本发明属于生物技术领域，涉及产生天然红色素微生物赤红球菌及其红色素制备方法。更具体的说是：一种发酵生产红色素赤红球菌的菌种，该菌种是本发明发现的一株能有效生产红色素的新菌株，用该菌株发酵生产提取简单且稳定性好。
背景技术：
色素是广泛应用于食品工业、化妆品生产、纺织和日用品生产中，为产品带来较好的附加值。但合成色素的潜在危害性致癌、致畸等，其应用日益受到排斥，而天然色素越来越受到人们的青睐。天然色素的来源主要分为动物色素、植物色素、微生物色素和矿物色素等。动、植物来源色素己经不能满足工业高速发展的需求。近年来，致力于寻找可供代替的天然色素的研究增多，而这些研究大部分把目光投向了微生物色素。一些微生物在生长过程中会产生色素，而且微生物色素生长快、易培养、可简单地大规模工业生产，微生物色素渐渐成为一种获取天然色素的重要途径。更重要的是其安全性、适用范围以及最大用量都比人工合成色素有明显的优势。红色色素作为三大基本色素之一具有很高的“黄金含量”它可与蓝、黄品系天然色素调配成多种色调，使天然色素的色彩更加丰富 。天然红色色素不仅可以赋予食品缤纷的色彩,而且有一些还具有多种生理功能,可广泛用于医药、食品和化妆品领域。研究和开发无毒的天然红色色素已经成为色素发展的总趋势,己经形成了以天然色素为主导的市场。因此天然红色色素的研究和开发有着广阔的前景和发展潜力。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种赤红球菌（CGMCC No.12604）发酵生产天然红色素的培养基配方及天然红色素的提取工艺。所制备的天然红色素可作为食品添加剂、饲料添加剂或精制后作为药品或彩妆类化妆品的高级添加剂。
本发明的一个目的是提供一种微生物发酵生产天然红色素的菌种，其分类属赤红球菌（Rhodococcus ruber）,保藏号为CGMCC No. 12604。
本发明的另一个目的是公开了采用赤红球菌（Rhodococcus ruber）,保藏号为CGMCC No. 12604菌种制备天然红色素的方法。
本发明还一个目的是公开了的采用赤红球菌（Rhodococcus ruber）,保藏号为CGMCC No. 12604菌种发酵生产天然红色素的制备方法。
为实现上述目的，本发明公开的技术内容如下：
一种赤红球菌，其分类属赤红球菌（Rhodococcus ruber）,保藏号为CGMCC No. 12604。
本发明提供的CGMCC No. 12604菌株是一株能生产天然红色素的新菌株，用该菌株发酵糖质原料生产红色素。
抗真菌脂肽微生物发酵菌株，其分类属赤红球菌（Rhodococcus ruber）,保藏号为CGMCC No. 12604，保藏日期2016年6月12日。保藏地点：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China General Microbiological Cultuer Collection Centre）进行保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。
赤红球菌的生理生化特性如下：
该菌细胞为杆状，革兰染色均匀，且为阳性，不产生芽孢。在肉汤培养基平板上菌落呈圆形或不规则状，菌株菌落边缘整齐呈圆形,表面光滑湿润红色。菌株无鞭毛 ,不运动, 不发光, 红色素只产在胞内 ,培养基内无色素。
本发明进一步公开了采用赤红球菌（Rhodococcus ruber）,保藏号为CGMCC No. 12604菌种制备天然红色素的方法：
（1）种子培养和培养基
采用的发酵菌株为CGMCC No. 12604，种子培养基组成（g/L）：葡萄糖10~30g，蛋白胨2~5g，酵母粉5 g/L、氯化钠 10 g/L、K2HPO4 2~6g，pH 7.0～7.2；150~180转/分钟摇床震荡培养，30~40℃，36~48h。
（2）采用的发酵菌株为CGMCC No. 12604，发酵培养基组成为（g/L）：糖质原料20~40g，蛋白胨2~15g，酵母粉15 g/L、玉米浆15 g/L，氯化钠 10 g/L、柠檬酸钠1.5~3g，MgSO4·7H20 0.1~ 0.2g，K2HPO4 2~6g，pH 7.0～7.2；
（3）发酵培养：按1%-10%（v/v）的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度30~40℃，发酵通气量为5~13m3/h，罐压 0.02~0.09 MPa，搅拌速度120-150转/分钟，发酵时间120~144小时，发酵过程中通入无菌空气，用氨水或液碱维持发酵液pH在6.5~7.5，发酵过程中通入无菌空气，用氨水或液碱维持发酵液pH在6.5~7.5，发酵结果红色素产量为1~2g/L。
（4）红色素提取方法:采用反复冻融破壁法和超声波破壁法，取发酵液于离心管中，4000r/min 离心10min，弃去上清液，用去离子水洗涤沉淀得湿菌体，立即放置于-20°C冰箱12h连续重复两次，加入100%乙醇混匀，在冰浴上进行超声波破碎处理，超声功率200w，超声时间5s，间隔时间5s，总时间30min，离心去除菌体，即可得到乙醇色素提取液。
