本发明总的涉及微生物领域，具体涉及一株假格里尼翁苍白杆菌及其在防治植物寄生线虫的应用。
背景技术：
根结线虫(Root-knot nematode,Meloidogyne spp.)隶属于异皮科根结线虫属，是一类重要的土传性病原物。迄今为止，已记录的根结线虫达100余种，中国常见种类为南方根结线虫(M.incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)、花生根结线虫(M.arenaria)和北方根结线虫(M.hapla)。根结线虫分布地区广泛，寄主复杂多样，涉及粮食作物、油料作物、纤维作物、烟草、茶叶、果树、蔬菜、药材和花卉等3000余种植物。其通过口针吸取植物营养，对植物地下根部，地上茎、叶和果实等造成极大危害，据估计植物寄生线虫每年对世界农业生产造成的直接经济损失高达1000亿美元。近年来随着中国农业产业结构的不断调整，保护地蔬菜栽培面积扩大，寄主蔬菜种植密度和重、迎茬栽培模式增加，加之人为因素的影响导致蔬菜根结线虫病害发生成灾。据报道中国大约有50％的温室蔬菜存在不同程度的根结线虫危害，每年造成的经济损失高达4亿美元。目前，施用化学杀线剂仍是防治根结线虫病害的主要措施，而由此带来的环境及食品安全问题成为发展有机农业的主要障碍。大量的研究表明，利用自然界线虫天敌微生物进行线虫的生物防治及生态调控是控制线虫病害最为安全、有效的措施，也是目前国内外植物病害防控的重要发展方向。
苍白杆菌(Ochrobactrum spp.)属于变形菌门、根瘤菌目、布鲁氏菌科，是一类革兰氏阴性细菌，专性好氧。目前该属共描述18个种，其主要存在于植物根际土壤、工业重污染土壤、污泥和动、植物组织等环境。一些优良的苍白杆菌菌株被运用于阿维菌素(胡秀虹， 黄剑.阿维菌素降解菌AW1-12的筛选与分类鉴定.西南农业学报，2013，26(2):583-586)和噻吩磺隆(Zhao,W.S.,Xu L.,Li D.Z.et al.,Biodegradation of thifensulfuron-methy by Ochrobactrum sp.in liquid medium and soil.Biotechnology Letter,2015,37:1385-1392)等有毒残留物质的生物降解。同时也有一些苍白杆菌菌株作为植物根际促生菌被报道，这些菌株可以产生吲哚乙酸(IAA)和ACC脱氢酶，还具有固氮、溶膦、溶钾或螯合土壤铁离子等功能，有利于豆角(ImranA.,Saadalla M.J.A.,Khan S.U.et al.,Ochrobactrum sp.Pv2Z2exhibits multiple traits of plant growth promotion,biodegradation and N-acyl-homoserine-lactone quorum sensing.Annals of Microbiology,2014,64:1797-1806)和黄瓜(Xu S.,Liu Y.,Wang J.J.,et al.,Isolation and potential of Ochrobactrum sp.NW-3to increase the growth of cucumber.International Journal of Agricultural Policy and Research,2015,3(9):341-350)等植物生物量的积累。但目前国内外利用苍白杆菌进行植物病害生物防治的研究较少，特别是对苍白杆菌优良生防菌株的杀线虫活性评价及生防微生物菌剂(生物农药或微生物肥料)的研发尚处于空白状态。
技术实现要素：
本发明提供了具有高效杀线虫活性的假格里尼翁苍白杆菌及其应用，解决了化学杀线剂对环境及食品安全带来的问题，该菌株可高效杀灭植物寄生线虫，且以其发酵菌体为活性成分制备的生防微生物菌剂对植物生长还具有促进作用。
