植物乳杆菌WZMX‑2与应用及其制备的乳清梨酒的制作方法

本发明属于酒类加工技术的技术领域，更具体的，本发明涉及一种微生物菌种混合发酵制备乳清梨酒方法的技术领域。

背景技术：

乳清是用牛乳生产干酪、干酪素过程中所产生的副产品，呈黄绿色、半透明状。乳清的营养价值极其丰富，原料乳中高达55％左右的营养物质留在了乳清中，主要包括粗蛋白约为1％，脂肪0.3～0.4％，乳糖3％～5％，乳清蛋白20％，还含有矿物质、维生素等，其中乳清蛋白分为β-乳球蛋白、α-乳蛋白，其中β-乳球蛋白能够结合钙以及一些疏水性分子如视黄醇、维生素E，起到降血压、抗应激、促进恐惧记忆的消失、降低胆固醇水平的作用；α-乳蛋白可促进乳汁分泌，也具有抗高血压、调节细胞生长、免疫调节、缓解压力的作用，提高认知性能和改善睡眠；乳糖能为机体提供能量，1g乳糖约产能16.75kJ。乳糖作为乳汁中唯一的碳水化合物，是婴幼儿出生后从乳汁中最先获得的能量之一。乳糖能促进肠道内钙、磷和锰等矿物质的吸收，抑制其他有害细菌的繁殖，调整菌群平衡。另外，乳清矿物质处于良好的平衡状态，具有完全的营养功效，能够为人类补充必需的矿物质。因此，乳清被认为是一个极有应用价值的副产品，可应用于食品、医药、饲料、化工等领域。

在我国，目前乳清的开发利用程度很低，乳清中虽然含有多种营养成分，但是其总体干物质含量低，各种成分的分离、提取，特别是矿物质成分的分离提取所需技术复杂、设备昂贵、相对成本高，而对乳清饮品而言，各种品牌的乳饮料在市场上已经形成了一定的销售规模，但乳清类饮品极其罕见。直观而言，乳清中包含了乳糖、乳清蛋白、矿物质和维生素等宝贵的营养成分、乳味浓郁，乳清来源充足，利用乳清可以开发出乳清饮料、乳清酒等多种具有较高附加值的乳清产品，且乳清产品的销售市场应不小于其他乳饮料；但事实上，目前市场上少有乳清饮品，一直处于试销状态而未能产业化生产上市。究其原因，是由于乳清中含有苦味，使加工产品带有明显苦味这一“后苦味”现象。而目前的脱苦技术还未取得突破、还未达到生产实用化。乳清中的脱苦难题已经成为制约乳清加工利用的技术瓶颈，相关的技术研究、积累、突破必将启动乳清加工业的产业化发展，具有十分重要的经济价值和社会意义。

技术实现要素：

针对现有技术现状的不足及存在的问题，为了解决上述问题，本发明提供了植物乳杆菌WZMX-2及其应用的乳清梨酒的制备方法，与现有技术相比，本发明提供的植物乳杆菌WZMX-2及其应用的乳清梨酒的制备方法生产效率高、无添加，有效去除发酵乳清酒苦味，克服了现有技术中利用乳清加工产品带有明显的“后苦味”的技术瓶颈，制备出的乳清梨酒色泽均匀、呈淡黄绿色、澄清透亮、具有乳清与香梨固有的色泽和香气，无苦涩感，口感偏甜，酸度适中，协调性适中，醇香淡雅，口感丰满，具有良好的均衡性。经口给予小鼠进行负重游泳试验，血清尿素测定试验，肝糖原测定试验和血乳酸测定试验，结果显示利用植物乳杆菌WZMX-2制备的乳清梨酒能明显延长小鼠负重游泳的时间，减少运动时血清尿素的生成，增加肝糖原的储备，对小鼠的体重和血乳酸无明显影响，表明利用植物乳杆菌WZMX-2制备的乳清梨酒具有缓解体力疲劳的显著的技术效果。

本发明具体采用如下的技术方案：

本发明选用的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是根据新疆的地理环境的特殊性，通过从新疆南山采集的自制奶酪、库尔勒香梨中取样，筛选出一批生长良好的微生物菌株，从奶酪和香梨中进行微生物菌种的培养、分离与筛选，从中优选出一株编号为WZMX-2的植物乳杆菌，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。保藏日期是2016年08月08日，保藏号是CGMCC No.12832。该菌株的16S rRNA同源分析表明其与Lactobacillus plantarum亲源关系最近，同源相似性为99％，系统发育分析结果都表明保藏号为CGMCC No.12832植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WZMX-2菌株为一株新菌种，利用筛选的该新菌种与外购酿酒酵母菌及已有保藏菌种编号为WWMJ-1，保藏号为CGMCC No.8432的马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)配伍发酵香梨汁和乳清制备无苦味乳清梨酒。