本发明所述的制备方法，其中糖质原料包括：葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、可溶性淀粉糖化液或玉米粉糖化液。
本发明更加详细的描述如下：
（1）微生物菌株的筛选与鉴定：
将菌株分别接种到 1% 葡萄糖、蔗糖、L- 阿拉伯糖、甘露醇等糖的无机盐液体培养基中，28℃恒温培养3~7d，观察菌株生长状况。该菌株能利用糊精 、吐温40 、吐温80、D-果糖、α-D-葡萄糖、α-甘露糖、D-阿洛酮糖、D-核糖、蔗糖等多种糖类乙酸、β-羟乙酸、α-羟乙酸、戊酮酸、乳酸、丙酸、丙酮酸、L- 谷氨酸等有机酸还可以利用丙酮酸甲酯、琥珀酸单甲基酯，但不能利用D-乳酸甲酯。不能利用葡萄糖产气，能在 NaCl 浓度为 2% 的环境下生长，为革兰氏阳性菌，与赤红球菌的生长特性一致菌株的生理生化特征均与布坎南和吉本斯等（1984）编著的《伯杰细菌鉴定手册》第八版和东秀珠、蔡妙英（2001）编著的《常见细菌鉴定手册》中描述的赤红球菌菌相同。
（2）16SrDNA 序列测定: 对该菌株的16SrDNA 序列进行基因克隆, 扩增获得 1438bp 的序列。将该 16SrDNA 序列在GenBank 中进行同源性比对可知,该菌株与赤红球菌(Rhodococcus ruber)亲缘关系最为接近,相似性达 99%。通过该菌株生长生理特性和16SrDNA 序列测定结果判断其为赤红球菌。菌株的16SrDNA 的序列如下：
Rhodococcus sp. (CGMCC No. 12604) 16S rDNA gene
TCGAACGCTGGGGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGTAAGGCCCTTTCGGGGGTACACGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACCGGGTCTAATACCGGATATGAGCTCCTGCCGCATGGTGGGGGTTGGAAAGTTTTTCGGTGCAGGATGAGTCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGACCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGTCTTCGGATTGTAAACTCCTTTCAGTAGGGACGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAACCACGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCACGTCGTCTGTGAAATCCTCCAGCTCAACTGGGGGCGTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTACTACAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGTAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGAGCAGATACCCTGGTAAGTCCATGCCGTAAGCGGTGGGCGCTAGGTGTGGGGTCCTTCCACGGATTCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGTCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTAGGCTTGACATATACAGGACGACGGCAGAGATGTCGTTTCCCTTGTGGCTTGTATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTCAGATGCTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTGTCTCATGTTGCCAGCACGTTATGGTGGGGACTCGTGAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCTAGTACAGAGGGCTGCGAGACCGCGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCTAGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCTCGCGATTTGA
（3）微生物菌株的培养与发酵生产红色素：
斜面和种子培养基的组成（g/L）：葡萄糖1~3，胰蛋白胨5~10，酵母粉3~6，NaCl 6~12，去离子水配制，pH 7.2～7.5；固体培养基需加15g琼脂粉。
