一种采用不定型固体附着物实现乳酸菌高密度发酵的技术的制作方法

本发明涉及食品微生物发酵工程领域，特别是涉及一种采用不定型固体附着物实现乳酸菌高密度发酵的技术。

背景技术：

乳酸菌，是指一群能利用可发酵性碳水化合物，产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称。乳酸菌是一类对人体有益的微生物菌群，而且广泛分布在自然界。乳酸菌发酵能够产生大量的有机酸、醇类及各种氨基酸等代谢物，具有抑制腐败均、提高消化率、防癌等生理功效。乳酸菌的应用历史非常悠久，如今广泛应用于发酵乳制品行业、食品加工业、饲料调制、医药卫生以及禽畜疾病的防治。

随着我国发酵乳制品工业的迅猛发展，积极研究并大力开发高效浓缩型酸奶发酵剂，对于推动我国乳酸菌发酵剂产业化进程，促进我国发酵乳制品工业的发展，具有重要的意义。而乳酸菌超浓缩发酵剂制备的关键是要实现对其高活性、高密度的培养，因此乳酸菌高密度培养工程技术研究具有重要的现实意义和广阔前景。

乳酸菌高密度培养可以用来生产发酵剂、益生菌制剂、乳酸、细菌素，以及其他产物等，但乳酸菌在培养过程中的发酵液的酸化及代谢产物会抑制乳酸菌的生长，导致培养的菌体密度及生物量积累的连续性受到严重阻遏。

菌体培养过程中，产物抑制系数影响生长速率及产物转化率。而控制pH值的变化仅能部分地减缓这种抑制。现有技术中，为了实现乳酸菌的高密度发酵，可以采用（1）补料、增加膜过滤装置来稀释或去除代谢废物，解除生长抑制；也可以采取（2）固定化或微胶囊化来固定细胞，防止代谢物影响到乳酸菌的生长。另外，还可以采用（3）生物膜诱导法，通过外源刺激使乳酸菌形成生物膜，实现高密度培养；最后，也有学者通过（4）数学模型观察细胞生长周期并计算出细胞浓度的变化趋势、生物合成活力，以及底物消耗率等，最终获得最佳目的物生产模型或高密度培养。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种采用不定型固体附着物实现乳酸菌高密度发酵的技术，采用无定型固体悬浮物诱导乳酸菌产生生物膜，从而实现乳酸菌的高密度培养。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种采用不定型固体附着物实现乳酸菌高密度发酵的技术，包括以下步骤：

（1）选择长势旺盛，并且保证接种后能够在4-8h达到完成对数生长期的优良乳酸菌菌种进行活化，将活化后的乳酸菌菌种接种于乳酸菌培养基中；

（2）于37℃进行发酵培养，培养完成后，收获菌体，即可。

上述一种采用不定型固体附着物实现乳酸菌高密度发酵的技术，优选的方案是，步骤（1）所述乳酸菌菌种可以是唾液乳杆菌、发酵乳杆菌和乳酸片球菌中的一种。

上述一种采用不定型固体附着物实现乳酸菌高密度发酵的技术，优选的方案是，步骤（1）所述乳酸菌菌种的接种量为0.5~1%。

上述一种采用不定型固体附着物实现乳酸菌高密度发酵的技术，优选的方案是，步骤（1）所述乳酸菌培养基为PY培养基。

上述一种采用不定型固体附着物实现乳酸菌高密度发酵的技术，优选的方案是，所述PY培养基由以下重量组分的原料组成：未水解大分子蛋白质50g，蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，酵母粉10g，无水乙酸钠20g，KH₂PO₄ 6g，MgSO₄∙7H₂O 0.6g，MnSO₄∙4H₂O 0.2g，水1000 mL。

上述一种采用不定型固体附着物实现乳酸菌高密度发酵的技术，优选的方案是，所述PY培养基的pH为6.8。

上述一种采用不定型固体附着物实现乳酸菌高密度发酵的技术，优选的方案是，步骤（2）所述发酵的时间为36-48h。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

（1）本发明提供的发酵技术无需补料，可以一次性完成发酵过程；可以采用一般性发酵罐，无需投资专用发酵罐；

（2）本发明可以获得乳酸菌菌体，所有以乳酸菌生物量为发酵目的的生产过程均可以应用，而固定化（生物膜）的高密度培养技术无法获得乳酸菌菌体，只能以乳酸菌代谢物作为目标产物；

（3）本发明提供的发酵技术，在发酵结束后，菌落总数可以达到10^10-12 cfu/mL；获得的发酵剂由酸凝蛋白包裹，实现了大部分的菌体包埋；

（4）由本发明发酵技术获得的菌体耐高温、抗逆性强，在模拟胃酸、胆盐环境中存活率提高2-3倍。

附图说明

图1-3显示为本发明和对照组发酵技术所得菌落总数的对比图。

图4-6显示为本发明和对照组发酵产物的耐高温对比图。

图7-9显示为本发明和对照组发酵产物的胃酸耐受力对比图。

图10-12显示为本发明和对照组发酵产物的胆盐耐受力对比图。

具体实施方式

下面结合实施例和实验例详细说明本发明的技术方案，但保护范围不限于此。本发明所用原料皆可从市场购买。

实施例1 一种采用不定型固体附着物实现乳酸菌高密度发酵的技术，包括以下步骤：

（1）选择长势旺盛，并且保证接种后能够在4-8h达到完成对数生长期的优良唾液乳杆菌菌种进行活化，将活化后的唾液乳杆菌菌种接种于pH为6.8的PY培养基中，所述唾液乳杆菌菌种的接种量为0.5~1%，所述PY培养基由以下重量组分的原料组成：未水解大分子蛋白质50g，蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，酵母粉10g，无水乙酸钠20g，KH₂PO₄ 6g，MgSO₄∙7H₂O 0.6g，MnSO₄∙4H₂O 0.2g，水1000 mL；

