富集后的培养液用无菌生理盐水进行梯度稀释，在碳酸钙-mrs固体培养基铺板，37℃厌氧培养24h，从平板中挑取溶钙圈大的单菌落。2.植物乳杆菌st的鉴定将从酸茶中分离得到的乳酸菌疑似菌株，扩大培养后采用甘油方法进行保存。并对疑似菌株进行分子生物学鉴定，具体方法为：(1)提取乳酸菌疑似菌株的基因组；(2)以正向引物f:5’-agagtttgatcctggctcag-3’和反向引物r:5’-tacggctaccttgttacgactt-3’进行16srdnapcr扩增。表1pcr扩增体系table1thepcrsystemforamplificationof16srdnapcr反应条件为预变性(95℃，4min)；变性(94℃，30s)，退火(55℃，30s)，延伸(72℃，1.5min)，30个循环，最后延伸(72℃，10.0min)；对16srdna扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，拍照，记录检测结果；将扩增成功的pcr产物用冰袋保存寄到华大科技公司测序，测得菌株16srdna序列后，在ncbi上使用blast程序比对，与植物乳杆菌同源性大于99％，基于凡是16srdna可变区序列的同源性大于97.5％的便可认为是同一个种的标准，该菌株为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌st。实例2植物乳杆菌st的抑菌特性采用琼脂打孔扩散法，研究植物乳杆菌st对主要腐败菌和食源性致病菌生长繁殖的抑制作用。植物乳杆菌st接种于mrs肉汤培养基中，37℃厌氧培养24h，4℃，5000rpm，离心10min，收集上清液。上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，用氢氧化钠中和至ph6.5。将20μl培养24h的指示菌菌液(大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌和单胞李斯特菌)加入到融化并冷却到45℃的1.2％tsa固体培养基中，剧烈混合后迅速倒入平皿中，待培养基凝固后用牛津杯在培养基上打孔(直径8mm)，吸取90μl植物乳杆菌st培养液上清注入小孔中，鼠李糖乳杆菌gg为参照，灭菌的mrs液体培养基为空白对照，室温下扩散4h后，置于37℃恒温箱中培养24h后，测量抑菌圈直径。植物乳杆菌st对三株肠道致病菌的抗菌活性结果表2所示，植物乳杆菌st能显著抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏、福氏志贺氏菌和单胞李斯特菌的生长，抗菌活性优于参考益生菌菌株鼠李糖乳杆菌gg。表2植物乳杆菌st对肠道致病菌的抑制作用注：-,无抑菌圈；+,抑菌圈直径<3mm；++,抑菌圈直径在3-6mm之间；+++,抑菌圈直径>6mm实例3植物乳杆菌st的茶多酚生物转化能力将晒青毛茶水浸提液中接种植物乳杆菌st，37℃厌氧发酵48小时后，10000g，离心10分钟，收集上清液，0.22μm无菌滤膜过滤，hplc-dad方法检测egc、ec、egcg、ecg的含量。结果如表3所示，与毛茶浸提液相比，植物乳杆菌st发酵酸茶中的主要儿茶素总量提高了28.4％(p<0.05)，egc含量从原先的未检出增加到95.2μg/ml(p<0.05)，ec含量增加了600％(p<0.05)，egcg含量降低了40.8％(p<0.05)，ecg含量降低了39.5％(p<0.05)。结果表明，植物乳杆菌st液态发酵酸茶促进了儿茶素的生物转化，egc和ec含量显著增加。实例4接种植物乳杆菌st生产酸茶实验1采摘茶树鲜叶，用自来水清洗干净，沥干表面水分，经蒸汽杀青和揉茶，表3酸茶植物乳杆菌液态发酵对酸茶中儿茶素含量注：同一行肩标不同表示差异显著(p<0.05)。置于无菌玻璃瓶内，按茶鲜叶重量的0.02％称取植物乳杆菌st冻干菌粉，用少量无菌水混合后，均匀喷洒到茶叶表面，压紧茶鲜叶，不接种植物乳杆菌st组为对照。密封玻璃瓶，37℃发酵15d。沥干发酵后酸茶的表面水分后，加热到75℃，倒入模具，压制成茶砖。采用酒石酸亚铁分光光度法检测茶多酚重量，hplc方法检测儿茶素类含量。检测结果如表4所示，与自然发酵酸茶相比，植物乳杆菌st发酵酸茶中的茶多酚总量无显著变化，儿茶素总量提高了30.8％(p<0.05)，egc含量增加了70％(p<0.05)，ec含量增加了78.8％(p<0.05)，gcg和dl-c含量无显著变化，egcg含量降低了39.8％(p<0.05)，egc含量降低了39.4％(p<0.05)。表4植物乳杆菌st发酵酸茶与自然发酵酸茶茶主要化学成分比较注：同一行肩标不同表示差异显著(p<0.05)。实例5接种植物乳杆菌st生产酸茶实验2采摘茶树鲜叶，用自来水清洗干净，沥干表面水分，经蒸汽杀青和揉茶，置于无菌玻璃瓶内，按茶鲜叶重量的0.02％称取植物乳杆菌st冻干菌粉，用少量无菌水混合后，均匀喷洒到茶叶表面，压紧茶鲜叶，不接种植物乳杆菌st组为对照。密封玻璃瓶，37℃发酵15d。沥干发酵后酸茶的表面水分后，加热到75℃，倒入模具，压制成茶砖。采用酒石酸亚铁分光光度法检测茶多酚重量，hplc方法检测儿茶素类含量。检测结果如表5所示，与自然发酵酸茶相比，植物乳杆菌st发酵酸茶中的茶多酚总量无显著变化，儿茶素总量提高了29.8％(p<0.05)，egc含量增加了72.1％(p<0.05)，ec含量增加了75.8％(p<0.05)，gcg和dl-c含量无显著变化，egcg含量降低了40.9％(p<0.05)，egc含量降低了40.5％(p<0.05)。表5植物乳杆菌st发酵酸茶与自然发酵酸茶茶主要化学成分比较注：同一行肩标不同表示差异显著(p<0.05)。当前第1页12当前第1页12