本发明的一个方面，提供一株假格里尼翁苍白杆菌(Ochrobactrum pseudogrignonense)NC1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.12154，保藏日期：2016年3月1日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。该菌株是通过大量筛选杀线虫功能菌株试验而获得的一株蔬菜根结线虫优良生防菌株，具有一定工业化生产潜力。
本发明的另一个方面，提供了所述的假格里尼翁苍白杆菌NC1在防治植物寄生线虫方面的应用。
本发明的再一个方面，提供了一种用于防治植物寄生线虫且以假格里尼翁苍白杆菌NC1为活性成分的生防微生物菌剂(微生物肥料或生物农药)。
以上所述的用于防治植物寄生线虫的假格里尼翁苍白杆菌NC1生防微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(A)将所述假格里尼翁苍白杆菌NC1进行发酵培养，再将培养物离心获得浓缩发酵液；
(B)向所述浓缩发酵液中添加0.5-1％的海藻酸钠(W/V)和0.5-1％(W/V)的壳聚糖；
(C)将菌液与草炭土和膨润土的混合载体充分混匀，获得固形物；所述菌液与所述草炭土和膨润土的混合载体的重量比为1:2.5；
(D)将所述固形物风干至含水量为15-25％时，进行造粒。
以上所述的制备方法，所述假格里尼翁苍白杆菌NC1的培养基成分及质量百分含量为：葡萄糖0.2-0.4％，胰蛋白胨1-1.5％、酵母粉0.3-0.6％、氯化钠0.8-1.2％，余量为水；
优选的，所述培养基的成分及质量百分含量为：葡萄糖0.35％，胰蛋白胨1％、酵母粉0.45％、氯化钠1％，余量为水。
以上所述的制备方法，所述培养基的pH为7.0，培养条件为28-30℃，摇床转速180-200rpm/min，培养时间为36-48h。
以上所述的制备方法，所述离心的转速为5000rpm/min，离心时间20min。
以上所述的制备方法，所述草炭土和膨润土的质量比为9-9.5：0.5-1。
以上所述的生防微生物菌剂包含的有效菌数为2.3×108CFU/g。
以上所述的生防微生物菌剂在防治植物寄生线虫和蔬菜促生方面的应用。
本发明提供了一株具有高效杀线虫活性的假格里尼翁苍白杆菌NC1及其生防微生物菌剂。基于12孔组培板生测试验，对假格里尼 翁苍白杆菌NC1发酵液对南方根结线虫的杀线活性进行综合评价，试验结果表明NC1菌株可能通过产生一些具有挥发性的杀线虫活性物质抑制卵粒孵化和影响二龄幼虫活性；以假格里尼翁苍白杆菌NC1发酵菌体为活性成分，草炭土和膨润土混合物为载体，经载体吸附、风干、造粒等工序制备出用于防治植物寄生线虫的生防微生物菌剂，盆栽试验结果表明，施用该微生物菌剂对南方根结线虫的生防效果达62.5％，同时对番茄植株具有一定促生作用，且效果稳定。本发明制备的微生物菌剂可与其它杀线剂配合施用，具有一定增效作用，但需保证杀线剂对假格里尼翁苍白杆菌NC1无抑制作用。本发明具有杀线效果显著、安全无害的特点，将在蔬菜根结线虫的生物防治中发挥重要作用，具有良好的应用开发前景。
附图说明
图1为以假格里尼翁苍白杆菌(O.pseudogrignonense)NC1发酵菌体为活性成分，草炭土和膨润土为载体的生防微生物菌剂形态图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。所有百分比浓度如无特别说明均为质量百分比浓度。
实施例一、假格里尼翁苍白杆菌(O.pseudogrignonense)NC1的分离、纯化、鉴定及保藏
本发明所述假格里尼翁苍白杆菌NC1分离自山东省沂南县铜井镇红峪庄某菜田中健康番茄植株的根际土壤。新鲜的番茄根系放入车载冰箱临时保存，带回实验室后用无菌水冲洗3-5min，以去除根系土壤，然后将根系剪成1cm大小根段，并转移至均质机中，同时加 入100mL无菌水，破碎处理2min，根系破碎液经梯度稀释后均匀涂布到NA培养基(牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖2.5g，琼脂18.0g，无菌水定容至1L，pH 7.0)，于28℃倒置培养48h，待长出单菌落后，用无菌牙签挑至新鲜NA培养基上，进行分离、纯化培养，将筛选得到的菌株命名为NC1。