本发明具体提供制备乳清梨酒的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC No.12832。采用的菌种编号为WZMX-2的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，该菌经MRS培养基分离培养，再经改良MRS培养基中会产生溶钙圈进行初步筛选，该菌株在MRS培养基平板上划线培养24h，能形成菌落边缘整齐、表面光滑、乳白色、凸起的圆形，直径0.3mm-5mm的菌落；该菌株培养条件为培养温度37℃，优先生长于MRS培养基表面，MRS培养基的组分为牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸氢二胺2.0g/L，吐温801.0ml/L，磷酸氢二钾2.0g/L，七水硫酸镁0.2g/L，七水硫酸锰0.05g/L，蒸馏水1.0L，固体培养基加琼脂20.0g/L；菌株在固体培养基上菌落直径大小为0.3mm-5mm，正面呈圆形，侧面凸起；边缘整齐、表面光滑；菌落不透明，呈乳白色；具有一定粘稠性，在生理生化及菌种特性方面，编号为具有与采用的菌种编号为WZMX-2的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)与常见的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)具有明显不同的菌种特性。

该植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WZMX-2已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2016年08月08日，保藏号是CGMCC No.12832。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WZMX-2的基因序列如SEQUENCE LISTING。经16S rRNA同源分析该菌与Lactobacillus plantarum亲源关系最近，同源相似性为99％，系统发育分析结果都表明保藏号为CGMCC No.12832菌株WZMX-2为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中的新菌种，是与普通常见的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)具有明显区别特征的新菌种。

同时，本发明具体提供一种无苦味乳清梨酒，具体通过如下提供的制备方法制备获得：

(1)菌种的活化：将4℃下保存的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WZMX-2CGMCC No.12832在无菌环境下接种于MRS培养基，置于37℃培养24h；将4℃下保存的马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)WWMJ-1CGMCC No.8432和常见的酿酒酵母菌在无菌环境下分别接种于YPD培养基中活化，均置于28℃培养24h，恒温保藏备用。

(2)香梨预处理:选新鲜库尔勒香梨去柄洗净，用自动榨汁机榨汁后过滤，获得香梨汁，室温下贮藏备用。

(3)乳清预处理：选用新鲜乳清用四层纱布过滤除去乳清中的杂质和异物后加入6％-14％体积蔗糖的量，混合均与，预热到85℃，在20MPa条件下均质5min；均质后将乳清液进行巴氏杀菌，冷却至室温，无菌保藏备用。

(4)乳清香梨汁混合液的制备：将步骤(2)获得的香梨汁与90％体积步骤(3)获得的乳清按香梨汁占混合液体积40％-60％混合均匀，室温下保存备用。

(5)母发酵液的制备：按体积百分比计，将10％的步骤(3)得到的乳清均分装于发酵容器中，在无菌条件下，将按步骤(1)活化的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WZMX-2CGMCC No.12832、马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)WWMJ-1CGMCC No.8432和常见的酿酒酵母菌按3％接种比例分别接入发酵容器中，培养条件依次分别37℃培养24h、28℃培养24h、28℃培养24h，恒温保藏备用。

(6)发酵：将步骤(5)制备的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WZMX-2CGMCC No.12832、马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)WWMJ-1和酿酒酵母菌发酵液按照体积比4:4:2计混合均匀后，加入步骤(4)制备的剩余90％的乳清香梨汁混合液中，在25℃-37℃下培养24h-72h，发酵终点设定为：测定酒精度达到7.8％vol，测定总酸达到60.84°T，测定总糖含量达到42.34g/L，测定苦味肽含量达到0.15g/100mL。

(7)后处理：待产品至发酵终点后，闪蒸杀菌，冷却后进行无菌灌装制备获得无苦味乳清梨酒。

本发明选用自筛菌种：马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)WWMJ-1，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2013年11月05日，保藏号是CGMCC No.8432，采用该菌种的培养条件为培养温度28℃，优先生长于YPD培养基表面，YPD培养基组分采用酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，固体培养基加入20g/L琼脂粉。同时，本发明提供菌株马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)WWMJ-1的发酵工艺：在无菌条件下，挑取该菌株，28℃下培养24h。

酿酒酵母菌选用外购常见酿酒酵母，选用外购酿酒酵母菌培养条件和发酵条件都采用公知常识。

本发明中，酒精度测定采用蒸馏得到酒精水溶液后用酒精计测定；酸度测定采用酸碱滴定法测定；糖度测定使用手持糖度计测定：苦味肽测定使用氯仿-甲醇萃取法测定。

本发明通过上述技术方案制备一种乳清梨酒，其产品质量特征如下：

(1)感官指标：色泽呈淡黄绿色，微黄具有乳清固有的色泽；香气：乳香味伴随着淡淡的水果香气，滋味：酒体优雅、酸甜爽口、无异味；体态：澄清透亮允许少许沉淀。

(2)理化指标：总酸：60.84°T，总糖含量：42.34g/L。

(3)微生物指标：菌落总数(cfu/mL)≤100；大肠菌群(MPN/100mL)≤3；致病菌：未检出。

使用本发明提供的技术方案可以达到如下有益效果：

(1)使用本发明技术方案，有效去除发酵乳清酒苦味，克服了现有技术中利用乳清加工产品带有明显的“后苦味”的技术瓶颈，制备的乳清梨酒色泽均匀、呈淡黄绿色、澄清透亮、具有乳清与香梨固有的色泽和香气，无苦涩感，口感偏甜，酸度适中，协调性适中，醇香淡雅，口感丰满，具有良好的均衡性。

