一种植物乳杆菌冻干粉的制备方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种植物乳杆菌冻干粉的制备方法。
背景技术：
：在人的肠道中存在着几百种、数百亿个细菌，在肠内构成菌丛。迄今为止，人们已知这些肠道细菌分三类：一类是能够合成某些维生素、对有害细菌的增殖有抑制作用、对免疫功能有刺激和促进的效果，这就是以双歧杆菌和乳杆菌为主的有益菌，这些细菌通过调整肠道生态系统可保持人体的健康，减少疾病，延缓衰老，因此被称为益生菌；另一类是在肠道内会构成腐败、产生有害或致癌物质的有害菌，如梭状芽胞杆菌、拟杆菌属和真细菌属等；另外还有一类既有有害作用，又有有益作用的细菌，如胨球菌。植物乳杆菌是益生菌的一种，圆端直杆菌，通常为0.9-1.2μm×3.0-8.0μm，单个、成对或成短链；通常缺乏鞭毛，但能运动；革兰氏阳性，不生芽孢；厌氧或兼性厌氧，表面菌落直径约3mm，凸起，圆，光滑，细密，色白，偶尔呈浅黄或深黄色；能产生DL-乳酸，有1,6-二磷酸果糖醛缩酶和单磷酸己糖途径的活性，能在葡萄酸盐中生长，并产CO2；发酵1分子的核糖或其他的戊糖生成1分子的乳酸和1分子的乙酸。植物乳杆菌是乳酸菌的一种，此菌与其他乳酸菌的区别在于此菌的活菌数比较高。植物乳杆菌具有很多的保健作用：①有一定的免疫调节作用；②对致病菌有抑制作用；③降低血清胆固醇含量和预防心血管疾病；④维持肠道内菌群平衡；⑤促进营养物质吸收；⑥缓解乳糖不耐症；⑦抑制肿瘤细胞的形成等。基于植物乳杆菌对人体的多种功用及高活菌数的特性，越来越多的企业利用植物乳杆菌冻干粉为原料生产生物制品和健康食品，那么单位产品活菌数就直接影响产品的功效。因此，在冻干粉生产制备过程中提高活菌数就尤为重要。技术实现要素：本发明目的是提供一种植物乳杆菌冻干粉的制备方法，达到植物乳杆菌增殖培养、冻干粉活菌数量大、菌体收率高的目的。本发明采用的技术方案为：一种植物乳杆菌冻干粉的制备方法，包括如下步骤：1)菌种划线培养：将植物乳杆菌菌粉用无菌水稀释后，于MC培养基上分区划线，划线结束后，平皿倒置，35℃培养箱恒温培养40～72小时；2)一级纯化培养：挑取平皿上溶钙圈较大的单菌落接种至装有MRS液体培养基的试管中，试管密封，35℃培养箱恒温静置培养15～20小时；3)二级纯化培养：按3～5％接种量，将一级纯化培养好的菌悬液接种至装有MRS液体培养基的三角瓶中，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养15～20小时；4)菌种保存：对二级纯化培养得到的菌悬液进行离心，12000rpm离心10分钟后得到菌泥，将菌泥溶解于混合液中，得菌泥混合液，将菌泥混合液分装在已灭菌的冻存管中，封口膜密封，冻存于-40～-80℃低温冰箱内，得植物乳杆菌菌泥冻存管，备用；5)冻存菌种复苏：取存于低温冰箱内的植物乳杆菌菌泥冻存管，立即放入35℃水浴锅内进行菌种复苏，30～45s，至冻存管内液体全部融化；6)菌种一级培养：将复苏好的1～2ml菌泥混合液直接接种至装有基础培养基的三角瓶A中，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养16～24小时；7)菌种二级培养：按照2～6％接种量，将一级培养结束的菌悬液接种至装有基础培养基的三角瓶中B，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养16～24小时；8)菌种三级培养：按照2～6％接种量，将二级培养结束的菌悬液接种至装有基础培养基的发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35℃恒温培养7～12小时；9)菌种四级发酵：按照2～8％接种量，将三级培养结束的菌悬液接种至装有优化培养基的发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35℃恒温培养，在