通过显微镜和肉眼观察NC1的菌落形态、最适生长温度及色素产生情况等生物学特性；采用革兰氏染色法对NC1菌株进行革兰氏染色；对NC1菌株的接触酶、氧化酶和吲哚乙酸等生化特性进行测定(东秀珠，蔡妙英等编著.常见细菌系统鉴定手册.北京：科学出版社，2001)；利用Biolog GENⅢ微孔板测定NC1对不同类型碳源的利用情况和对部分抗生素的耐受性；提取细菌总DNA，采用细菌的通用保守引物(27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增16S r DNA序列，将测序得到的16S r DNA序列(如序列表SEQ ID NO：1所示)递交NCBI的GenBank数据库进行比对，确定NC1菌株分类地位；NC1菌株用含NA培养基的试管斜面进行短期保藏，用30％甘油低温冻存法长期保藏。
结果表明，NC1菌株为革兰氏阴性菌，菌体呈球状至短杆状，长1-1.5μm，以周生鞭毛运动。专性好氧，最适生长温度为26-30℃。在营养琼脂上培养48h，直径达1-2mm，菌落微隆起，表面光滑，无色，易挑起，不产色素。接触酶、氧化酶阳性，吲哚乙酸阴性。可以利用α-D-葡萄糖、D-果糖和D-岩藻糖作为糖类碳源。D-丝氨酸和L-天门冬氨酸阳性，甘氨酸-L-脯氨酸和L-精氨酸阴性。D-半乳糖醛酸、L-半乳糖酸内酯、D-葡萄糖醛酸、葡糖醛酰胺、α-酮戊二酸、L-苹果酸和乙酸等羧酸类碳源阳性，L-乳酸和乙酰乙酸为阴性。对乳酸钠、醋竹桃霉素、利福霉素、盐酸胍、万古霉素、氯化锂、亚碲酸钾、丁酸钠和溴酸钠等具有一定耐受性。NC1菌株16S rDNA序列与假格里尼翁苍白杆菌(O.pseudogrignonense)(Accession No.KT005456)的同源性达100％。
基于以上形态和分子序列特征，将NC1菌株鉴定为假格里尼翁 苍白杆菌(O.pseudogrignonense)，GenBank序列登陆号为KC454031，并于2016年3月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12154。
实施例二、假格里尼翁苍白杆菌(O.pseudogrignonense)NC1杀线虫活性评价
1、平板菌种的培养
将上述实施例1筛选得到的假格里尼翁苍白杆菌NC1从试管斜面中转接至NA培养基，于28℃培养48h，获得平板菌种。
2、液体发酵培养
液体发酵培养基成分及质量百分含量为：葡萄糖0.35％，胰蛋白胨1％、酵母粉0.45％、氯化钠优选1％，用水定容至1L，所述百分含量均为质量百分含量，pH优选7.0。
将上述步骤1获得的平板菌种接种到装有30mL液体培养基的250mL三角瓶中，于28℃180rpm/min条件下培养12h获得种子液。然后按2％的接种量将种子液接入200mL培养基中，培养48h获得发酵液，分别用无菌水稀释5倍和10倍获得稀释发酵液备用；将发酵液按10000rpm/min离心10min去菌体，收集上清液并用0.22μm微孔滤膜过滤获得发酵滤液，分别用无菌水稀释5倍和10倍获得稀释发酵滤液备用；将部分稀释发酵滤液分别用60℃和100℃水浴处理30min备用；NC1菌体用无菌水冲洗一次，获得菌体悬液并用血球计数板计数，然后将菌体悬液用无菌水调成浓度分别为1010CFU/mL、109CFU/mL和108CFU/mL的菌体悬液备用。
3、假格里尼翁苍白杆菌(O.pseudogrignonense)NC1对南方根结线虫(M.incognita)杀线活性评价