(2)本发明制备的乳清梨酒经口给予小鼠进行负重游泳试验，血清尿素测定试验，肝糖原测定试验和血乳酸测定试验，结果显示乳清梨酒能明显延长小鼠负重游泳的时间，减少运动时血清尿素的生成，增加肝糖原的储备，对小鼠的体重和血乳酸无明显影响，表明利用本发明筛选的新菌种与外购酿酒酵母菌及已有保藏菌种马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)WWMJ-1CGMCC No.8432配伍发酵香梨汁和乳清，利用提供的完整去除苦味和利用乳清、香梨汁混合发酵工艺制备的无苦味乳清梨酒具有缓解体力疲劳的功能性作用，获得显著的技术效果。

附图说明：

图1显示为本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WZMX-2CGMCC No.12832的菌落形态图。

图2显示为本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WZMX-2CGMCC No.12832的系统进化发育树图。

图3显示为本发明提供的乳清梨酒制备方法的工艺流程图。

图4显示为本发明提供的不同接种比例对乳清梨酒发酵的影响，图中，接种比例是指植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WZMX-2CGMCC No.12832、马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)WWMJ-1CGMCC No.8432和酿酒酵母菌的体积比。

图5显示为本发明提供的不同发酵温度对乳清梨酒发酵的影响。

图6显示为本发明提供的不同发酵时间为对乳清梨酒发酵的影响。

图7显示为本发明提供的不同蔗糖添加量对乳清梨酒发酵的影响。

图8显示为本发明提供的接种比例与发酵时间相互作用对酒精发酵影响的响应面图。

图9显示为本发明提供的接种比例与发酵时间相互作用对酒精发酵影响的等高线图。

图10显示为本发明提供的接种比例与发酵温度相互作用对酒精发酵影响的响应面图。

图11显示为本发明提供的接种比例与发酵温度相互作用对酒精发酵影响的等高线图。

图12显示为本发明提供的发酵温度与发酵时间相互作用对酒精发酵影响的响应面图。

图13显示为本发明提供的发酵温度与发酵时间相互作用对酒精发酵影响的等高线图。

图14显示为本发明提供的接种比例与发酵时间交互影响苦味肽的曲面图。

图15显示为本发明提供的接种比例与发酵时间交互影响苦味肽的等高线图。

图16显示为本发明提供的发酵温度和接种比例交互影响苦味肽的曲面图。

图17显示为本发明提供的发酵温度和接种比例交互影响苦味肽的等高线图。

图18显示为本发明提供的发酵时间和发酵温度交互影响苦味肽的曲面图。

图19显示为本发明提供的发酵时间和发酵温度交互影响苦味肽的高线图。

具体实施方式

下面结合附图1-19和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述，但本发明不限于下述实施例。

本发明采用的马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)WWMJ-1 CGMCC No.8432、酿酒酵母菌均可通过公共渠道购买；采用的主要的仪器设备：LD2X-50KB立式电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器厂)；HR40-ⅡA2生物安全柜(青岛海尔特种电器有限公司)；DHP-781电热恒温培养箱(河北省黄石市医疗器械厂)；DZKW-172电热恒温水浴锅(北京市光明医疗仪器厂)；CH1776J微电脑电磁炉(中山市格兰仕生活电器制造有限公司)；SXKW数显控温电热套(北京市永光明医疗仪器厂)；EYELA水浴锅(上海爱朗仪器有限公司)；旋转蒸发仪(德国IKA，8V-C)。

本发明选用的所有原辅材料，设备，以及选用的菌种培养基、培养方法都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些材料和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。

实施例一：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WZMX-2CGMCC No.12832的筛选、分离纯化和鉴定

(1)筛选：据新疆的地理环境的特殊性，通过从新疆南山采集的自制奶酪、库尔勒香梨中取样，筛选出一批生长良好的微生物菌株，取奶酪与香梨各25g，放入225mL盐水中，在旋涡混合器上充分混合均匀，取1mL放入装有9mL无菌生理盐水的试管中。以10倍级进行稀释，稀释度为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6。用移液器吸取上述稀释度样液各1mL，采用倾注法倒入改良MRS培养基，平板置于37℃培养箱中培养24h。观察并记录菌落特征并挑取有透明圈的不同形态单个菌落，进行革兰氏染色，挑取革兰氏染色阳性菌落，在显微镜油镜下观察细胞形态，并对疑似的菌种进行编号。