（2）于37℃进行发酵培养36-48h，培养完成后，收获菌体，即可。

实施例2 一种采用不定型固体附着物实现乳酸菌高密度发酵的技术，包括以下步骤：

（1）选择长势旺盛，并且保证接种后能够在4-8h达到完成对数生长期的优良发酵乳杆菌菌种进行活化，将活化后的发酵乳杆菌菌种接种于pH为6.8的PY培养基中，所述发酵乳杆菌菌种的接种量为0.5~1%，所述PY培养基由以下重量组分的原料组成：未水解大分子蛋白质50g，蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，酵母粉10g，无水乙酸钠20g，KH₂PO₄ 6g，MgSO₄∙7H₂O 0.6g，MnSO₄∙4H₂O 0.2g，水1000 mL；

（2）于37℃进行发酵培养36-48h，培养完成后，收获菌体，即可。

实施例3 一种采用不定型固体附着物实现乳酸菌高密度发酵的技术，包括以下步骤：

（1）选择长势旺盛，并且保证接种后能够在4-8h达到完成对数生长期的优良乳酸片球菌菌种进行活化，将活化后的乳酸片球菌菌种接种于pH为6.8的PY培养基中，所述乳酸片球菌菌种的接种量为0.5~1%，所述PY培养基由以下重量组分的原料组成：未水解大分子蛋白质50g，蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，酵母粉10g，无水乙酸钠20g，KH₂PO₄ 6g，MgSO₄∙7H₂O 0.6g，MnSO₄∙4H₂O 0.2g，水1000 mL；

（2）于37℃进行发酵培养36-48h，培养完成后，收获菌体，即可。

试验例 本发明一种采用不定型固体附着物实现乳酸菌高密度发酵的技术的试验研究：

1. 试验对象

实验组：以本发明添加了未水解蛋白质的培养基的发酵技术，分别对唾液乳杆菌、发酵乳杆菌和乳酸片球菌进行高密度培养。

对照组：以不添加未水解蛋白质的基础培养基的发酵技术，分别对唾液乳杆菌、发酵乳杆菌和乳酸片球菌进行高密度培养。

2. 试验方法

2.1菌落总数的测量

菌落总数的测定采用平板计数法。取1 mL样品用无菌水10倍梯度稀释后，再吸取200 μL倾入培养皿中，接着倒入温度不超过70℃的MRS琼脂培养基。经37℃培养48 h后，对肉眼可见的菌落进行计数。菌落数要求在30~300个为有效稀释梯度，根据稀释的倍数，计算出原样品中的菌落数。由图1-3可知，基础培养基（对照组）培养结束后（24 h）菌落总数为10^8-9 cfu/mL，而本发明技术（实验组）发酵结束可以获得菌落总数为10^10-12cfu/mL，相当于对照组的100~1000倍。

2.2耐高温实验

无菌条件下分别取培养12 h的对照组和实验组的乳酸菌菌液，转移1mL至无菌离心管中，在50℃、60℃、70℃水浴30 min后，冰水迅速冷却至常温，然后测定初始及高温水浴后的菌落总数。根据菌体存活率，判断不同处理组乳酸菌的耐高温能力。由图4-6可知，本发明技术培养乳酸菌时，菌体耐高温能力显著增强，特别是60℃时处理30 min，对照组的乳酸菌全部死亡，而实验组均有不同程度的存活率。但是50℃处理时，对照组的菌体存活率为73~86%，实验组的存活率为85~95%。而70℃处理30min，所有的菌体全部死亡，存活率为0。

2.3模拟胃液及胆盐配制及实验方法

模拟胃液参照JJ Ahire等（2011）的配方：蛋白胨8.3，葡萄糖3.5，NaCL2.05， KH₂PO₄0.6， CaCl₂ 0.11， KCL 0.37，胆盐0.05，溶菌酶0.1，胃蛋白酶13.3（单位：mg/mL），最终pH值用1mol/L的HCL调节到2.50。使用时稀释10倍。

测定菌体在模拟胃液中的存活率时，取乳酸菌菌液10000 g离心5 min，弃去上清液后，换成等量的模拟胃液（10倍稀释），37℃培养30-180 min后，测量菌落总数。图7-9表明，实验组与对照组的乳酸菌对模拟胃酸均有一定的耐受能力，随着处理时间的延长，菌体存活率迅速下降。而实验组的存活率要显著高于对照组（P < 0.05）。

胆盐的配制是按照0.5-2%的质量分数，配制相应的胆盐溶液即可。图10-12表明，受试乳酸菌对于胆盐均表现出较强的耐受力。随着胆盐浓度的上升，菌体存活率有所下降。总体来说，实验组菌体存活率显著高于对照组（P < 0.05）。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。