发酵培养基的组成（g/L）：糖质原料20~40g，蛋白胨2~15g，酵母粉15 g、玉米浆15 g，氯化钠 10 g、柠檬酸钠1.5~3g，MgSO4·7H20 0.1~ 0.2g，K2HPO4 2~6g，pH 7.0～7.2；发酵培养：按1%~10%（v/v）的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度30~40℃，发酵通气量为5~13m3/h，罐压 0.02~0.09 MPa，搅拌速度120-150转/分钟，发酵时间120~144小时，发酵过程中通入无菌空气，用氨水或液碱维持发酵液pH在6.5~7.5，发酵过程中通入无菌空气，用氨水或液碱维持发酵液pH在6.5~7.5，发酵结果红色素产量为1~2g/L。
本发明用于发酵的糖质原料可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、玉米粉糖化液。发酵过程通入无菌空气，用氨水或液碱维持发酵液的pH在6.5~7.5，发酵液中细菌红色素产量为1~2g/L。
红色素提取方法:采用反复冻融破壁法和超声波破壁法，取发酵液于离心管中，4000r/min 离心10min，弃去上清液，用去离子水洗涤沉淀得湿菌体，立即放置于-20℃冰箱12h反复冻融两次，加入100%乙醇混匀，在冰浴上进行超声波破碎处理，超声功率200w，超声时间5s间隔时间5s，总时间30min。离心去除菌体，即可得到乙醇色素提取液。
本发明进一步考察了采用赤红球菌（Rhodococcus ruber）,保藏号为CGMCC No. 12604菌种制备的天然红色素的稳定性情况：
（1）光对色素的影响：取色素液置室内紫外灯光下照射，在0、1、2、3、4、5h进行测定吸光度并观察颜色变化情况。其保存率分别为100%、97.9%、97.8%、97.7%、91.9%、88.9%。该色素对紫外光较稳定。取色素液置室内白帜光下照射，在0、1、2、3、4、5h进行测定吸光度并观察颜色变化情况。其保存率分别为100%、100%、100%、97.7 %、97 %、96.7%。该色素液在白帜光下很稳定。
（2）温度对色素的影响： 取色素液在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、条件下分别加热0.5h 后，分别测定其溶液吸光度，其保存率分别为99.7%、99.4%、99%、98.9%、98.6%、98.1%、94.4%、92.7%。该色素溶液较耐高温，常温下稳定性高。
（3）氧化剂对色素的影响：取色素溶液，用30%H2O2配置成0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%浓度的H2O2色素溶液，避光放置1h测其吸光度，其保存率分别为100%、99.8%、99.2%、98.1%、97.7%、97.5%。氧化剂H2O2对色素稳定性的影响结果可见，色素在不同浓度的氧化剂下吸光度变化很小，与此相对应其颜色也无明显变化，显示该色素耐氧化剂性很好
（4）还原剂对色素的影响：取色素溶液，用Na2SO3配置成0、0.1、0.2、0.4、0.8mg/L浓度的Na2SO3色素溶液，避光放置1h测其吸光度，其保存率分别为100%、98.7%、97.6%、97.1%、96.4%。还原剂Na2SO3对色素稳定性的影响结果可见，色素在不同浓度的还原剂下吸光度变化很小，与此相对应其颜色也无明显变化，显示该色素耐还原剂性很好。
（5）食品添加剂的影响:分别用山梨酸钾、苯甲酸钠、维生素C、柠檬酸钠、乳酸配置成2mg/L的色素溶液，避光放置1h测其吸光度，其保存率分别为100%、100%、100%、100%、100%。色素液在食品添加剂影响下无任何变化，显示该色素对食品添加剂非常稳定。
本发明公开的产生天然红色素的赤红球菌及其制备方法与应用所具有的积极效果在于：
（1）赤红球菌是一种无毒无害的微生物，可以进行工业化大规模培养。
（2）由赤红球菌菌体提取的色素对光和温度的稳定性好，可以广泛应用于食品和化妆品中。
（3）提取完全、快速，生产工艺流程简单、产品无毒性残留，安全性高。
附图说明
图1为 红球菌（Rhodococcus ruber）菌落形态图；因为菌落产红色素，所以呈红色。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。例如葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、玉米粉等均有市售。
实施例1
赤红球菌，其分类属赤红球菌（Rhodococcus ruber）,保藏号为CGMCC No. 12604。
的筛选方法如下：
（1）取土壤样品（富含腐殖质）5克于种子培养基中，其中种子培养基组成（g/L）：葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉5 g、氯化钠 10 g、K2HPO4 2g，pH 7.0～7.2；150~180转/分钟摇床震荡培养，30~40℃，36~48h富集微生物。
（2）用接种环无菌挑取（1）富集的微生物菌液，在种子培养基组成（g/L）：葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉5 g、氯化钠 10 g、K2HPO4 2g，pH 7.0～7.2，平板上划线，静置于培养箱中30~40℃，培养36~48h；