(2)纯化:将疑似产透明圈的菌株再接种于MRS琼脂培养基，于37℃培养箱恒温培养24h，重复3～4次纯化乳酸菌。纯化后的乳酸菌菌株接种于改良MRS斜面，37℃培养箱恒温培养24h后，4℃保存备用。

该菌株培养条件：培养温度37℃；优先生长于MRS培养基表面，MRS培养基组分牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸氢二胺2.0g/L，吐温801.0ml/L，磷酸氢二钾2.0g/L，七水硫酸镁0.2g/L，七水硫酸锰0.05g/L，蒸馏水1L，固体培养基加琼脂20.0g/L。菌落形态特征：菌株在固体培养基上菌落直径大小为0.5mm-3mm，正面呈圆形，侧面凸起；边缘整齐、表面光滑；菌落不透明，呈乳白色；具有一定粘稠性。

(3)鉴定：

生理生化鉴定：该细菌经MRS培养基分离培养，再经改良MRS培养基中会产生溶钙圈进行初步筛选，将其初步界定乳酸菌菌株；该菌株在MRS培养基平板上划线培养24h，能形成菌落边缘整齐、表面光滑乳白色凸起的圆形,直径0.5mm-3mm的菌落，见附图1。进行革兰氏染色，染色鉴定结果为革兰氏阳性杆状细菌。该细菌在过氧化氢酶试验中呈阴性、接触酶呈阴性，不能够还原硝酸盐、不液化明胶、不产生吲哚和H₂S、不运动，不发酵鼠李糖，能够在15℃生长，鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，且采用的菌种编号为WZMX-2的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)与常见的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)具有明显不同的菌种特性。

16S rDNA序列比对及系统发育分析：将测序得到的16S rDNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行BLAST分析，从中获取相近的16S rDNA序列，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WZMX-2的基因序列如SEQUENCE LISTING。用MEGA 6.0中Maximum Likelihood法构建系统进化树，结果参见附图2。菌株WZMX-2的菌株隶属于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，与Lactobacillus plantarum亲源关系最近，同源相似性为99％，确定菌株WZMX-2为植物乳杆菌，分子水平系统发育分析结果都表明保藏号为CGMCC No.12832的菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus casei)中的新菌种，是与普通常见的植物乳杆菌(Lactobacillus casei)具有明显区别特征的新菌种。结合上述提供的菌种编号为WZMX-2的菌落形态、生理生化特性和分子水平鉴定分类，综合的在生物学分类名称建议为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2016年08月08日，保藏号是CGMCC No.12832。

实施例二：乳清梨酒的制备工艺

本发明具体提供一种无苦味乳清梨酒，具体通过如下提供的制备方法制备获得：

(1)菌种的活化：将4℃下保存的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WZMX-2CGMCC No.12832在无菌环境下接种于MRS培养基，置于37℃培养24h；将4℃下保存的马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)WWMJ-1CGMCC No.8432和常见的酿酒酵母菌在无菌环境下分别接种于YPD培养基中活化，均置于28℃培养24h，恒温保藏备用。

(2)香梨预处理:选新鲜库尔勒香梨去柄洗净，用自动榨汁机榨汁后过滤，获得香梨汁，室温下贮藏备用。

(3)乳清预处理：选用新鲜乳清用四层纱布过滤除去乳清中的杂质和异物后加入6％-14％体积蔗糖的量，混合均与，预热到85℃，在20MPa条件下均质5min；均质后将乳清液进行巴氏杀菌，冷却至室温，无菌保藏备用。

(4)乳清香梨汁混合液的制备：将步骤(2)获得的香梨汁与90％体积步骤(3)获得的乳清按香梨汁占混合液体积40％-60％混合均匀，室温下保存备用。

(5)母发酵液的制备：按体积百分比计，将10％的步骤(3)得到的乳清均分装于发酵容器中，在无菌条件下，将按步骤(1)活化的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WZMX-2CGMCC No.12832、马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)WWMJ-1CGMCC No.8432和常见的酿酒酵母菌按3％接种比例分别接入发酵容器中，培养条件依次分别37℃培养24h、28℃培养24h、28℃培养24h，恒温保藏备用。

(6)发酵：将步骤(5)制备的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WZMX-2CGMCC No.12832、马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)WWMJ-1和酿酒酵母菌发酵液按照体积比4:4:2计混合均匀后，加入步骤(4)制备的剩余90％的乳清香梨汁混合液中，在25℃-37℃下培养24h-72h，发酵终点设定为：测定酒精度达到7.8％vol，测定总酸达到60.84°T，测定总糖含量达到42.34g/L，测定苦味肽含量达到0.15g/100mL。

(7)后处理：待产品至发酵终点后，闪蒸杀菌，冷却后进行无菌灌装制备获得无苦味乳清梨酒。

本发明选用自筛菌种：马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)WWMJ-1CGMCC No.8432，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2013年11月05日，保藏号是CGMCC No.8432，采用该菌种的培养条件为培养温度28℃，优先生长于YPD培养基表面，YPD培养基组分采用酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，固体培养基加入20g/L琼脂粉。同时，本发明提供菌株马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)WWMJ-1CGMCC No.8432的发酵工艺：在无菌条件下，挑取该菌株，28℃下培养24h。