发酵开始3小时后，通过流加食品级NaOH溶液来维持恒定pH为4.80～5.30，培养周期6～12小时，直至监测到菌液OD600值停止增长或呈负增长，立即停止发酵；10)发酵液离心：四级发酵结束后，将发酵罐罐体温度调低，当罐内发酵液温度低于20℃时准备离心，离心设备采用管式离心机，离心前对转鼓进行蒸汽灭菌30min，离心转速为10000～15000rpm；11)菌泥收集：离心结束后，收集转鼓内的菌泥；12)冻干保护剂添加，菌泥收集完毕后，按照菌泥：冻干保护剂＝1:1～2的质量体积比，添加冻干保护剂，并搅拌、得到混合均匀的菌液；13)冷冻干燥：将混合均匀的菌粉，分装到冻干机托盘中，然后将冻干机托盘放入冻干机内进行菌粉的冻干，真空度0～1.0Pa，温度－25℃，持续冻干43～58小时；14)冻干粉收集；15)粉碎、包装：按质量要求进行粉碎后包装。所述的制备方法，步骤3)中MRS液体培养基的体积占三角瓶容积的40％～60％。所述的制备方法，步骤4)中混合液与离心前二级纯化培养得到的菌悬液的体积比为1:10。所述的制备方法，步骤4)中混合液由MRS液体培养基与50％甘油溶液按体积比为1:1～1.5的比例配制混合而成。所述的制备方法，步骤7)中基础培养基的体积占三角瓶B容积的40％～60％；步骤8)中基础培养基的体积占发酵罐容积的40％～60％。所述的制备方法，步骤6)、7)、8)中基础培养基的配制，按照配方比例为：酵母蛋白胨8.0～15.0g/L、葡萄糖15.0～25.0g/L、酵母浸出物3.0～6.0g/L、乙酸钠4.0～6.0g/L、硫酸镁0.1～0.6g/L、吐温800.5～0.75g/L、磷酸二氢钾1.5～3.0g/L、余量为无菌水，称量各组分，混合、加热溶解，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.20～6.60，于115℃下灭菌30min。所述的制备方法，步骤9)中优化培养基装液的体积占发酵罐容积的40％～60％。所述的制备方法，步骤9)中优化培养基的配制，按照配方比例为：酵母蛋白胨13.0～18.0g/L、葡萄糖25.0～35.0g/L、酵母浸出物8.0～12.0g/L、乙酸钠8.0～12.0g/L、硫酸镁0.1～0.2g/L、吐温800.5～0.75g/L、磷酸二氢钾1.5～3.0g/L、余量为无菌水，称量各组分，混合、加热溶解，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.20～6.60，115℃下灭菌30min。所述的制备方法，步骤12)中冻干保护剂的配制，按照比例为：脱脂奶粉60.0～100.0g/L、麦芽糊精20.0～40.0g/L、海藻糖80.0～200.0g/L、吐温800.5～0.75g/L、甘油8.0～12.0g/L、谷氨酸钠0.8～1.5g/L、抗坏血酸钠0.8～1.5g/L、余量为无菌水，对各组分进行称量、混、溶解，于115℃灭菌30min，待温度降至室温后，冷藏于-4℃冰箱内备用。与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：1、本发明为实现植物乳杆菌增殖培养、富集高活菌数的菌体用于生产作为食品添加剂的冻干粉目的，针对植物乳杆菌纯化培养和菌种发酵分别采用了不同的、更适于菌体不同生长阶段的基础培养基和优化培养基，并且培养基采用的组分原料均为食品级。2、在本发明中，用于发酵的菌种采用离心菌泥冻存的保存方式，较于现在普遍应用的斜面和菌悬液直接冻存的方式，获得的菌悬液的收率和活菌数更高。3、采取分级扩大培养方式促使菌体数量快速增加，通过流加食品级NaOH溶液来控制发酵过程中pH恒定，在短时间里得到大量的菌体，并且菌种稳定，变异、退化少。4、采用管式离心机分离收集植物乳杆菌菌泥，菌泥收率可达到1.5％以上，活菌数高达1012CFU/g以上，并且管式离心机的转鼓可用蒸汽灭菌，有效地防止了在离心过程中染菌。