（3）观察（2）平板中生长的红色菌落，并将其无菌操作挑取到种子培养基组成（g/L）：葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉5 g、氯化钠 10 g、K2HPO4 2~6g，pH 7.0～7.2，平板上划线分离，静置于培养箱中30℃，培养36h；
（4）经过（3）分离得到的单菌落进行Biolog实验，和16s rDNA序列测定和比对实验。确定其菌株的种属：
Biolog系统鉴定结果
实施例2
采用赤红球菌（Rhodococcus ruber）,保藏号为CGMCC No. 12604菌种制备天然红色素的方法：
（1）种子培养和培养基
采用的发酵菌株为CGMCC No. 12604，种子培养基组成（g/L）：葡萄糖20g，蛋白胨4g，酵母粉5 g、氯化钠 10 g、K2HPO4 3g，pH 7.0～7.2；170转/分钟摇床震荡培养，34℃，45h。
（2）采用的发酵菌株为CGMCC No. 12604，发酵培养基组成为（g/L）：糖质原料20~40g，蛋白胨4g，酵母粉15 g、玉米浆15 g，氯化钠 10 g、柠檬酸钠2.5，MgSO4·7H20 0.15g，K2HPO4 3g，pH 7.0～7.2。
（3）发酵培养：按1%~10%（v/v）的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，培养温度35℃，发酵通气量为8m3/h，罐压 0.05 MPa，搅拌速度120~150转/分钟，发酵时间134小时，发酵过程中通入无菌空气，用氨水或液碱维持发酵液pH在7.0，发酵过程中通入无菌空气，用氨水或液碱维持发酵液pH在7.0，发酵结果红色素产量为1.5g/L。
（4）红色素提取方法:采用反复冻融破壁法和超声波破壁法，取发酵液于离心管中，4000r/min 离心10min，弃去上清液，用去离子水洗涤沉淀得湿菌体，立即放置于-20°C冰箱12h连续重复两次，加入100%乙醇混匀，在冰浴上进行超声波破碎处理，超声功率200w，超声时间5s，间隔时间5s，总时间30min，离心去除菌体，即可得到乙醇色素提取液。
本发明用于发酵的糖质原料可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉或玉米粉
培养基可以是（g/L）:葡萄糖40g，蛋白胨4g，酵母粉15 g,玉米浆15 g，氯化钠 10 g,柠檬酸钠2.5g，MgSO4·7H20 0.15g，K2HPO4 3g，pH 7.0～7.2；；
培养基可以是（g/L）:蔗糖 25g，蛋白胨4g，酵母粉15 g,玉米浆15 g，氯化钠 10 g,柠檬酸钠2.5g，MgSO4·7H20 0.15g，K2HPO4 3g，pH 7.0～7.2；；
培养基可以是（g/L）:果糖 25g，蛋白胨4g，酵母粉15 g,玉米浆15 g，氯化钠 10 g,柠檬酸钠2.5g，MgSO4·7H20 0.15g，K2HPO4 3g，pH 7.0～7.2；
培养基可以是（g/L）:可溶性淀粉 20g，蛋白胨4g，酵母粉15 g,玉米浆15 g，氯化钠 10 g,柠檬酸钠2.5g，MgSO4·7H20 0.15g，K2HPO4 3g，pH 7.0～7.2；；
培养基可以是（g/L）:玉米粉 20g，蛋白胨4g，酵母粉15 g,玉米浆15 g，氯化钠 10 g,柠檬酸钠2.5，MgSO4·7H20 0.15g，K2HPO4 3g，pH 7.0～7.2；
天然红色素可用于油性食品 、调味汁 、水产品加工 、蔬菜制品 、果冻 、冰淇淋 、奶油 、人造奶油 、干酪 、色拉 、调味酱 、米制品 、烘烤食品等食品中 ,还广泛应用于化妆品和制药业中。本发明制备的赤红球菌红色素它作为天然红色素可以直接使用,也可以经乳化或以粉末形式广泛用于各个领域,如食品、 饲料、 饵料和保健品等,特别在食品加工业中应用十分广泛。可用于熟肉制品、果冻、饮料、糕点等，最大使用量为4g/kg。赤红球菌红色素对蛋白质有良好的着色性能，色调贴近肉的自然色，有真实感。例如在火腿、香肠、布丁冰激凌中，酸奶等食品中，以 0.2~0.4 g/kg 的添加量；可达到理想的着色效果,色调自然,安全性高。
EQUENCE LISTING
<110> 天津科技大学
<120> 一种产生天然红色素的赤红球菌及其制备方法与应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcgaacgctg ggggcgtgct taacacatgc aagtcgaacg gtaaggccct ttcgggggta 60
cacgagtggc gaacgggtga gtaacacgtg ggtaatctgc cctgcacttc gggataagcc 120
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