本发明外购酿酒酵母菌，选用外购酿酒酵母菌培养条件和发酵条件都采用公知领域提供，菌株选用活性强，耐酸性强，产酒精能力强，发酵周期短。

本发明中，酒精度测定采用蒸馏得到酒精水溶液后用酒精计测定；酸度测定采用酸碱滴定法测定；糖度测定使用手持糖度计测定：苦味肽测定使用氯仿-甲醇萃取法测定。

复合菌种混合发酵制备乳清香梨酒的工艺流程图如附图3所示。

实施例三：乳清梨酒的发酵工艺中发酵条件单因素试验

分别选取接种比例(植物乳杆菌WZMX-2/％：马克思克鲁维酵母菌/％：酿酒酵母菌/％)为6:6:1、5:5:1.5、4:4:2、3:3:2.5、2:2:3，培养发酵温度为25℃、28℃、31℃、34℃、37℃，发酵时间为24h、48h、72h、96h、120h、144h，糖添加量为6％、8％、10％、12％、14％；进行单因素发酵试验，通过测定酒精度、苦味肽、酸度、糖度，进行单因素考察。

(1)不同接种比例对发酵的影响

由附图4可知，当酵母菌种所占的比例较多时，发酵液的酒精含量较高。当接种比例(植物乳杆菌WZMX-2/％：马克思克鲁维酵母菌/％：酿酒酵母菌/％)比例为4:4:2，发酵液的酒精含量最高为7.5％vol，糖度与酸度均较低，说明大量的糖与酸都转化成了酒精，而苦味肽含量0.12g/mL。综合考虑，为保证乳清梨酒的口感，因此选择接菌比例(植物乳杆菌WZMX-2/％：马克思克鲁维酵母菌/％：酿酒酵母菌/％)比例4:4:2最为恰当。

(2)不同发酵温度对发酵的影响

根据附图5可以看出，发酵液的总糖随着发酵温度的升高逐渐降低，而酸度逐渐升高，当温度为31℃时，发酵液酒精含量达到最高为7.7％vol，苦味肽在28℃与31℃时，含量达到较低值，但当温度过高超过31℃时，酒精度有所下降，苦味肽逐渐升高，温度过使菌种的繁殖和代谢能力反而下降，酒精的积累逐渐减少，综合发酵风味及口感，因此选择31℃为最为最佳发酵温度。

(3)不同发酵时间对发酵的影响

由附图6可知，随着发酵时间的延长，酵母菌得到了充分的生长，酒精度与总酸逐渐升高。在24h-72h时发酵液的酒精含量逐渐升高，苦味肽含量与总糖逐渐降低，发酵时间为72h时为拐点，发酵液中苦味肽含量达到最低为0.72g/100mL，酒精度达到最高值为6.5％vol，说明发酵菌种生长旺盛，能够充分利用碳源，将其转化为酒精，当发酵时间在72h-120h时，其苦味肽、总酸逐渐升高，发酵液的酒精积累量明显降低，综合考虑，选择发酵时间为72h最佳。

(4)不同糖添加量对发酵的影响

在发酵过程中，糖添加量为酵母菌和乳酸菌提供了碳源，充足的碳源增强了菌株的发酵能力。由附图7可知，总糖与酒精含量随着糖添加量的升高而升高，糖添加量在8％-10％之间时，酒精度积累量逐渐增加，苦味肽含量达到最小值为0.36g/100mL，但当加糖量超过10％时，酒精含量趋于平稳，苦味肽有所增高，菌种发酵能力平缓并有下降的趋势，可能是因为添加蔗糖含量过高，乳清梨汁发酵液中的糖浓度过高，抑制了酵母菌和乳酸菌的发酵，从而使得酒精度下降，糖度较高的原因。因此，综合以上原因选择加糖量为10％最为恰当。

实施例四：乳清梨酒的制备发酵工艺的优化

在实施例三提供的单因素试验结果基础上，根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理分别对影响发酵苦味肽含量(Z)和酒精度(Y)的三个因素：发酵时间(A)、发酵温度(B)、接种比例(植物乳杆菌WZMX-2/％：马克思克鲁维酵母菌/％：酿酒酵母菌/％)(C)，利用响应面软件Design-Expert 8.05软件，根据Box-Behnken实验组合设计进行三因素三水平实验。响应面试验的因素和水平编码值如表1。