5、利用冷冻干燥技术生产活菌制剂有许多突出的优点：①由于在低温下干燥，微生物不会失去生物活性；②在低温干燥过程中，微生物的生长和酶的作用几乎无法进行，能最好地保持被冻干物质的原来性状；③干燥后体积、形状基本不变；④被冻干制品呈海绵状，不干缩，因而溶解时与水接触面大，能迅速恢复原来的性状；⑤能除去物质中95％-99％的水分，延长制品的保存期。6、为避免在冷冻干燥过程造成菌细胞膜的损伤，加入冻干保护剂，在冻干保护剂中脱脂奶粉主要在细胞表面起保护层作用；海藻糖在冷冻干燥过程中形成一种玻璃态，在玻璃态下黏度极高，因而分子扩散系数很低，使大分子物质运动受阻，细胞壁的通透性降低，从而起到保护作用；抗坏血酸钠是一种水溶性极强的抗氧化剂，能使植物乳杆菌在冻干过程中免遭氧气的影响，保持细胞活性并提高稳定性；甘油和谷氨酸钠能渗透到细胞内部，可改善冻干过程中冰晶生成的速度和膜的渗透性；麦芽糊精有利于提高在冷冻干燥后的菌体成活率以及储存过程中的菌体成活率，同时还能提高菌粉的速溶性；吐温80作为表面活性剂可防止蛋白质变性，冷冻时冰-水界面的形成可引起蛋白质表面诱导变性，表面活性剂可使蛋白质溶液表面张力下降，减少冰-水界面蛋白质吸收和聚集的驱动力。复配保护剂体系中每种保护剂成分在冷冻干燥过程中都发挥各自的作用，同时相互间又具有协同作用。7、本发明技术制备的植物乳杆菌冻干粉，活菌数高，存活率高。附图说明图1为对比例1采用不同保存方式的菌种进行发酵对收率和活菌数影响的示意图。图2为对比例2采用不同基础培养基配方对OD600和收率的影响的对比图。图3为对比例3采用不同优化培养基配方对活菌数和收率的影响的对比图。图4为实施例1一种植物乳杆菌冻干粉的制备方法流程图。具体实施方式实施例1一种植物乳杆菌冻干粉的制备方法一、发酵用菌种的制备1)菌种划线培养：植物乳杆菌菌粉用无菌水稀释后，于MC培养基上四区划线，划线结束后，平皿倒置，35℃培养箱恒温培养60小时；2)一级纯化培养：挑取平皿上溶钙圈较大的单菌落接种至装有5mlMRS液体培养基的试管中，试管密封，35℃培养箱恒温静置培养15小时；3)二级纯化培养：按3％接种量，将一级纯化培养好的菌悬液接种至装有100mlMRS液体培养基的250ml三角瓶中，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养20小时；4)菌种保存：对二级纯化培养得到的100ml菌悬液进行离心，12000rpm离心10分钟后得到菌泥，将菌泥溶解于10ml混合液(混合液由5mlMRS液体培养基与5ml50％甘油溶液混合均匀配制而成)中，得菌泥混合液，将菌泥混合液分装在已灭菌的1ml冻存管中，封口膜密封，冻存于-80℃低温冰箱内，得植物乳杆菌菌泥冻存管，备用；注：1)—4)操作均必需在无菌操作台和无菌间内执行；二、菌种的发酵5)冻存菌种复苏：取存于低温冰箱内的植物乳杆菌菌泥冻存管，立即放入35℃水浴锅内进行菌种复苏，30～45s，至冻存管内液体全部融化；6)菌种一级培养：将复苏好的1ml菌泥混合液直接接种至装有10ml基础培养基的50ml三角瓶中，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养20小时；7)菌种二级培养：按照2％接种量，将一级培养结束的菌悬液接种至装有100ml基础培养基的250ml三角瓶中，按此接种4瓶，三角瓶密封，35℃培养箱恒温静置培养20小时；8)菌种三级培养：按照5％接种量，将二级培养结束的菌悬液接种至装有7.2L基础培养基的12L发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35℃恒温培养10小时；9)菌种四级发酵：按照5％接种量，将三级培养结束的菌悬液接种至装有120L优化培养基的200L发酵罐中，开启发酵罐搅拌桨，转速为100rpm，通气量为0，35℃恒温培养，在发酵开始3小时后，通过流加食品级NaOH溶液来维持恒定pH为5.10±0.1，培养至10小时时，监测到菌液OD600值停止增长，立即停止发酵；其中：步骤6)、7)、8)基础培养基的配方为：酵母蛋白胨8.0g/L、葡萄糖25.0g/L、酵母浸出物4.0g/L、乙酸钠5.0g/L、硫酸镁0.3g/L、吐温800.5g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、余量为无菌水，pH值6.20。