南方根结线虫采自本实验室温室中被南方根结线虫侵染的番茄病根，洗净根表土后切取带有大量根结的根部，用解剖镊子从病根上挑取新鲜、饱满、成熟的卵块。将卵块放于1％次氯酸钠溶液中处理1min，然后过500目网筛，并以无菌水反复冲洗，将一部分卵粒用无菌水调成200卵/50μl的卵悬液备用；其余卵粒放于含少量无菌水 的线虫孵化器上，置于25℃条件下孵化一周，每天收集南方根结线虫的二龄幼虫，并用无菌水调至200条二龄幼虫/50μl的二龄幼虫悬液备用。
1)假格里尼翁苍白杆菌NC1对南方根结线虫卵粒孵化的影响
试验共设置12个处理：发酵液处理(原液、5×和10×稀释共3个浓度)、发酵滤液处理(原液、5×和10×稀释共3个浓度)、发酵滤液水浴处理(60℃水浴30min和100℃水浴30min共2个处理)、菌体悬液处理(1010、109和108CFU/mL共3个浓度处理)和无菌水对照，每处理设置3次重复。
将1mL各处理液体分别加入12孔组培板(共四列，本实施例分别命名为A、B、C、D列，每列三孔)A列的3个孔内，同时向B列的3个孔内加入1mL ddH2O，以检测本发明所述假格里尼翁苍白杆菌NC1发酵液是否可以通过产生挥发性杀线活性物质的方式影响B列中南方根结线虫卵粒的活性。向12孔组培板的A列和B列每孔接种50μl上述制备的南方根结线虫卵悬液(200卵/50μl)，12孔组培板放于25℃培养箱中，10d后观察并记录各处理中南方根结线虫卵的孵化数量，分别计算卵孵化率和卵校正死亡率，结果如表1所示。
卵孵化率(％)＝孵化二龄幼虫数量/卵粒总接种数量×100％
卵校正死亡率(％)＝(处理组未孵化卵数量-对照组未孵化卵数量)/(1-对照组未孵化卵数量)×100％
表1本发明假格里尼翁苍白杆菌NC1对南方根结线虫卵孵化的影响
采用统计学软件SPSS 19.0对不同处理中卵孵化率进行单因素方差分析，a-e表示P＝0.05水平下各处理间的差异显著性，a-e从大到小排列，处理间差异不显著的先以a表示，直至某一个处理与之达到显著性差异则标b，以此类推；a表示在P＝0.001水平下，12孔组培板列A中各处理的卵孵化率与列B中各处理的卵孵化率间相关性分析。
结果表明，本发明所述假格里尼翁苍白杆菌NC1发酵液和发酵滤液的原液和5倍稀释液处理的南方根结线虫卵孵化率均显著低于对照组，同时可以影响12孔组培板列B中南方根结线虫的卵粒孵化率；而各浓度的NC1菌体悬液对南方根结线虫卵孵化率和对照组间无显著性差异；发酵滤液经60℃和100℃处理30min后，并没有失去对南方根结线虫卵孵化的抑制效果；相关性分析结果表明，12孔组培板列A和列B间各处理的卵孵化率呈极显著相关，说明列A中各处理对列B各处理中的卵粒孵化有极显著影响；综合以上现象说明，本发明所述的假格里尼翁苍白杆菌NC1菌体本身对南方根结线虫卵粒孵化没有影响，而更可能是通过其发酵液中一些具有挥发性的杀线虫活性物质抑制卵粒孵化。
2)假格里尼翁苍白杆菌(O.pseudogrignonense)NC1对南方根结线虫(M.incognita)二龄幼虫活性的影响
试验处理与上述步骤3中1)相同，将1mL各处理液体分别加入12孔组培板A列的3个孔内，同时向B列加入1mL ddH2O。向每孔接种50μl上述制备的南方根结线虫二龄幼虫悬液(200条二龄幼虫/50μl)，12孔组培板放于25℃培养箱中，48h后观察并记录各处理中南方根结线虫二龄幼虫活性，计算二龄幼虫死亡率和校正死亡率，结果如表2所示。
线虫死亡率(％)＝死亡二龄幼虫数量/二龄幼虫总接数量×100％
二龄幼虫校正死亡率(％)＝(处理组线虫死亡数量-对照组线虫死亡数量)/(1-对照组线虫死亡数量)×100％
表2本发明假格里尼翁苍白杆菌NC1对南方根结线虫二龄幼虫死亡率的影响
采用统计学软件SPSS 19.0对不同处理中二龄幼虫死亡率进行单因素方差分析，a-d表示P＝0.05水平下各处理间差异显著性，a-d从大到小排列，处理间差异不显著的先以a表示，直至某一个处理与之达到显著性差异则标b，以此类推；a表示在P＝0.001水平下，12孔组培板列A中各处理的二龄幼虫致死率与列B中各处理的二龄幼虫致死率间相关性分析。