表1响应面试验的因素和水平编码值

发酵响应面优化分析：综合单因素试验结果，采用Box-Behnken响应面分析法对其进行优化。响应面试验设计及响应值结果见表2。

表2响应面试验及响应值

按照表2试验数据进行多元回归方程拟合，可建立以发酵液酒精度(Y)及苦味肽(Z)分别对发酵时间(A)、发酵温度(B)、接种比例(C)的拟合方程为：

Y＝7.74+0.62A+0.46B+0.47C-0.410AB-0.087AC-0.41BC-1.08A²-0.7B²-0.68C²

Z＝0.14-9.732E-003A+0.06B+0.037C-0.12AB+0.043AC-0.039BC+0.12A²+0.1B²+0.12C²

表3酒精度响应面试验结果及方差分析

注：表3及表4中，“*”表示显著(0.01<p<0.05)；“**”表示极显著(p<0.01)。

表4苦味肽响应面试验结果及方差分析

回归方程中各变量对指标(响应值)影响的显著性,由F检验来判定,概率P的值越小,则相应变量的显著程度越高。由表3、表4可知，当模型F值分别为F＝22.94，F＝32.30，P<0.0001，说明模型是极显著的。酒精度与苦味肽的失拟项分别为F＝1.63时，P＝0.3021>0.05，F＝3.85，P＝0.0826>0.05说明模型失拟项不显著。决定系数分别为R²＝0.9538，R²＝0.9667校正系数分别为R²_Adj＝0.9122，R²_Adj＝0.9368表明实测值与预测值之间具有很好的拟合度。由此可以说明模型的建立呈显著性，说明此模型的拟合程度较好，试验操作准确可信，因此可以利用此模型对乳清梨汁发酵过程进行分析和预测。

从表3中可以看出，一次项与二次项均对乳清梨汁发酵的Y值影响表现出极显著水平，交互项AB、BC对乳清梨汁发酵Y值的影响表现为显著水平，交互项AC对乳清梨酒Y值的影响不具有显著水平的影响。从表4中可以看出一次项B、C与二次项对乳清梨汁发酵液的Z值影响表现出显著与极显著水平，交互相AB、AC、BC对乳清梨汁发酵液Z值的影响呈现显著水平。

响应面图分析：为了考察各个交互项对发酵液酒精度和苦味肽的影响，在其他因素固定不变的情况下，利用Design-Expert 8.05软件对回归方程进行运算，作出交互项的响应面图。三维响应面图能比较直观的解释各个变量和变量之间对响应值的影响。

由附图8-13可以看出，随着接种比例比例的增大，酒精度呈先上升后下降的趋势，发酵时间对酒精度影响明显，发酵时间与接种比例比例之间的交互作用显著；酒精度随发酵温度及接种比例比例的升高呈先上升后下降的趋势，发酵温度及接种比例比例的交互作用显著；随着发酵温度的升高，酒精度呈先上升后降低的趋势，二者交互作用显著。

由附图14-19可看出，随着接种比例比例的增大，苦味肽呈先下降后上升的趋势，等高线趋近于椭圆形，接种比例对苦味肽影响较大，发酵时间对苦味肽影响明显，发酵时间与接种比例比例之间的交互作用显著；苦味肽随发酵温度及接种比例比例的升高呈先下降后上升的趋势，曲面弧度较陡，发酵温度及接种比例比例的交互作用显著；随着发酵温度的升高，苦味肽呈先降低后上升的趋势，二者交互作用显著。

分别对酒精发酵酒精度取最大值，苦味肽含量取最小值，由软件Design-Expert 8.05自动分析可得到最佳发酵条件理论值为：接种比例(植物乳杆菌WZMX-2/％：马克思克鲁维酵母菌/％：酿酒酵母菌/％)为4:4:2、发酵时间为75.8h、发酵温度为31℃，所测酒精度为7.8％(V/V)，苦味肽含量为0.14g/100mL。考虑实际操作方便，选取接种比例为4:4:2、发酵时间为76h、发酵温度为31℃，进行3次平行试验，酒精度为8％(V/V)、7.9％(V/V)和7.6％(V/V)。苦味肽值为0.13g/100mL、0.15g/100mL、0.17g/100mL，与理论预测值接近，说明方程与实际情况拟合良好，响应面分析所得到的优化模型是可靠的，该数学模型对优化乳清梨酒发酵工艺条件是可行的，具有实用价值。

在单因素试验的基础上，利用响应面软件，进行单因素试验，并利用响应面软件分析，得出酒精发酵最佳发酵条件分别为：接种比例(植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WZMX-2CGMCC No.12832、马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)WWMJ-1CGMCC No.8432和酿酒酵母菌的体积比)为4:4:2，发酵温度为31℃，发酵时间为76h，糖添加量为10％。在此条件下酒精度平均为7.8％vol，苦味肽含量为0.15g/100mL。经验证试验所测得的实际酸度与理论值差异较小，证明两个数学模型对优化乳清梨酒发酵工艺条件可行，为综合利用乳清提供了理论依据。