制备：按照配方比例称量、加热溶解，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.20，115℃下灭菌30min；步骤9)优化培养基配方：酵母蛋白胨18.0g/L、葡萄糖32.0g/L、酵母浸出物12.0g/L、乙酸钠10.0g/L、硫酸镁0.1g/L、吐温800.5g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、余量为无菌水，pH值6.20。制备：按照配方比例称量、加热溶解，用1mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.20，115℃下灭菌30min；注：培养基中各组分原料均为食品级；三、冻干粉的制备10)发酵液离心：四级发酵结束后，将发酵罐罐体温度调低，当罐内发酵液温度低于20℃时准备离心，离心设备采用管式离心机，离心前对转鼓进行蒸汽灭菌30min，离心转速为12000rpm；11)菌泥收集，离心结束后，收集到转鼓内的菌泥2.03kg，菌泥收率为1.69％；12)冻干保护剂添加，菌泥收集完毕后，按照菌泥(kg)：冻干保护剂(L)＝1:1～2的质量体积比，添加冻干保护剂，并搅拌、得到混合均匀的菌粉。按照冻干保护剂的配方配制2.5L冻干保护剂。其冻干保护剂的配方：脱脂奶粉75.0g/L、麦芽糊精25.0g/L、海藻糖150.0g/L、吐温800.6g/L、甘油10.0g/L、谷氨酸钠1.2g/L、抗坏血酸钠1.2g/L、余量为无菌水。制备：按照比例对各组分进行称量、溶解，于115℃灭菌30min，待温度降至室温后，冷藏于-4℃冰箱内备用。13)冷冻干燥：将混合均匀的菌粉，分装到冻干机托盘中，然后将冻干机托盘放入冻干机内进行菌粉的冻干，真空度0～1.0Pa，温度－25℃，持续冻干50小时；14)冻干粉收集，检测活菌数为5.85×1011CFU/g；15)粉碎、包装，按质量要求进行粉碎后包装。注：5)—15)操作均需在10万级净化车间内进行。对比例1用于发酵的菌种保存方式的对比实验实施例1中植物乳杆菌经步骤1)菌种划线培养、步骤2)一级纯化培养、步骤3)二级纯化培养后的菌悬液，分别以斜面、菌悬液和采用实施例1步骤4)的菌泥保存方式进行冻存，然后分别以这三种保存方式冻存的菌种采用相同的培养条件进行同实施例1步骤5)-10)的发酵，然后分别测定发酵结束离心后得到的菌泥的活菌数和收率，结果如图1所示。其活菌数的测定方法：采用平板计数法；收率的测定方法如下：由图1显示可知：采用实施例1中离心菌泥方式保存的菌种进行发酵，活菌数和收率均高于斜面和菌悬液保存方式。对比例2基础培养基配方的对比实验配方A：酵母蛋白胨8.0g/L、牛肉粉0.6％、葡萄糖25.0g/L、乙酸钠5.0g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、硫酸镁0.3g/L、吐温800.5g/L、余量为无菌水。配方B：酵母蛋白胨8.0g/L、酵母浸出物4.0g/L、葡萄糖25.0g/L、乙酸钠5.0g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、硫酸镁0.3g/L、吐温800.5g/L、硫酸锰0.008％、余量为无菌水。配方C(实施例1配方)：酵母蛋白胨8.0g/L、酵母浸出物4.0g/L、葡萄糖25.0g/L、乙酸钠5.0g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、硫酸镁0.3g/L、吐温800.5g/L、余量为无菌水。