结果表明，本发明所述的假格里尼翁苍白杆菌NC1发酵液和发酵滤液对南方根结线虫二龄幼虫的致死率均显著高于对照组，同时可以影响12孔板列B中南方根结线虫二龄幼虫的活性；而各浓度的NC1菌体悬液对南方根结线虫二龄幼虫的活性与对照组无显著性差异；发酵滤液经60℃和100℃处理30min后，发酵滤液对南方根结线虫二龄幼虫的致死率仍显著性高于对照组；相关性分析结果表明，12孔组培板列A和列B间二龄幼虫的致死率呈极显著相关，说明12孔组培板列A各处理对列B各处理中的二龄幼虫活性有极显著影响；综合以上现象说明，本发明所述的假格里尼翁苍白杆菌NC1菌体本身对南方根结线虫二龄幼虫的活性没有影响，而更可能是通过其发酵液中产生一些具有挥发性的杀线虫活性物质影响二龄幼虫活性。
实施例三、假格里尼翁苍白杆菌(O.pseudogrignonense)NC1生防微生物菌剂对南方根结线虫(M.incognita)的防效评价
1、本实施例中所用的假格里尼翁苍白杆菌NC1生防微生物菌剂的制备
(A)将假格里尼翁苍白杆菌NC1进行发酵培养，培养基配方及发酵条件同实施例二中步骤2。
将培养物离心获得浓缩发酵液，离心的转速为5000rpm/min，离心时间20min。
(B)向所述浓缩发酵液中添加0.5-1％的海藻酸钠(W/V)和 0.5-1％(W/V)的壳聚糖；
(C)将菌液与草炭土和膨润土的混合载体充分混匀，草炭土和膨润土的质量比为9-9.5:0.5-1，获得固形物；菌液与所述草炭土和膨润土的混合载体的重量比为1:2.5；
(D)当固形物风干至含水量为15-25％时，进行造粒，获得生防微生物菌剂。
2、本实施例制备的假格里尼翁苍白杆菌NC1微生物菌剂对番茄根结线虫的防治
盆栽试验用土采自北京市密云县季庄村某温室(土壤全氮含量2.84g/kg，有效磷含量459mg/kg，速效钾含量199mg/kg，有机质含量39.1g/kg，pH 7.2)，土壤过10目(2mm)网筛，水分调至15％左右，121℃灭菌1h后备用。盆栽防效试验共设置四个处理：处理一：假格里尼翁苍白杆菌NC1生防微生物菌剂(2.3×108CFU/g)，施用量为3g/500g土壤；2)处理二：含芽孢杆菌(Bacillus sp.)和放线菌(Streptomyces sp.)共5.0×108CFU/g的防线虫菌剂(微生物菌剂对照)，施用量为1g/500g土壤(推荐用量4kg/亩)；3)处理三：10％噻唑膦(日本石原产业株式会社，杀线剂对照)，施用量为0.25g/500g土壤(推荐用量2kg/亩)；4)处理四：未处理对照，每处理设置四个重复。将各处理菌(药)剂按施用量与土壤充分混匀后，装入直径12cm的塑料花盆中(500g/盆)，将培育40d的“中杂106”番茄苗(番茄种子购于中国农业科学院蔬菜花卉研究所)移栽入花盆中，一周后向各处理的番茄苗根际接种南方根结线虫卵悬液(5000卵/盆)，接种后60d，调查各处理番茄地上部鲜重，同时计算病情指数和防控效果。
番茄根结级数分为10级(Bridge J and Page S L J.Estimation of root-knot nematode infestation levels on root using a rating chart.Tropical pest management,1980,26:296-298)，根据各处理番茄根结级数计算病情指数和防控效果。
实施例试验结果如表3所示，施用本发明所述的假格里尼翁苍白杆菌NC1生防微生物菌剂可以显著增加番茄地上部鲜重，同时对南 方根结线虫的防效达62.5％，与杀线剂10％噻唑膦效果相当，防效优于杀线微生物菌剂对照。
表3本发明假格里尼翁苍白杆菌NC1微生物菌剂对番茄根结线虫的防治效果
采用统计学软件SPSS 19.0对不同处理中番茄地上部鲜重进行单因素方差分析，a-b表示P＝0.05水平下各处理间差异显著性，a-b从大到小排列，处理间差异不显著的先以a表示，直至某一个处理与之达到显著性差异则标b，以此类推。
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。