通过上述系列试验制备的乳清梨酒，有效去除发酵乳清酒苦味，克服了现有技术中利用乳清加工产品带有明显的“后苦味”的技术瓶颈，制备的乳清梨酒作为产品具有典型性如下：

(1)感官指标：色泽：淡黄绿色，微黄具有乳清固有的色泽；香气：乳香味伴随着淡淡的水果香气，滋味：酒体优雅、酸甜爽口、无异味；体态：澄清透亮少许沉淀。

(2)理化指标：总酸：60.84°T，总糖含量42.34g/L。

(3)微生物指标：菌落总数(cfu/mL)≤100；大肠菌群(MPN/100mL)≤3；致病菌：未检出。

实施例五：制备的乳清梨酒的典型性感官评定

1.感官评价标准

由均来自制备果酒领域不同的技术人员20人组成的感官评价小组进行数据采样，对采用实施例二至四提供的技术方案制备的乳清梨酒从口感、色泽、醇香、甜、酸、香气协调性方面进行综合评价，乳清梨酒的感官指标评价标准如表5所示。

表5乳清梨汁发酵酒感官评分表

2.模糊数学评价

按照模糊评判确定评定论域(U)、评语论域(V)、权重向量(A)，并对感官评价结果进行处理，得到模糊评判矩阵，再通过计算综合隶属度，最终得到乳清梨酒感官质量综合评判的结果向量，并进行等级划分。

2.1确定评定论域

评定论域是指最能反映该食品质量的一组指标的集合，记为：U＝{u1,u2,u3,…un}，u表示评价指标。选取口感、色泽、醇香、甜、酸香气协调性作为乳清梨酒的感官评价指标。挑选食品专业10人组成感官评定小组。可以用u1表示口感，u2表示色泽，u3表示醇香，u4表示甜，u5表示酸香气协调性，得到一个关于乳清梨酒的评定论域U＝{u1,u2,u3,u4,u5}。

2.2确定评语论域

根据表5的质量等级评定标准，得到一个关于乳清梨酒的评语论域V＝{v1,v2,v3,v4}。

2.3确定权重向量

根据表1中各项指标的权重值得到与乳清梨酒相关的权重向量为：A＝(0.30,0.10,0.10,0.10,0.10,0.30)。

2.4确定模糊评判矩阵

评定人员对乳清梨酒的评定结果如表6所示。

表6乳清梨酒的感官评定结果

将表6的数据都分别除以品评员总人数20，得到模糊评判矩阵：

3.计算综合隶属度

已知乳清梨酒6个评价指标的权重向量为A＝(0.30,0.10,0.10,0.10,0.10,0.30)，按照标准的模糊综合评判，用普通矩阵乘法取代取大取小算法并依照综合评分公式计算综合评分。乳清梨酒的综合隶属度为Y＝A×R＝(b1,b2,b3…bn)，可得到乳清梨酒感官质量综合评判的结果向量：

其中:

y1＝0.3×15/20+0.10×13/20+0.10×14/20+0.10×16/20+0.10×13/20+0.30×15/20＝0.73.

y2＝0.3×3/20+0.10×5/20+0.10×3/20+0.10×3/20+0.10×4/20+0.30×4/20＝0.18.；

y3＝0.3×2/20+0.10×2/20+0.10×3/20+0.10×1/20+0.10×2/20+0.30×1/20＝0.085.；

y4＝0.3×0+0.10×0+0.10×0+0.10×0+0.10×1/20+0.30×0＝0.005。

即：Y1＝(0.73,0.18,0.085,0.005)

根据综合评分公式：计算综合评分：

H₁＝1×0.73+2×0.18+3×0.085+4×0.005＝1.335；

乳清梨酒的综合评分在1和2之间接近于1，说明乳清梨酒品质在很好和好之间偏向于很好。

综合模糊数学感官评定可知，乳清梨酒品质在很好，运用混合菌种酿制的乳清梨酒品质特点为：酸度低，总糖在国标要求范围内，而酒度比单纯商业酵母高，具有乳清梨汁酒样品的典型特征淡黄绿色，色泽明亮，具有突出的乳清与梨汁果香味，无苦涩感，口感偏甜，酸度适中，协调性适中，醇香淡雅，口感丰满，具有良好的均衡性。综上，本申请所选用的混合菌种适合于发酵无苦味的乳清梨酒的发酵菌株,本申请提供的一种复合菌种混合发酵制备无苦味乳清梨酒的方法有效降低了乳清梨酒苦味肽含量，同时在提升乳清梨酒的口感与风味方面做出了突出贡献。

实施例六：制备的乳清梨酒功能性试验

选取KM小鼠随机分为4个大组，每大组再分为5小组，每组10只。按低、中、高剂量，即各组小鼠每日采用上述实施例提供的乳清梨酒食用量分别为8.4mL/kg.bw、16.7mL/kg.bw、50.1mL/kg.bw。由于灌胃量较大，不符合小鼠的灌胃要求，所以用样品20倍浓缩液，经换算稀释8倍后作为高剂量灌胃样品液，用高剂量组灌胃样品液处理后酒基配制成低、中剂量组所用灌胃样品液，灌胃体积均按20mL/kg.bw计。将酒精度为48％(V/V)的酒基处理为8％(V/V)，酒基对照组灌胃等体积8％(V/V)酒基，空白对照组灌胃等体积去离子水。每日灌胃一次，连续30d。