分别按照配方A、B和C配制基础培养基，并在与实施例1相同的培养条件下培养植物乳杆菌，三级培养结束后，检测菌悬液的OD600和收率，结果如图2所示。由图2显示可知，基础培养基采用配方C即实施例1配方培养植物乳杆菌，培养结束后测得菌悬液的OD600和收率均高于配方A和配方B。对比例3优化培养基配方的对比实验配方Ⅰ：鱼蛋白胨18.0g/L、酵母浸出物12.0g/L、葡萄糖32.0g/L、乙酸钠10.0g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、硫酸镁0.10g/L、吐温800.5g/L、余量为无菌水。配方Ⅱ：牛骨蛋白胨18.0g/L、酵母浸出物12.0g/L、葡萄糖32.0g/L、乙酸钠10.0g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、硫酸镁0.10g/L、吐温800.5g/L、余量为无菌水。配方III：酪蛋白胨18.0g/L、酵母浸出物12.0g/L、葡萄糖32.0g/L、乙酸钠10.0g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、硫酸镁0.10g/L、吐温800.5g/L、余量为无菌水。配方IV(实施例1配方)：酵母蛋白胨18.0g/L、酵母浸出物12.0g/L、葡萄糖32.0g/L、乙酸钠10.0g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、硫酸镁0.1g/L、吐温800.5g/L、余量为无菌水。配方Ⅴ：酵母蛋白胨18.0g/L、牛肉粉12.0g/L、葡萄糖32.0g/L、乙酸钠10.0g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、硫酸镁0.10g/L、吐温800.5g/L、余量为无菌水。分别按照配方Ⅰ、Ⅱ、III、IV和Ⅴ配制优化培养基，并在与实施例1相同的培养条件下进行植物乳杆菌发酵，四级发酵结束后，检测菌悬液的活菌数和收率，结果如图3所示。由图3可知，优化培养基采用配方IV即实施例1配方进行植物乳杆菌发酵，发酵结束后测得菌悬液的活菌数和收率均高于配方Ⅰ、Ⅱ、III和Ⅴ。对比例4冻干保护剂配方的对比实验配方①：菊粉225g/L、谷氨酸钠12.5g/L、甘油45g/L；配方②：脱脂奶粉75.0g/L、蔗糖75.0g/L、葡萄糖75.0g/L、谷氨酸钠1.2g/L、抗坏血酸钠1.2g/L、吐温800.6g/L、甘油10.0g/L、麦芽糊精25.0g/L、余量为无菌水；配方③：脱脂奶粉75.0g/L、海藻糖150.0g/L、谷氨酸钠1.2g/L、吐温800.6g/L、甘油10.0g/L、麦芽糊精25.0g/L、余量为无菌水；配方④：脱脂奶粉75.0g/L、海藻糖150.0g/L、谷氨酸钠1.2g/L、抗坏血酸钠1.2g/L、吐温800.6g/L、余量为无菌水；配方⑤(实施例1配方)：脱脂奶粉75.0g/L、海藻糖150.0g/L、谷氨酸钠1.2g/L、抗坏血酸钠1.2g/L、吐温800.6g/L、甘油10.0g/L、麦芽糊精25.0g/L、余量为无菌水。按照配方①、②、③、④和⑤分别配制冻干保护剂，经115℃灭菌30min后，观察保护剂的颜色状态(如表1)，由于配方①呈橙黄色，颜色较深，所以不能使用。然后，分别采用配方②、③、④和⑤冻干保护剂在相同的冷冻干燥条件下对同一菌泥进行冷冻干燥，冷冻干燥结束后，通过检测冷冻干燥前后活菌数计算其存活率，结果见表1。由表1可知：采用实施例1冻干保护剂制得的植物乳杆菌冻干粉，菌体存活率远高于其他3种冻干保护剂。表1不同配方的冻干保护剂经灭菌后颜色状态的差别及对冻干粉存活率的影响保护剂配方编号颜色状态存活率/％配方①橙黄色，溶液——配方②乳白色，溶液44.4配方③乳白色，溶液44.7配方④乳白色，溶液64.5配方⑤乳白色，溶液75.5当前第1页1 2 3