分别对各组实验小鼠进行小鼠负重游泳实验、小鼠血清尿素实验、小鼠肝糖原实验和血乳酸实验，测定相关实验参数。

表7：乳清梨酒对负重游泳实验小鼠体重和游泳时间的影响

由表7可见，在负重游泳试验中各剂量对小鼠的体重无显著性差异(P＞0.05)，而高剂量组小鼠的负重游泳时间比对照组显著性延长(P＜0.05)。

表8：乳清梨酒对血清尿素实验小鼠体重和血清尿素的影响

由表8可见，在血清尿素实验中各剂量对小鼠的体重无显著性差异(P＞0.05)，而高剂量组小鼠的血清尿素含量显著性低于对照组(P＜0.05)。

表9：乳清梨酒对肝糖原实验小鼠体重和肝糖原含量的影响

由表9可见，在肝糖原实验中各剂量对小鼠的体重无显著性差异(P＞0.05)，而高剂量组小鼠的肝糖原含量显著性高于对照组(P＜0.05)。

表10：乳清梨酒对血乳酸实验小鼠体重的影响

由表10可见，在血乳酸实验中乳清梨酒各剂量组对小鼠的体重无显著性差异(P＞0.05)。

表11：乳清梨酒对血乳酸实验小鼠游泳前后三个时间点血乳酸含量的影响

由表11可见，在血乳酸试实验中，乳清梨酒不同剂量组小鼠在游泳前，游泳后，游泳后20min的血乳酸含量无显著性差异(P＞0.05)。

表12：乳清梨酒对游泳小鼠血乳酸曲线下面积的影响

由表12可见，在血乳酸实验中，乳清梨酒各剂量组游泳小鼠的血乳酸曲线面积均无显著性差异(P＞0.05)。

综上结果：实验表明，经口给予小鼠不同剂量的乳清梨酒样品，对小鼠的体重增长无不良影响，能明显延长小鼠负重游泳时间，减少运动时血清尿素的生成，增加肝糖原的储备，对小鼠的体重和血乳酸无明显影响，因此乳清梨酒具有缓解体力疲劳的功能性作用。

本发明提供的本发明提供的植物乳杆菌WZMX-2及其应用的乳清梨酒的制备方法生产效率高、无添加，有效改善发酵乳清酒苦味，制备出的乳清梨酒色泽均匀、呈淡黄绿色、澄清透亮、具有乳清与香梨固有的色泽和香气，无苦涩感，口感偏甜，酸度适中，协调性适中，醇香淡雅，口感丰满，具有良好的均衡性。经口给予小鼠进行负重游泳试验，血清尿素测定试验，肝糖原测定试验和血乳酸测定试验，结果显示乳清梨酒能明显延长小鼠负重游泳的时间，减少运动时血清尿素的生成，增加肝糖原的储备，对小鼠的体重和血乳酸无明显影响，表明乳清梨酒具有缓解体力疲劳的功能性作用。

如上所述，即可较好地实现本发明,上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 新疆农业大学

<120> 植物乳杆菌WZMX-2与应用及其制备的乳清梨酒

<130> WZMX-2

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1440

<212> DNA

<213> WZMX-2

<220>

<221> WZMX-2

<222> (1)..(1440)

<400> 1

agtcgacgag ctctggtatt gattggtgct tgcatcatga tttacatttg agtgagtggc 60

gaactggtga gtaacacgtg ggaaacctgc ccagaagcgg gggataacac ctggaaacag 120

atgctaatac cgcataacaa cttggaccgc atggtccgag tttgaaagat ggcttcggct 180

atcacttttg gatggtcccg cggcgtatta gctagatggt ggggtaacgg ctcaccatgg 240

caatgatacg tagccgacct gagagggtaa tcggccacat tgggactgag acacggccca 300

aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg gacgaaagtc tgatggagca 360

acgccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct cgtaaaactc tgttgttaaa gaagaacata 420

tctgagagta actgttcagg tattgacggt atttaaccag aaagccacgg ctaactacgt 480

gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc 540

gagcgcaggc ggttttttaa gtctgatgtg aaagccttcg gctcaaccga agaagtgcat 600

cggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt agcggtgaga 660

tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct gtctggtctg taactgacgc 720

tgaggctcga aagtatgggt agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc ataccgtaaa 780

cgatgaatgc taagtgttgg agggtttccg cccttcagtg ctgcagctaa cgcattaagc 840

attccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 900

caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gctacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac 960

atactatgca aatctaagag attagacgtt cccttcgggg acatggatac aggtggtgca 1020

tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080

tattatcagt tgccagcatt aagttgggca ctctggtgag actgccggtg acaaaccgga 1140

ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta 1200

caatggatgg tacaacgagt tgcgaactcg cgagagtaag ctaatctctt aaagccattc 1260

tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg 1320

atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatga 1380

atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatga 1440